一株通過(guò)基因修飾以?xún)?yōu)化表達(dá)后的狂犬病病毒糖蛋白及其單克隆抗體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一株通過(guò)基因修飾以?xún)?yōu)化表 達(dá)后的狂犬病病毒糖蛋白及其單克隆抗體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 狂犬病是由狂犬病病毒（rabies virus，RV)引起的人獸共患的烈性傳染病，一旦 發(fā)病難以醫(yī)治。準(zhǔn)確、及時(shí)、快速的診斷是臨床治療的前提，也是免疫監(jiān)測(cè)、流行病學(xué)調(diào)查的 主要手段，還是有效控制狂犬病的關(guān)鍵?？袢〔《镜奶堑鞍祝╣lycoprotein，GP)，即G蛋 白，是狂犬病病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，與病毒的感染和免疫有密切關(guān)系，是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和 抗體的主要蛋白，其免疫作用與全病毒疫苗基本相當(dāng)。GP由524個(gè)氨基酸組成，前19個(gè)氨 基酸構(gòu)成疏水性信號(hào)肽，其膜外區(qū)的保守性高，且抗原表位主要集中在膜外區(qū)，是制備檢測(cè) 抗體的首選抗原。
[0003] G蛋白的表達(dá)純化是抗體制備的前提，合理的基因修飾可以實(shí)現(xiàn)蛋白的高效表達(dá)。 但是對(duì)于不同的基因、不同物種來(lái)源的同源基因（基因的序列和性質(zhì)等具有差別），如何修 飾基因，確定修飾位點(diǎn)及修飾數(shù)量，致使其與表達(dá)菌的偏嗜性匹配，以提高蛋白的表達(dá)量； 表達(dá)過(guò)程中怎樣進(jìn)行培養(yǎng)、怎樣保證獲得蛋白表達(dá)需要的溶解氧、怎么樣避免污染、加甲醇 誘導(dǎo)的量以及時(shí)間、對(duì)蛋白表達(dá)時(shí)間的控制即蛋白收獲時(shí)間、無(wú)菌檢驗(yàn)的方法、蛋白含量以 及活性的測(cè)定等均有較大的差異，需要形成一個(gè)穩(wěn)定的、完整的技術(shù)方案，才能從根本上解 決G蛋白的高效表達(dá)和成本問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有狂犬病病毒G蛋白表達(dá)技術(shù)的不足，提供一 種經(jīng)修飾的狂犬病病毒的G蛋白基因 G3,利用該修飾的狂犬病病毒HEP-Flury株G蛋白基 因 G3構(gòu)建重組質(zhì)粒載體，進(jìn)行表達(dá)以及單克隆抗體的制備，該單克隆抗體能特異性識(shí)別狂 犬病病毒糖蛋白和狂犬病病毒，可以應(yīng)用于間接ELISA方法、Western-blotting試驗(yàn)和間 接免疫熒光試驗(yàn)，用于檢測(cè)狂犬病病毒，具有良好的敏感性和特異性。
[0005] 本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0006] -種通過(guò)基因片段進(jìn)行密碼子修飾的狂犬病病毒的G蛋白基因 G3,其核苷酸序列 如SEQ ID NO. 1所示（修飾前的狂犬病病毒的G蛋白基因 G3的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3 所示）。
[0007] -種經(jīng)修飾的狂犬病病毒的G蛋白，由上述修飾的狂犬病病毒的G蛋白基因 G3表 達(dá)得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0008] -種表達(dá)載體，該載體含有上述經(jīng)修飾的狂犬病病毒的G蛋白基因 G3片段。
[0009] 由上述表達(dá)載體表達(dá)達(dá)到的狂犬病病毒G蛋白在制備抗狂犬病病毒G蛋白的單克 隆抗體中的應(yīng)用也應(yīng)在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0010] 一種抗狂犬病病毒G蛋白的抗體，采用的免疫原是以上述表達(dá)載體表達(dá)達(dá)到的狂 犬病病毒G蛋白，即修飾后的狂犬病病毒HEP-Flury株G蛋白中一段經(jīng)分析挑選得到的抗 原表位富集區(qū)。
[0011] 具體地，所述狂犬病病毒為狂犬病病毒HEP-Flury株。另外優(yōu)選地，所述抗體為單 克隆抗體。
[0012] 一種不以疾病診斷為目的的檢測(cè)狂犬病病毒的間接ELISA方法，所用抗體是以經(jīng) 修飾的狂犬病病毒的基質(zhì)蛋白為抗原制備得到的抗體。
[0013] 一種不以疾病診斷為目的的檢測(cè)狂犬病病毒的Western-blotting檢測(cè)方法，所 用抗體是以經(jīng)修飾的狂犬病病毒的基質(zhì)蛋白為抗原制備得到的抗體。
[0014] 一種不以疾病診斷為目的的檢測(cè)狂犬病病毒的間接免疫熒光檢測(cè)方法，所用抗體 是以經(jīng)修飾的狂犬病病毒的基質(zhì)蛋白為抗原制備得到的抗體。
