和空白對(duì)照。
[0097] (2)抗原最適包被濃度的確定
[0098] 將重組抗原用包被液分別作 1 μ g/mL、2 μ g/mL、4 μ g/mL、8 μ g/mL、16 μ g/mL、 24 4 8/!^、32以8/11^8個(gè)稀釋度，免疫小鼠血清作 1:10000、1:20000、1:40000、1:80000、1 :100000稀釋，每孔重復(fù)2次，間接ELISA法測(cè)定各孔0D45(lnm+0D63(lmi值，確定抗原最佳工作濃 度。
[0099] 不同量的純化的G3重組蛋白包被ELISA板后，與不同稀釋倍數(shù)的免疫小鼠血清感 作，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，確定最佳包被量在8 μ g/mL (表3)。
[0100] (3)待檢血清中抗E. Cloi成分的去除
[0101] 用LB培養(yǎng)BL21(DE3)表達(dá)菌，37°C培養(yǎng)7h后離心收集細(xì)菌，用pH8. OTE洗1遍， 沉淀用1/10體積的ΡΗ7. 4的PBS懸浮，以超聲波破碎細(xì)菌后，12000r/min離心10min，取上 清（簡(jiǎn)稱E. coli上清）備用。待檢血清用10% E. coli上清液稀釋，室溫感作30min，以吸 附待檢血清中的抗E. coli抗體成分，再進(jìn)行間接ELISA。同時(shí)用7份未經(jīng)E. coli上清吸附 的待檢血清做平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)并比較吸附前后的0D45(lnm+0D63(lnm值，以確定吸附效果。
[0102] 間接ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，被檢免疫小鼠血清經(jīng)E. coli裂解物上清吸附后的 OD45JOD63cimi值明顯低于吸附前的OD 45Qnm+0D63(J直，因此，E. coli裂解物上清能明顯降低被 檢血清的非特異性反應(yīng)，使假陽性明顯降低（表4)。
[0103] 表4經(jīng)E. coli上清吸附前后血清檢測(cè)結(jié)果
[0104]
[0105] (4)間接ELISA方法陰陽性臨界值的確定
[0106] 隨機(jī)取SPF級(jí)雌性BALB/c鼠陰性血清15份，按已建立的程序進(jìn)行間接ELISA測(cè) 定，讀出OD45tln^OD63cimi值，計(jì)算出15份血清的值的平均值（X)和標(biāo)準(zhǔn)方差（SD)，陰陽性臨界 值（Cut off) = X+3SD。
[0107] 隨機(jī)取SPF級(jí)雌性BALB/c鼠陰性血清15份（I :100和I :5000倍稀釋），按已建 立的程序進(jìn)行間接ELISA測(cè)定，結(jié)果如表5所示。
[0108] 表5陰性小鼠血清鑒定結(jié)果（0D45Qnm+0D63(lJ
[0109]
[0110]

[0111] 根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，樣本的 〇〇450ηηι+〇〇630ηηι 值大于陰性樣本OD 450ηιη+〇〇630ηιη 均 值X +3xSD時(shí)，可以在99. 9 %的水平上判為陽性。確定樣本稀釋度為1:100時(shí)， 0D45Qmi+0D63(lnm》0· 12,判為陽性；樣本稀釋度為I :5000時(shí)，0D45Qmi+0D63(lnm》0· 03,判為陽性 (表 6)。
[0112] 表6陰陽性臨界值OD45tlJOD630nm
[0113]
[0114]
[0115] 4、雜交瘤細(xì)胞株的建立
[0116] (l)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備
[0117] 融合前48h，將SP2/0骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)于直徑為9cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每塊加 IOmL含10%血清DMEM培養(yǎng)液，置于37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；融合當(dāng)天，選擇形態(tài)良好、 呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的SP2/0細(xì)胞，將其從瓶壁上輕輕吹下，收集于50mL離心管內(nèi)，lOOOr/min離心 5min，棄上清；用不完全DMEM培養(yǎng)液混勻細(xì)胞后計(jì)數(shù)，取所需細(xì)胞數(shù)，用不完全DMEM培養(yǎng)液 洗2次，以IOmL不完全DMEM培養(yǎng)液重新懸浮備用。
