一種鄰苯二甲酸丁酯的表面等離子體共振快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于輕紡消費(fèi)品有毒有害殘留量檢測(cè)領(lǐng)域，涉及采用表面等離子體共振(SPR)技術(shù)，尤其涉及一種通過檢測(cè)樣品萃取液中鄰苯二甲酸丁酯(DBP)抗體的余量來檢測(cè)萃取液中DBP含量的一種表面等離子體共振快速檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鄰苯二甲酸丁酯(DBP)是一種運(yùn)用廣泛的鄰苯二甲酸酯類增塑劑。在紡織服裝和玩具等輕紡消費(fèi)品中，鄰苯二甲酸酯類增塑劑主要用于在聚氯乙烯(PVC)、人造革、涂層、油墨印花和熱壓貼花產(chǎn)品中，可以有效降低染料粘度，提高涂層彈性。鄰苯二甲酸酯在紡織印染助劑中也可用作復(fù)配組分，因?yàn)樗呛ズ捅江h(huán)結(jié)構(gòu)的非離子化合物，所以親聚酯纖維，從而通過緩染而達(dá)到分散染料染色時(shí)的勻染作用，是勻染劑的組分之一，也可作為染色載體，具有增塑作用。
[0003]出口消費(fèi)品(紡織服裝和玩具)的不斷召回和中國臺(tái)灣食品行業(yè)爆發(fā)的“起云劑”事件，再次將鄰苯二甲酸酯帶入大眾視野，引起社會(huì)的巨大關(guān)注?？茖W(xué)研究表明鄰苯二甲酸酯類(PAEs)是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有雌激素效應(yīng)，它進(jìn)入人體后與相應(yīng)的激素受體結(jié)合，干擾體內(nèi)激素正常水平，從而影響生殖、發(fā)育。對(duì)男性兒童的影響尤為嚴(yán)重。為了降低PAEs對(duì)人體的危害風(fēng)險(xiǎn)，歐盟、美國、加拿大、巴西等國家和地區(qū)均已出臺(tái)有關(guān)法律法規(guī)，對(duì)其使用做出了明確的限量要求。目前，國內(nèi)外對(duì)于鄰苯二甲酸酯包括DBP的檢測(cè)方法的研究，主要利用氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用儀、液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)等作為分析手段。因此，建立靈敏、快捷的DBP的SPR檢測(cè)方法，對(duì)于探索SPR技術(shù)在消費(fèi)品殘留量檢測(cè)中的新應(yīng)用有重要的實(shí)踐意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短、工作效率高的鄰苯二甲酸丁酯的表面等離子體共振快速檢測(cè)方法。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種鄰苯二甲酸丁酯的表面等離子體共振快速檢測(cè)方法，其特征在于:在金芯片的金膜表面修飾上鄰苯二甲酸丁酯DBP單克隆抗體，將修飾后的金芯片置于表面等離子體共振SPR檢測(cè)儀中，使目標(biāo)物DBP和高分子競(jìng)爭(zhēng)物DBP的牛血清白蛋白DBP-BSA的混合液以流動(dòng)相流過金膜，則目標(biāo)物DBP與高分子競(jìng)爭(zhēng)物DBP-BSA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到金膜表面的抗體上；通過SPR檢測(cè)儀檢測(cè)金芯片表面光長的變化；當(dāng)高分子競(jìng)爭(zhēng)物DBP-BSA濃度一定時(shí)，目標(biāo)物DBP濃度越低，SPR檢測(cè)儀檢測(cè)到的信號(hào)越高；目標(biāo)物DBP濃度越高，SPR檢測(cè)儀檢測(cè)到的信號(hào)越低；因此，目標(biāo)物DBP濃度與SPR檢測(cè)儀檢測(cè)到的信號(hào)呈反比關(guān)系，從而間接測(cè)定金芯片表面DBP含量。
[0006]優(yōu)選地，具體步驟如下:
[0007]步驟1:傳感金芯片的修飾
[0008]1.1清洗:將氨水、過氧化氫及去離子水配成溶液，水浴加熱至溶液冒氣泡，將金芯片放置在此溶液中浸泡，然后取出后立即用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈山鹦酒砻妫?br>[0009]1.2自組裝雙功能分子:清洗好的金芯片用11-巰基十一烷酸乙醇溶液浸沒，浸泡過夜；通過Au-S鍵共價(jià)連接自組裝雙功能分子；將浸泡過夜的金芯片用滅菌水清洗，用N2吹干；
[0010]1.3雙功能分子活化:在金芯片表面先滴加EDC溶液，再滴加NHS溶液，室溫靜置；
[0011]1.4修飾單抗:將金芯片水洗吹干，在金芯片表面滴加DBP單克隆抗體溶液，置于十旦溫箱中；
[0012]1.5封閉活性位點(diǎn):將金芯片取出并水洗吹干，在金芯片表面滴加乙醇胺鹽酸鹽溶液，室溫靜置；將金芯片洗凈吹干備用，或放置于PBS溶液中貯存；
[0013]步驟2:DBP標(biāo)準(zhǔn)樣品測(cè)定
[0014]2.1基線平衡:將修飾過的金芯片放入表面等離子體共振SPR檢測(cè)儀，調(diào)節(jié)儀器溫度，通入PBS溶液，調(diào)節(jié)流速，待SPR檢測(cè)儀檢測(cè)出的信號(hào)穩(wěn)定后開始實(shí)驗(yàn)；實(shí)驗(yàn)在固定角條件下進(jìn)行；
[0015]2.2競(jìng)爭(zhēng)物濃度的確定:通過定量環(huán)加載競(jìng)爭(zhēng)物標(biāo)準(zhǔn)溶液，待達(dá)到吸附/解吸附平衡后，通入PBS溶液清洗金芯片，洗去非特異性吸附樣品，通過特異性吸附樣品的量進(jìn)行目標(biāo)物分析；以共振響應(yīng)單位A RU值為縱坐標(biāo)，以加入的競(jìng)爭(zhēng)物標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線，曲線達(dá)到平衡的濃度即為合適的競(jìng)爭(zhēng)物濃度；
[0016]其中，競(jìng)爭(zhēng)物標(biāo)準(zhǔn)溶液為:稱取一定量的DBP-BSA，加入PBS溶液定容，配置系列DBP-BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為:5?70ppm ；
[0017]2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:通過定量環(huán)加載樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液，待達(dá)到吸附/解吸附平衡后，通入PBS溶液清洗金芯片；以共振響應(yīng)單位ARU值為縱坐標(biāo)，以加入的樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液中DBP的濃度為橫坐標(biāo)繪制曲線；
[0018]其中樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液為:步驟2.2中所述合適的競(jìng)爭(zhēng)物濃度的DBP-BSA與x ppm的DBP 混合溶液(X = 5n，n e [0,9])；
[0019]2.4樣品測(cè)試:按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)試樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液，根據(jù)其ARU值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出DBP含量；
[0020]2.5芯片再生:檢測(cè)完樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液，通入甘氨酸-鹽酸再生液進(jìn)行金芯片再生；最后，通入PBS溶液清洗金芯片。
[0021 ] 優(yōu)選地，所述步驟1.2中，11-巰基十一烷酸乙醇溶液濃度為lmmol/L，溫度為4°C。