[0015] 本發(fā)明首先對(duì)狂犬病病毒H印-flury株G蛋白基因進(jìn)行了合理的修飾改造，然后 構(gòu)建了含有經(jīng)修飾優(yōu)化的狂犬病病毒H印-fIury株G蛋白基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32-G3， 在大腸桿菌中表達(dá)G3重組蛋白，并以此為基礎(chǔ)制備G3單克隆抗體，為G3單克隆抗體在間 接ELISA方法、Western-blotting試驗(yàn)和間接免疫熒光試驗(yàn)檢測(cè)狂犬病病毒的應(yīng)用創(chuàng)造條 件。
[0016] 本發(fā)明利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)出了 G3重組蛋白，表達(dá)產(chǎn)物的相對(duì)分子 質(zhì)量為39kDa，與理論計(jì)算值一致；重組蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件：在28°C的條件下，以 1.0 mmol/L的IPTG終濃度，誘導(dǎo)4h。
[0017] 本發(fā)明G3基因的獲得是運(yùn)用生物學(xué)信息軟件對(duì)狂犬病病毒HEP-Flury株糖蛋白 膜外區(qū)序列進(jìn)行分析，選擇抗原表位優(yōu)勢(shì)區(qū)段100~307為氨基酸，依照大腸桿菌密碼子 偏嗜性，對(duì)其氨基酸密碼子進(jìn)行修飾，于5'端和3'端分別引入BamHI及Hind III酶切位 點(diǎn)，繼而PCR擴(kuò)增，構(gòu)建克隆載體pMD18T-Simple-G3,再與pET-32a(+)表達(dá)載體的BamHI、 Hind III雙酶切反應(yīng)，回收產(chǎn)物并且連接成功構(gòu)建PET32-G3重組表達(dá)載體，重組質(zhì)粒DNA序 列測(cè)定結(jié)果證實(shí)了含有目的基因。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到的陽(yáng) 性重組子鑒定正確后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)后，離心 收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析。當(dāng)基因進(jìn)行表達(dá)后，表達(dá)產(chǎn)物為融合有His標(biāo)簽的G融合蛋 白，融合蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量39kDa。
[0018] 本發(fā)明用純化的His標(biāo)簽-G3融合蛋白作為抗原，既增加了抗原的免疫原性，又方 便篩選。發(fā)明中采用純化His標(biāo)簽-G3融合蛋白作為包被抗原進(jìn)行篩選，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì) 照，以免疫小鼠的血清為陽(yáng)性對(duì)照，以正常小鼠的血清為陰性對(duì)照，間接ELISA反應(yīng)條件的 確立是經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)優(yōu)化的結(jié)果。此外，在單抗的篩選過(guò)程中，始終選用空載體pET32a(+) 菌體蛋白與pET32a-M蛋白作為對(duì)照抗原，避免了用同種免疫原檢測(cè)時(shí)假陽(yáng)性的出現(xiàn)，充 分保證能夠得到目的雜交瘤細(xì)胞；而且在篩選方法上，也應(yīng)用了不同的選擇系統(tǒng)，以間接 ELISA為主，用Western-blotting與IFA確認(rèn)，從而確保了單克隆抗體的反應(yīng)特異性。由于 篩選出的上清液為陽(yáng)性的生長(zhǎng)孔內(nèi)常會(huì)有兩個(gè)以上的雜交瘤細(xì)胞集落，有的集落可能不分 泌抗體，或分泌的不是所需抗體，所以，要利用克隆培養(yǎng)方法及時(shí)將其分開(kāi)。本發(fā)明中，采用 了有限稀釋法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆培養(yǎng)。
[0019] 本發(fā)明以純化的His標(biāo)簽-G3融合蛋白為抗原，免疫BALB/c小鼠，采用雜交瘤 技術(shù)制備抗狂犬病病毒糖蛋白的單克隆抗體，獲得3株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株： 2-D2、4-Hl與9-G4,并成功制得腹水，測(cè)定腹水效價(jià)均在1:105以上?？贵w亞型鑒定結(jié)果顯 示，單抗亞型為IgGL且輕鏈為κ鏈。雜交瘤細(xì)胞株連續(xù)培養(yǎng)30代以及凍存3個(gè)月后復(fù) 蘇，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體效價(jià)穩(wěn)定。經(jīng)ELISA、Western-blotting與IFA 檢測(cè)，3株單抗具有很好的特異性。