[0118] 融合后觀察每個(gè)96孔培養(yǎng)板，了解和掌握細(xì)胞生長(zhǎng)、死亡情況，以便及時(shí)進(jìn)行抗 體檢測(cè)和細(xì)胞株克隆。融合當(dāng)天（Id)可見瘤細(xì)胞透亮，形態(tài)多樣，相互之間有粘連、重疊。 融合后4d，可見形似骨髓瘤細(xì)胞，渾圓透亮，成葡萄串狀分布的融合細(xì)胞小集落克隆，周圍 聚集著許多大小不等的細(xì)胞碎片（圖11A)。融合后7d，細(xì)胞克隆繼續(xù)長(zhǎng)大，對(duì)有克隆生長(zhǎng) 的孔作上標(biāo)記，以便檢測(cè)（圖11B)。
[0119] ⑵飼養(yǎng)細(xì)胞的制備
[0120] 在融合前2d，取1只健康未免疫6周齡的雌性BALB/c小鼠，拉頸脫臼處死，將小 鼠尸體于75%酒精中浸泡消毒5min，隨即移入無菌操作臺(tái)內(nèi)，腹部朝上固定在解剖板上； 在小鼠左側(cè)腹壁剪一小口，撕開皮膚，用滅菌鑷子提起腹膜，剪開左側(cè)腹膜及肋骨，暴露脾 臟，換用另一套滅菌器械，用鑷子提起脾臟，取出脾臟置于滅菌的平皿中，用不完全DMEM培 養(yǎng)液輕輕洗3次，并剝?nèi)ブ車慕Y(jié)締組織；將脾臟移入另一滅菌平皿中，置于200目銅網(wǎng)上， 用滅菌的西林瓶底部擠壓研磨脾臟，并用不完全DMEM培養(yǎng)液輕輕沖洗銅網(wǎng)，使脾細(xì)胞全部 通過銅網(wǎng)壓擠到溶液中；將脾細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)至50mL離心管中，加不完全培養(yǎng)液至20mL，混勻； lOOOr/min離心5min，棄上清；沉淀細(xì)胞再用不完全DMEM培養(yǎng)液同法離心洗滌一次；先用 5mL HAT培養(yǎng)液將沉淀細(xì)胞懸浮并混勻，作細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，補(bǔ)加 HAT培 養(yǎng)液至30mL，使細(xì)胞濃度為2 X IO5個(gè)/mL ;將細(xì)胞懸液滴于6塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 50 μ L(相當(dāng)于1滴），然后將培養(yǎng)板置37°C、含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后觀察細(xì)胞生長(zhǎng) 狀態(tài)，細(xì)胞呈多形性，貼壁，折光性好時(shí)即可使用。
[0121] (3)免疫淋巴細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的融合
[0122] 取加強(qiáng)免疫3d后的BABL/c小鼠，摘除眼球采血；制備脾細(xì)胞懸液；將骨髓瘤細(xì)胞 與脾細(xì)胞按I :10的比例混合在一起，轉(zhuǎn)入50mL離心管內(nèi)，lOOOr/min離心10min，棄上清， 用滴管吸凈殘留液體；用滴管輕輕攪動(dòng)沉淀，使其松散均勻成糊狀；在37°C水浴中融合：一 手均勻地轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，另一手用吸管吸取PEG4000溶液lmL，并沿轉(zhuǎn)動(dòng)的管壁（盡量接近細(xì) 胞處）加入，從加入到加完的時(shí)間控制在Imin左右，邊加邊攪動(dòng)，用吸管在Imin內(nèi)加入ImL 預(yù)熱至37°C不完全DMEM培養(yǎng)液，重復(fù)3次，往后每分鐘加入3mL，直至加滿到25mL為止（注 意此時(shí)操作應(yīng)輕柔，邊轉(zhuǎn)動(dòng)邊加，盡量不攪散細(xì)胞）；37°C培養(yǎng)箱靜置lOmin，800r/min離心 lOmin，棄上清；加入IOmL HAT培養(yǎng)液，輕輕吹吸混勻；根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，按一 塊96孔培養(yǎng)板用液15mL計(jì)算補(bǔ)加 HAT培養(yǎng)液至所需的量；將融合好的細(xì)胞懸液加入含有 飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板，每孔150^1^(相當(dāng)于3滴），37°0、5%0)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0123] (4)雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)及觀察
[0124] 將融合后的細(xì)胞懸浮于HAT培養(yǎng)液中，于37°C、5% 0)2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)情 況，每5d半換液1次，第Ild改換同量的HT培養(yǎng)液，維持2周。仔細(xì)觀察融合細(xì)胞的生長(zhǎng) 情況，凡有污染的孔立即滴加1%的NaOH，以免污染擴(kuò)散，如果細(xì)胞生長(zhǎng)太慢可補(bǔ)加1次飼 養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞融合后3d內(nèi)不提倡在0)2培養(yǎng)箱外長(zhǎng)時(shí)間的觀察，因?yàn)榕囵B(yǎng)箱外溫度和CO 2濃度的不適會(huì)影響融合細(xì)胞的生長(zhǎng)。
