NA marker DL2000 ;1-3 :pET32-G3 的菌液 PCR 產(chǎn)物；B 中，M :DNA marker DL2000 ;1-3 :分別為重組質(zhì) 粒 PET32-G3、pET32-Gl 及 pET32-G2 雙酶切產(chǎn)物。
[0028] 圖5為pET32-G3表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析；M :蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；I : 含pET32a(+)空載體的BL21表達(dá)菌；2-3分別為：經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET32-G2、pET32-Gl、 PET32-G3重組子。
[0029] 圖6為pET32-G3表達(dá)產(chǎn)物的Western-blotting分析；A為G1、G2及G3基因片段 表達(dá)的蛋白被6 XHis單克隆抗體識別，M :蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-3分別為：G1、G2及 G3基因的蛋白表達(dá)；4 :含pET32a⑴空載體的BL21表達(dá)菌；B為Gl、G2及G3基因片段表 達(dá)的蛋白被狂犬病病毒陽性血清識別，M :蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 :含pET32a(+)空載 體的BL21表達(dá)菌；2-4分別為：G3、G2及Gl基因的蛋白表達(dá)。
[0030] 圖7為不同誘導(dǎo)溫度對G3基因片段表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)量的影響；M :蛋白質(zhì)相對分 子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-3 :pET32-Gl重組子在16°C、28°C和37°C下1.0 mmo/L IPTG誘導(dǎo)4h表達(dá)量； 4-6 :pET32-G2 重組子在 16°C、28°C和 37°C下 1.0 mmo/L IPTG誘導(dǎo) 4h表達(dá)量；7-9 :pET32-G3 重組子在16°C、28°C和37°C下I. 0mmo/L IPTG誘導(dǎo)4h表達(dá)量。
[0031] 圖8為G3基因片段表達(dá)蛋白的薄層掃描；紅色：蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；綠色： 含pET32a(+)的表達(dá)蛋白；黃色、深藍(lán)、淡藍(lán)分別為：G1、G2、G3基因的表達(dá)蛋白。
[0032] 圖9為純化的G3重組蛋白SDS-PAGE ;M :蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-3、4-6、7-9 分別為：咪唑濃度為100、200、500mmol/L的G3重組蛋白洗脫液。
[0033] 圖10為G3重組蛋白質(zhì)譜鑒定。
[0034] 圖11為細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞的觀察結(jié)果。
[0035] 圖12為單克隆抗體效價的測定及亞型的鑒定。
[0036] 圖13為Western-blotting檢測抗G蛋白單抗與純化G3重組蛋白（A)和RV(B) 的反應(yīng)原性;M :蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；I :2D2 ;2 :4H1 ;3 :9G4。
[0037] 圖14為抗G蛋白單克隆抗體的間接免疫熒光分析。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試 劑、方法和設(shè)備。
[0039] 實(shí)施例1修飾G蛋白基因 G3cDNA的獲得
[0040] 1、運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對狂犬病病毒HEP-Flury株糖蛋白膜外區(qū)序列進(jìn)行分析， 選擇抗原表位優(yōu)勢區(qū)段100~307位氨基酸（RV GP的抗原表位分析如附圖I-A所示），依 照大腸桿菌密碼子偏嗜性，對其氨基酸密碼子進(jìn)行修飾，序列見附圖I-B所示，于5'端和 3 ^端分別引入BamHI及HindIII酶切位點(diǎn)，理論長度為648bp，并由上海英駿生物技術(shù)有限 公司合成序列，命名為G3。
[0041] 2、圖2為G3PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果，所擴(kuò)增的目的基因片段G3的雙酶切純化產(chǎn)物 (泳道3)與預(yù)期的一致，為648bp (含雙酶切位點(diǎn)與保護(hù)性堿基）。
[0042] 實(shí)施例2 pET32-G3重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0043] 1、G3基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BamH I及Hind III雙酶切，回收后插入pET-32a(+) 載體的BamHI及Hind III雙酶切窗口，得到融合有His標(biāo)簽的G3融合蛋白基因的重組質(zhì) 粒，構(gòu)建過程如圖3所示；圖3中G3基因的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后，插入 pET-32a(+)的BamH I和把11(1111雙酶切窗口，得到含乂乂乂-63融合蛋白基因的重組質(zhì)粒。
[0044] 2、用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，然后將大腸桿菌BL21鋪于含氨芐青霉素的LB 平板，37°C過夜，次日挑取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行擴(kuò)增后，抽提質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)I. 0%的 瓊脂糖凝膠電泳，可見經(jīng)BamHI和Hind III雙酶切后，成為兩個片段，分別為大小分別約為 5900bp和630bp，與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)DNA序列測定結(jié)果正確。