[0020] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0021] 本發(fā)明以RV HEP-Flury株的全長(zhǎng)質(zhì)粒為模板，采用PCR方法擴(kuò)增獲得GP去除信 號(hào)肽基因的部分（Gl)與膜外區(qū)基因（G2)。選取膜外區(qū)基因中抗原表位富集區(qū)基因，對(duì)其氨 基酸密碼子進(jìn)行修飾并合成其序列（G3)。分別將G1、G2及G3基因片段亞克隆到表達(dá)載體 pET32a(+)，構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒pET32-Gl、pET32-G2及pET32-G3,轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21，并 利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE、Western_blotting和薄層掃描分析結(jié)果顯示，表達(dá)的蛋白 均具有良好的反應(yīng)原性和特異性，且通過(guò)密碼子優(yōu)化后，G3基因片段的表達(dá)量比Gl、G2基 因片段表達(dá)量明顯提高。對(duì)G3重組蛋白大量誘導(dǎo)表達(dá)，利用HisTrap FF親和層析柱對(duì)表 達(dá)的蛋白進(jìn)行純化，使用超濾離心管對(duì)純化的G3重組蛋白進(jìn)行濃縮和脫鹽，獲得高純度的 糖蛋白。
[0022] 本發(fā)明以純化的G3重組蛋白為抗原免疫BALB/c小鼠，建立間接ELISA方法測(cè)定 血清抗體效價(jià)。取血清效價(jià)最高的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在PEG 4000的 作用下進(jìn)行細(xì)胞融合。用HAT選擇培養(yǎng)基對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，利用間接ELISA法篩選 陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。采用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行亞克隆，重復(fù)4次，獲得了 3株能穩(wěn)定分泌 單克隆抗體（McAb)的雜交瘤細(xì)胞株（分別命名為2-D2、4-Hl、9-G4)。將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞注 射BALB/c小鼠制備腹水，測(cè)定腹水效價(jià)在1:105以上?？贵w亞型鑒定結(jié)果顯示，單抗亞型為 IgGl，輕鏈為κ鏈。雜交瘤細(xì)胞株連續(xù)培養(yǎng)30代以及凍存3個(gè)月后復(fù)蘇，細(xì)胞生長(zhǎng)良好，雜 交瘤細(xì)胞分泌的抗體效價(jià)穩(wěn)定。間接ELISA、間接免疫焚光試驗(yàn)（IFA)和Western-blotting 檢測(cè)結(jié)果顯示，3株單抗的腹水均能特異性識(shí)別G3重組蛋白與RV病毒，與犬六聯(lián)苗（包括 犬細(xì)小病毒、犬副流感病毒、犬瘟熱病毒、犬傳染性肝炎病毒、犬腺病毒I/II型和犬鉤端螺 旋體）無(wú)交叉反應(yīng)。
[0023] 本發(fā)明在成功表達(dá)GP的去信號(hào)肽基因和膜外區(qū)基因的基礎(chǔ)上，對(duì)G基因一段抗原 表位富集區(qū)基因的稀有密碼子序列進(jìn)行了分析和優(yōu)化，提高G基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)水 平；獲得了穩(wěn)定、特異、高效的單克隆抗體，為狂犬病及狂犬病病毒的相關(guān)研宄和應(yīng)用奠定 了良好的基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1為pET32-G3重組質(zhì)粒中G3的核苷酸和氨基酸序列。
[0025] 圖2為G3PCR產(chǎn)物凝膠電泳；M :DNA Marker DL2000 ;1 :G1基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn) 物；2 :G2基因片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3 :G3基因片段的雙酶切純化產(chǎn)物；4 :PCR陰性對(duì)照。
[0026] 圖3為pET32-G3重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
[0027] 圖4為重組質(zhì)粒pET32-G3的菌液PCR(A)和雙酶切鑒定⑶；A中，M :D