[0125] (5)陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選
[0126] 待融合后的細(xì)胞克隆生長(zhǎng)到覆蓋細(xì)胞孔底部1/10時(shí)，用建立好的間接ELISA方法 對(duì)所有有克隆生長(zhǎng)的培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)為陽性的細(xì)胞進(jìn)行克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，選出陽 性和特異性最強(qiáng)的孔進(jìn)行克隆，并注意隨時(shí)凍存保種。篩選時(shí)，一般先用糖蛋白包被的間接 ELISA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞上清，對(duì)于陽性的細(xì)胞上清，再用基質(zhì)蛋白和pET32a(+)蛋白包 被的間接ELISA方法進(jìn)行第二次的篩選，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照（SP2/0細(xì)胞上清）和陽性對(duì)照 (融合用免疫鼠血清）。
[0127] (6)陽性雜交瘤細(xì)胞的克?。簩?duì)篩選所獲得的陽性雜交瘤細(xì)胞孔以有限稀釋法進(jìn) 行克隆，以獲取能穩(wěn)定分泌抗體的單克隆孔。具體步驟如下：
[0128] 克隆前2d，按照（2)的方法制備小鼠飼養(yǎng)細(xì)胞；將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中抗體分泌陽 性的雜交瘤細(xì)胞集落（強(qiáng)陽性孔）吹起，混勻，取適量細(xì)胞懸液至一無菌EP管中，做適當(dāng)稀 釋，將上述EP管中細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞密度；取上述細(xì)胞懸液的130個(gè)細(xì)胞加入到6. 5mL含 20%胎牛血清的HT培養(yǎng)液（初次克隆）或完全培養(yǎng)液，即20個(gè)細(xì)胞/mL，100 μ L/孔加 A、B、 C三排為每孔2個(gè)細(xì)胞，余下2. 9mL細(xì)胞懸液補(bǔ)加2. 9mL含20%胎牛血清的HT培養(yǎng)液或完 全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)為10個(gè)細(xì)胞/mL，100 μ L/孔加 D、E、F三排，為每孔1個(gè)細(xì)胞，余下2. 2mL 細(xì)胞懸液補(bǔ)加2. 2mL含20%胎牛血清的HT培養(yǎng)液或完全培養(yǎng)液，細(xì)胞數(shù)為5個(gè)細(xì)胞/mL， 100 μ L/孔加 G、H兩排，為每孔0. 5個(gè)細(xì)胞；培養(yǎng)4d，在倒置顯微鏡上可見小的細(xì)胞克隆， 補(bǔ)加含20%胎牛血清的HT培養(yǎng)液或完全培養(yǎng)液每孔100 μ L ;適時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，待 細(xì)胞集落生長(zhǎng)到孔底1/10面積時(shí)半換液，并用所換出的培養(yǎng)液上清進(jìn)行抗體檢測(cè)；選擇OD 值高、細(xì)胞活力好、只有一個(gè)細(xì)胞集落的孔再次克隆和亞克隆，同時(shí)每次將克隆剩余細(xì)胞轉(zhuǎn) 入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)（并在原孔中補(bǔ)加另一批培養(yǎng)基，以防二者同時(shí)污染或細(xì)胞死亡）， 繼而轉(zhuǎn)入6孔板和普通細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并及時(shí)凍存；經(jīng)過多次克隆操作，直至 所有克隆的細(xì)胞孔檢測(cè)陽性率為100%時(shí)，即確定已獲得分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株； 獲得穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株后，及時(shí)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。
[0129] 將純化的G3重組蛋白免疫鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓廇細(xì)胞用PEG方法進(jìn)行細(xì)胞 融合，每次培養(yǎng)6塊96孔培養(yǎng)板，其中3號(hào)鼠融合成功，接種576孔，其中456孔有雜交瘤細(xì) 胞生長(zhǎng)，融合率為79. 2 %。先采用間接ELISA法對(duì)所有有克隆生長(zhǎng)孔的抗體進(jìn)行初篩，得到 9孔陽性細(xì)胞，