后加入20 μ L濃度為30%的H2O2，將PVDF膜置于顯色液中顯色，待 出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶后，立即浸入雙蒸水中洗膜終止反應(yīng)。用吸水紙吸干膜上水分，避光干 燥保存。
[0060] (3) Western-blotting分析結(jié)果如圖6所示，G3重組蛋白能被抗6 XHis單克隆抗 體識別（A)和狂犬病病毒陽性血清識別（B)，證明G3基因片段在PET原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得 表達(dá)。
[0061] 泳道1中Gl基因的表達(dá)蛋白和泳道2中G2基因的表達(dá)蛋白明顯比泳道3中的G3 基因的表達(dá)蛋白要少，條帶要細(xì)；(B)泳道2中的G3基因的表達(dá)蛋白也明顯比泳道3中的 G2基因的表達(dá)蛋白和泳道4中的Gl基因的表達(dá)蛋白要多。
[0062] 4、誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化
[0063] (1)采用不同的溫度、IPTG濃度及時間進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化重組質(zhì)粒pET32-G3誘 導(dǎo)表達(dá)條件，比較不同條件下的表達(dá)量，確定最佳誘導(dǎo)條件。在確定最佳表達(dá)條件后，通過 薄層掃描分析重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物量。
[0064] (2)圖7中以誘導(dǎo)表達(dá)溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時間為分析因素，進(jìn)行單、雙和三元 素組合測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)表達(dá)溫度是影響表達(dá)量的最主要因素，其余兩個因素對表達(dá)量 幾乎沒有影響；三個重組蛋白均在28°C獲得最高表達(dá)量；最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件：在28°C下，以 1.0 mmol/L的IPTG終濃度，誘導(dǎo)4h。
[0065] (3)采取上述最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，對 pET32-Gl/BL21、pET32-G2/BL21 及 pET32-G3/ BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，對重組蛋白進(jìn)行薄層掃描，比較其表達(dá)量。結(jié)果如圖8顯示：G1、G2及 G3重組蛋白分別占菌體總蛋白的24%、17 %及45 %，表明G3重組蛋白的表達(dá)量最高。
[0066] (4)對表達(dá)量最高的G3重組蛋白進(jìn)行大量的誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)HisTrap FF柱 層析純化并濃縮后，根據(jù)公式：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL) = (I. 55XA280-0. 76XA260) X稀釋倍 數(shù)，經(jīng)測定純化后的G3重組蛋白的蛋白質(zhì)濃度為10mg/mL(圖9)。同時，確定了 G3重組蛋 白純化的結(jié)合和淋洗緩沖液中最佳咪唑濃度為20mmol/L，而洗脫緩沖液中最佳咪唑濃度為 200mmol/L〇
[0067] 5、目的蛋白的純化
[0068] 采用優(yōu)化的表達(dá)條件對表達(dá)量最高的重組蛋白進(jìn)行大量表達(dá)，收獲菌體，棄上清 液，包涵體沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，超聲波破碎20min。于4°C，5000r/min離心20min，棄 上清。用含8mol/L尿素溶解緩沖液溶解沉淀，置冰上2h。于4°C，12000r/min離心20min， 收集上清，用0.22 μm濾膜過濾上清。依照HisTrap FF(ImL)親和柱的操作手冊，進(jìn)行蛋白 純化，具體步驟如下：