[0022]優(yōu)選地，所述步驟1.3中，EDC溶液和NHS溶液均為150 μ L ;室溫靜置時(shí)間為lh。
[0023]優(yōu)選地，所述步驟1.4中，DBP單克隆抗體溶液為200 μ L ;置于37 °C恒溫箱中3h。
[0024]優(yōu)選地，所述步驟1.5中，乙醇胺鹽酸鹽溶液為200 μ L、lmol/L,室溫靜置時(shí)間為lh ;PBS 溶液為 4°C ο
[0025]優(yōu)選地，所述步驟2.1中，調(diào)節(jié)儀器溫度使其低于室溫1?2°C，調(diào)節(jié)PBS溶液流速為 30 μL/min。
[0026]優(yōu)選地，所述步驟2.5中，通入pH = 2.2的甘氨酸-鹽酸再生液6min進(jìn)行芯片再生。
[0027]優(yōu)選地，所述DBP-BSA為DBP偶聯(lián)蛋白；
[0028]所述EDC溶液為0.4mol/L的1_(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽溶液；
[0029]所述NHS溶液為0.lmol/L的N_羥基琥珀酰亞胺溶液；
[0030]所述PBS溶液為pH = 7.4的磷酸鹽緩沖液。
[0031]相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0032]1、采用間接SPR檢測(cè)方法測(cè)定DBP的含量，通過修飾DBP單抗，檢測(cè)樣品溶液中剩余DBP-BSA高分子競(jìng)爭(zhēng)物的含量來間接測(cè)定DBP的濃度，有效提高了靈敏度；檢測(cè)時(shí)間短，一般15min內(nèi)即可檢測(cè)出結(jié)果，樣品用量少；
[0033]2、通過SPR儀記錄，減少了人為判斷的主觀性，芯片可實(shí)現(xiàn)批量修飾，工作效率尚ο
【具體實(shí)施方式】
[0034]為使本發(fā)明更明顯易懂，茲以一優(yōu)選實(shí)施例，作詳細(xì)說明如下。
[0035]本發(fā)明提供了一種鄰苯二甲酸丁酯的表面等離子體共振快速檢測(cè)方法，利用帶有表面等離子體共振傳感器的SPR檢測(cè)儀，以檢測(cè)固定角光強(qiáng)的變化，間接測(cè)定樣品中DBP的含量。主要技術(shù)方案是:在金膜表面修飾上DBP單克隆抗體(DBP-6C6)，流過金膜的流動(dòng)相是目標(biāo)物DBP和高分子競(jìng)爭(zhēng)物DBP的牛血清白蛋白(DBP-BSA)的混合液。目標(biāo)物DBP與加入的高分子競(jìng)爭(zhēng)物DBP-BSA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到芯片表面的抗體上，當(dāng)高分子競(jìng)爭(zhēng)物DBP-BSA濃度一定時(shí)，目標(biāo)物DBP濃度越低，信號(hào)越高；DBP濃度越高，信號(hào)越低。因此，目標(biāo)物DBP濃度與信號(hào)呈一定的反比關(guān)系。通過SPR檢測(cè)儀檢測(cè)溶液中未被結(jié)合的DBP-BSA，從而間接測(cè)定待測(cè)樣品中DBP含量。具體操作步驟如下:
[0036]步驟1:傳感芯片的修飾
[0037]1.1清洗:1份30%的氨水(ΝΗ40Η)和1份30%的過氧化氫(H202)，加入5份的去離子水，水浴加熱至溶液輕微冒氣泡，此時(shí)溫度約80?90°C。將金芯片放置在此溶液中浸泡10分鐘，取出后立即用去離子水沖洗，再用氮?dú)獯蹈尚酒砻?，并盡快開始實(shí)驗(yàn)。當(dāng)使用全新金芯片，可簡化為:用去離子水對(duì)芯片表面進(jìn)行清洗，后再用氮?dú)獯蹈杉纯伞?br>[0038]1.2自組裝雙功能分子:清洗好的金片用lmmol/L的11-巰基^^一烷酸(MUA)乙醇溶液浸沒，4°C浸泡過夜。通過Au-S鍵共價(jià)連接自組裝雙功能分子。將浸泡過夜的芯片用滅菌水清洗，用N2吹干。
[0039]1.3雙功能分子活化:在芯片表面先滴加1