[0045] 3、重組質(zhì)粒pET32-G3的菌液PCR和雙酶切鑒定結(jié)果如圖4所示。圖4中（A) pET32a(+)表達(dá)載體與G3基因片段連接后獲得的重組子，經(jīng)過PCR擴(kuò)增，重組子的菌液可 擴(kuò)增出大小約為630bp的目的條帶；(B)用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，然后將大腸桿菌 BL21鋪于含氨芐青霉素的LB平板，37°C過夜，次日挑取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行擴(kuò)增后，抽提質(zhì)粒 DNA進(jìn)行酶切鑒定，經(jīng)I. 0 %的瓊脂糖凝膠電泳，可見經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后，成為兩 個片段，分別為大小分別約為5900bp和630bp，與預(yù)期結(jié)果相符。
[0046] 實(shí)施例3融合有His標(biāo)簽的G3融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
[0047] 1、挑取經(jīng)鑒定含有重組表達(dá)質(zhì)粒PET32-G3的單菌落于含Amp+(K)O μ g/mL)LB液 體培養(yǎng)基中，37°C過夜培養(yǎng)。取上述培養(yǎng)菌按1:100比例接種于新鮮的含Amp+(K)Oyg/ mL)2XYT培養(yǎng)液，37°C培養(yǎng)至0D600值為0. 5,再加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L，以 誘導(dǎo)GP的表達(dá)，于37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h，將誘導(dǎo)的產(chǎn)物12000r/min離心Imin后，分別收集 上清和菌體，上清中加入相同體積的2XSDS-PAGE Loading Buffer，菌體中加入200 yL IX SDS-PAGE Loading Buffer，反復(fù)凍融三次，煮沸 IOmin 后，12000r/min 離心 10min，除去 大的蛋白質(zhì)碎片，取上清立即進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳。選擇陽性菌株大量誘導(dǎo)和純化融 合有His標(biāo)簽G融合蛋白。
[0048] 2、表達(dá)產(chǎn)物的 SDS-PAGE :
[0049] (1)按如下體系配制12%分離膠：30%丙烯酰胺貯存液6. OmL ;4X分離膠緩沖液 3. 8mL ;10%過硫酸銨 150. 0 μ L JEMED 15. 0 μ L ;雙蒸水 5. ImL ;總體積 15. 065mL。
[0050] 將各分離膠組分混勻，在安裝好的玻璃平板中，立即加入分離膠溶液至距離玻璃 板頂端約I. 5cm，輕輕在分離膠溶液上覆蓋一層約1.0 cm的水層，以防止空氣中的氧對凝膠 聚合的抑制作用。室溫靜置約30min，待凝膠聚合完成后，倒掉覆蓋的水層，用水沖洗凝膠上 部幾次后用濾紙盡可能吸干凝膠頂端的水。
[0051] (2)按如下體系灌制4%濃縮膠：30%丙烯酰胺1.0 mL ;4X濃縮膠緩沖液820 μ L ; 10%過硫酸銨 60 μ L ;TEMED 10 μ L ;雙蒸水 4. 2mL ;總體積 6. 09mL。
[0052] 將各濃縮膠組分混勻，立即加入濃縮膠溶液至玻璃板頂端，盡快小心插入梳子，盡 可能避免產(chǎn)生氣泡。約30min濃縮膠聚合后，小心拔出梳子。
[0053] (3)加入適量I X Tris-甘氨酸電泳緩沖液，上樣前用電泳緩沖液沖洗梳子孔，小 心加入處理后的樣品至樣品孔中。接通電源，濃縮膠階段電壓為80V，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠 時升電壓至100V，直至溴酚藍(lán)前沿迀移至凝膠底部。
[0054] (4)電泳完畢后，小心剝離電泳膠，加適量考馬斯亮藍(lán)R-250染色液緩慢振搖染色 3h，取出凝膠用水漂洗數(shù)次，再考馬斯亮藍(lán)脫色液脫色lh，其間更換脫色液3次。蛋白條帶 清晰后，觀察結(jié)果，并將凝膠轉(zhuǎn)入濕塑料袋內(nèi)，4°C保存。
[0055] (5)結(jié)果如圖5所示，圖5中重組表達(dá)質(zhì)粒pET32-G3轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)株，經(jīng)IPTG誘 導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS-PAGE分析，在相對分子質(zhì)量為39kDa處有明顯的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶（泳道 4)，與理論值相符，而（空載體）空質(zhì)粒pET32-G3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在39kDa處無蛋白表達(dá) 條帶。說明PET32-G3在宿主菌BL21中表達(dá)了融合有His標(biāo)簽的G融合蛋白。
[0056] 3、表達(dá)產(chǎn)物的 Western-blotting 分析：
[0057] (I)SDS-PAGE結(jié)束后，取出凝膠，按下列順序制備聚丙烯酰胺凝膠-膜"三明治"： 海綿墊-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊。用干凈的玻棒輕輕滾過凝膠-膜"三明治"， 以消除各層之間的氣泡。海綿墊和濾紙、PVDF膜預(yù)先在轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡30min。將固定 好的凝膠-膜"三明治"轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)儀中，凝膠側(cè)朝向負(fù)極，PVDF膜側(cè)朝向正極，并接好冷卻 裝置，200mA恒流轉(zhuǎn)移I. 5h。轉(zhuǎn)移后的凝膠放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中染色，以檢查轉(zhuǎn) 移效果。
[0058] (2)轉(zhuǎn)移完畢后取下PVDF膜，進(jìn)行如下操作：
[0059] 封閉：將PVDF膜放入大小適當(dāng)?shù)牟Ａ矫笾?，?%脫脂奶粉-TBS 12°C封閉過 夜；洗膜I :棄去封閉液，用TBS緩慢振搖洗膜三次，每次IOmin ;加一抗：將鼠抗狂犬病病 毒陽性血清（1:100倍稀釋）和抗6\把8單克隆抗體（111^/1111，1:200倍稀釋）分別加入1% 脫脂奶粉-TBS中，緩慢振搖8h ;洗膜II :棄去一抗，用TBS緩慢振搖洗膜三次，每次IOmin ; 加二抗：將辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠 IgG(l :500稀釋）加入1 %脫脂奶粉-TBS中，緩慢 振搖過夜；洗膜III :棄去二抗，用TBS緩慢振搖洗膜三次，每次IOmin ;顯色：稱取IOmg DAB 溶于20mL TBS中，過濾