陽性率為2% ;再對陽性孔抗體用雙篩選ELISA法（包被基質(zhì)蛋白和pET32a 蛋白）進(jìn)行第二次的篩選，選出陽性和特異性最強(qiáng)的孔用有限稀釋法進(jìn)行4次亞克隆，經(jīng)檢 測和篩選最終獲得能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞3株，分別命名為2-D2、4-Hl與9-G4,分 泌的單克隆抗體分別為2D2、4H1與9G4。
[0130] (7)腹水的制備：采用體內(nèi)誘生腹水法制備。具體操作如下：
[0131] 小鼠預(yù)處理：在接種分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞前2周，先給10周齡以上雌 性SPF級BALB/c鼠腹腔注射弗氏不完全佐劑，每只0. 5mL ;接種雜交瘤細(xì)胞：將培養(yǎng)的雜 交瘤細(xì)胞吹打下來，l〇〇〇r/min離心5min，棄上清，用生理鹽水將雜交瘤細(xì)胞離心3次后將 其懸浮混勻，并調(diào)細(xì)胞濃度至I X IO6個/mL，每只小鼠經(jīng)腹腔注射0. 5rnL ;采集腹水：接種 后觀察小鼠狀態(tài)，當(dāng)小鼠腹部明顯膨大，行動不便時，用碘酒棉球消毒下腹部皮膚后，用5mL 注射器針頭刺入腹腔，抽取腹水，可視小鼠腹腔膨脹情況重復(fù)抽取，直到小鼠死亡。將腹水 3000r/min離心10min，棄掉細(xì)胞，除去脂肪組織。上清分裝，-80°C保存或進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。
[0132] 5、單抗生物學(xué)特性鑒定
[0133] (1)單抗效價的測定：采用間接ELISA方法測定。用純化的G3重組蛋白包被酶標(biāo) 板，將腹水從1:100倍開始做倍比稀釋，同時以陰性腹水做同等稀釋度作為對照，以平行稀 釋的單抗0D45Qnm+0D63(lm/對照0D45Qmi+0D 63Qmite值大于2的最高稀釋倍數(shù)為單抗的效價。
[0134] 用純化的G3重組蛋白包被酶標(biāo)板進(jìn)行間接ELISA試驗，測定3株單抗腹水的抗體 效價，以平行稀釋的單抗0D45tol+0D63(lm/對照OWOD63tlmi比值大于2的最高稀釋倍數(shù)為單 抗的效價，結(jié)果見圖12A，三株單抗的腹水效價均超過105。
[0135] (2)單抗亞型的鑒定：按 Hycult biotechnology 公司的 Mouse mab Isotyping Test KitQOassay kit)的說明書進(jìn)行：將細(xì)胞上清用pH 7. 4PBS適當(dāng)稀釋至抗體濃度 50 μ g/mL備用；加500 μ L buffer至含一條κ型試紙條的檢測管中；再加500 μ L稀釋 好的樣品至檢測管中；將試紙條完全浸入并輕輕攪動；輕搖瓶子混勻兔抗鼠 κ鏈膠粒，加 入ImL至檢測管中，并使打印面朝下；在25°C環(huán)境中振蕩30min左右可見2個斑點(diǎn)出現(xiàn) (一個在亞類區(qū)，另一個在κ區(qū)），試紙條在振蕩過程中始終保持浸在溶液中。用Hycult biotechnology公司的Mouse mab Isotyping Test Kit對單抗的亞型進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明 單抗亞型為IgGl，輕鏈為κ鏈（圖12B)。
[0136] (3)雜交瘤細(xì)胞株分泌單抗的穩(wěn)定性測定：分別收集體外連續(xù)傳代30代以上的雜 交瘤細(xì)胞株上清，用間接ELISA方法測定3株雜交瘤細(xì)胞株的效價，然后再檢測凍存3個月 后經(jīng)復(fù)蘇、傳代的細(xì)胞株，檢測培養(yǎng)上清液中的抗體效價，與凍存前的效價比較，以評價其 分泌抗體的穩(wěn)定性。結(jié)果表明獲得的雜交瘤細(xì)胞株在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)和凍存后仍保持穩(wěn) 定的抗體分泌能力（表7)。
[0137] 表7雜交瘤細(xì)胞株分泌單克隆抗體的穩(wěn)定性分析。
[0138]
[0139] 6、單抗特異性鑒定
[0140] (1)單抗的特異性與交叉性ELISA檢測
[0141] 采用間接ELISA方法測定單克隆抗體的特異性，用純化的G3重組蛋白和狂犬病病 毒HEP-Fluryd :1000倍稀釋）分別包被酶標(biāo)板，將單抗腹水作一定倍數(shù)稀釋，同時設(shè)立陰 性和空白對照；采用間接ELISA方法測定單克隆抗體與六聯(lián)苗（包括犬細(xì)小病毒、犬副流感 病毒、犬瘟熱病毒、犬傳染性肝炎病毒、犬腺病毒I/II型和犬鉤端螺旋體）的交叉反應(yīng)。用 六聯(lián)苗作為包被抗原，分別與單抗腹水作用，設(shè)立犬細(xì)小病毒陽性對照和陰性腹水對照。
[0142] 檢測結(jié)果如表8所示，表明3株單抗均能與糖蛋白和狂犬病病毒反應(yīng)，而不與基質(zhì) 蛋白、pET32a(+)蛋白和犬六聯(lián)苗（包括犬細(xì)小病毒、犬副流感病毒、犬瘟熱病毒、犬傳染性 肝炎病毒、犬腺病毒I/II型和犬鉤端螺旋體）反應(yīng)，具有很好的特異性，并且無交叉性反 應(yīng)。
[0143] 表8抗G蛋白單克隆抗體特異性與交叉性ELISA檢測分析。
[0144]
[0145] (2) Western-blotting 鑒定單抗
[0146] 按照實(shí)施例3的方法進(jìn)行SDS-PAGE，然后將狂犬病病毒蛋白質(zhì)與純化的G3重組蛋 白按實(shí)施例3的方法從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，然后進(jìn)行以下操作：
[0147] 封閉：電轉(zhuǎn)完畢后，將PVDF膜作好標(biāo)記，放入大小適當(dāng)?shù)牟Ａ矫笾?，?%脫脂 奶粉-TBS 12°C封閉過夜；以TBS洗滌3次，每次IOmin ;加一抗：將一定倍數(shù)稀釋的單抗腹 水加入1 %脫脂奶粉-TBS中，加入量以完全覆蓋膜為準(zhǔn)并盡量排出氣泡，37°C搖床孵育8h ; 同上洗滌；加二抗：將辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠 IgG(l :500稀釋）加入1%脫脂奶粉-TBS 中，緩慢振搖過夜；同上洗滌；顯色：稱取IOmg DAB溶于20mL TBS中，過濾后加入20 μ L濃 度為30%的H2O2，將PVDF膜置于顯色液中顯色，待出現(xiàn)特異的反應(yīng)條帶后，立即浸入雙蒸水 中洗膜終止反應(yīng)。用吸水紙吸干膜上水分，避光干燥保存。
[0148] 應(yīng)用Western-blotting試驗測定了單抗腹水2D2、4H1與9G4的特異性反應(yīng)分別 以3株單抗為一抗，結(jié)果均在39KDa處產(chǎn)生了一條特異性反應(yīng)帶（圖13A)，表明3株單抗 均能與純化的G3重組蛋白結(jié)合，是針對G3重組蛋白的單抗；分別以3株單抗為一抗，結(jié)果 均在67KDa處產(chǎn)生了一條特異性反應(yīng)帶（圖13B)，表明3株單抗均能與RV結(jié)合，是針對RV 糖蛋白的單抗。
[0149] (3)間接免疫熒光試驗鑒定單抗
[0150] 病毒吸附：將狂犬病病毒HEP-Fluryd : 10倍稀釋）接種于長滿單層BHK-21細(xì)胞 的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的前三排，后一排不接毒，在37°C培養(yǎng)箱中吸附3d ;丙酮固定：盡可 能地傾去全部細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加500 μ L預(yù)冷的80%丙酮，Is后快速傾去80%丙酮，其后 再次加500 yL預(yù)冷的80%丙酮，鋁箔紙包住培養(yǎng)板，室溫固定lh，棄去80%丙酮，將24孔 板細(xì)胞培養(yǎng)板晾干，數(shù)周內(nèi)可置于4°C保存?zhèn)溆?；洗滌：用PBS洗滌丙酮固定好的24孔細(xì) 胞病毒板一遍，每孔ImL洗滌液，甩干；加入一抗：加入單抗腹水、陰性腹水和骨髓瘤細(xì)胞上 清，200 μ L/孔，37°C濕盒中作用60min，同時設(shè)立細(xì)胞對照；洗滌：甩凈抗體，用PBS洗滌3 次，甩干；加入二抗：加入FITC標(biāo)記羊抗鼠 IgG二抗（1:50倍稀釋）50 μ L，37°C閉光作用 45min ;洗滌：甩去二抗，用PBS洗滌4次，吸水紙吸干，避光干燥IOmin ;鏡檢：熒光顯微鏡觀 察、拍照；結(jié)果判定：有綠色熒光者判為陽性，無熒光者判為陰性。
[0151] 以抗RV GP的單克隆抗體腹水2D2、4H1與9G4,檢測RV感染的BHK-21細(xì)胞顯示強(qiáng) 陽性熒光信號，而陰性和空白對照則熒光信號陰性（圖14)。結(jié)果表明抗RV G蛋白單抗能 識別BHK-21細(xì)胞中G蛋白抗原，應(yīng)用于IFA檢測具有良好的敏感性和特異性。
【主權(quán)項】
1. 一種通過基因片段進(jìn)行密碼子修飾的狂犬病病毒的G蛋白基因G3,其特征在于，其 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. -種經(jīng)修飾的狂犬病病毒的G蛋白，其特征在于，由權(quán)利要求1所述修飾的狂犬病病 毒的G蛋白基因G3表達(dá)得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。3. -種表達(dá)載體，其特征在于，該載體含有權(quán)利要求1所述修飾的狂犬病病毒的G蛋白 基因G3。4.由權(quán)利要求3所述表達(dá)載體表達(dá)達(dá)到的狂犬病病毒G蛋白在制備抗狂犬病病毒G蛋 白的單克隆抗體中的應(yīng)用。5. -種抗狂犬病病毒G蛋白的抗體，其特征在于，采用的免疫原是以權(quán)利要求3所述表 達(dá)載體表達(dá)達(dá)到的狂犬病病毒G蛋白。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述抗體，其特征在于，所述狂犬病病毒為狂犬病病毒HEP-Flury 株。7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述抗體，其特征在于，所述抗體為單克隆抗體。8. -種不以疾病診斷為目的的檢測狂犬病病毒的間接ELISA方法，其特征在于，所用 抗體為權(quán)利要求5所述抗體。9. 一種不以疾病診斷為目的的檢測狂犬病病毒的Western-blotting檢測方法，其特 征在于，所用抗體為權(quán)利要求5所述抗體。10. -種不以疾病診斷為目的的檢測狂犬病病毒的間接免疫熒光檢測方法，其特征在 于，所用抗體為權(quán)利要求5所述抗體。
【專利摘要】本發(fā)明公開了經(jīng)修飾的狂犬病病毒的G蛋白基因G3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；該G蛋白基因G3表達(dá)得到的經(jīng)修飾的狂犬病病毒的G蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述狂犬病病毒為狂犬病病毒（rabies virus，RV）HEP-Flury株。利用上述修飾的狂犬病病毒HEP-Flury株G蛋白基因G3構(gòu)建重組質(zhì)粒載體，進(jìn)行表達(dá)以及單克隆抗體的制備，該單克隆抗體能特異性識別狂犬病病毒糖蛋白和狂犬病病毒，可以應(yīng)用于間接ELISA方法、Western-blotting試驗和間接免疫熒光試驗，用于檢測狂犬病病毒，具有良好的敏感性和特異性。
【IPC分類】G01N33/569, C12N15/47, C12N15/70, C07K14/145, C07K16/10, G01N33/577
【公開號】CN104928302
【申請?zhí)枴緾N201510267858
【發(fā)明人】郭霄峰, 張戴婷, 鄭佳琳, 陽佑天, 王怡飛
【申請人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年5月22日