[0069] 用蒸餾水注滿注射器。移去塞子，用注射器（使用提供的接頭）一滴接一滴的注 入蒸餾水，以免將空氣引入系統(tǒng)中；將在柱出口的速變彈簧夾移去；用5個柱床體積的滅菌 雙蒸水洗去柱內(nèi)的乙醇；用10個柱床體積的結(jié)合緩沖液平衡柱（咪唑濃度為20mmol/L)， 流速為lmL/min ;用注射器將溶解的包涵體上清上到柱上；用15個柱床體積的結(jié)合緩沖液 沖洗（咪唑濃度為20mmol/L);用3個柱床體積的洗脫緩沖液分部洗脫（咪唑濃度分別為 100mm〇l/L、200mm〇l/L、500mm〇l/L)，收集洗脫液；用10個柱床體積結(jié)合緩沖液淋洗；用10 個柱床體積滅菌雙蒸水淋洗；用20%的乙醇注滿柱床，于4°C保存。
[0070] 6、純化蛋白的濃縮和脫鹽：對收集洗脫的目的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE鑒定后，使用 Millipore超濾離心管對鑒定的純化蛋白進(jìn)行濃縮和脫鹽，具體步驟如下：
[0071] 于超濾管中加入2mL滅菌的雙蒸水，室溫下5000r/min離心2~3min，重復(fù)3次， 淋洗超濾柱；將1. 2. 2. 6收集的洗脫液加入超濾管中，5000r/min離心20min，收集超濾管里 的濃縮樣品；用2mL IN NaOH淋洗，5000r/min離心2~3min ;用2mL滅菌的雙蒸水淋洗， 5000r/min 離心 3min，重復(fù) 2 次；用 2mT, 20%的乙醇淋洗，500〇1'/111；[11離心3111；[11，重復(fù)2次； 用20%的乙醇注滿超濾管，于室溫保存。
[0072] 7、純化蛋白濃度測定：用全自動紫外分光光度計測定純化后蛋白含量。用溶解緩 沖液溶液進(jìn)行調(diào)零，測定樣品A26jP A 28(|的值，根據(jù)公式：
[0073] 蛋白質(zhì)濃度（mg/mL) = (I. 55XA28(!-0. 76XA26(I) X稀釋倍數(shù)，計算出蛋白質(zhì)的濃 度。
[0074] 對表達(dá)量最高的G3重組蛋白進(jìn)行大量的誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)HisTrap FF柱層 析純化并濃縮后，根據(jù)公式：蛋白質(zhì)濃度（mg/mL) = (1.55XA28CI-0. 76XA26(I)X稀釋倍數(shù)， 經(jīng)測定純化后的G3重組蛋白的蛋白質(zhì)濃度為10mg/mL (圖7)。同時，確定了 G3重組蛋白 純化的結(jié)合和淋洗緩沖液中最佳咪唑濃度為20mmol/L，而洗脫緩沖液中最佳咪唑濃度為 200mmol/L〇
[0075] 8、重組蛋白的質(zhì)譜鑒定
[0076] 切割下SDS-PAGE電泳圖譜中的表達(dá)量最高的重組蛋白條帶，送至暨南大學(xué)生命 與健康工程研宄院進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。
[0077] 純化后G3重組蛋白經(jīng)胰蛋白酶酶解成肽段混合物之后，采用MS/MS法對蛋白進(jìn) 行質(zhì)譜鑒定，經(jīng)肽指紋圖譜（圖10B)鑒定和部分強信號肽段測序，結(jié)果表明KHFRPTPDACR、 YEESLHNPYPDYHWLR、LGTSCDIFTHSR、TCGFVDER、LKLCGVLGLR、WCPPGQLVNLHDFR、REECLDALE 這 7段肽段為狂犬病病毒HEP-Flury株G蛋白的片段（圖10A)，進(jìn)一步表明表達(dá)的蛋白為狂 犬病病毒糖蛋白。
[0078] 實施例4抗G蛋白單克隆抗體的制備 [0079] 1、免疫原的制備
[0080] 將純化的重組RV GP抗原表位富集區(qū)蛋白（G3重組蛋白）用0. 15mol/L pH7. 4的 PBS稀釋到適當(dāng)濃度，加入等體積的完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑，在高速電動勻漿機上 乳化，直至乳化良好為止，分別制成完全佐劑抗原和不完全佐劑抗原，作為免疫小鼠的佐劑 抗原。觀察乳化是否良好，可用小燒杯取少量清水，取0. 5 μ L乳化液，滴入清水中，如果形 成油滴，不能立即散開溶解（一般以5min為限），即為乳化良好（張昶，2007)。
[0081] 2、動物免疫
[0082] 選擇6周齡的體重為18~22g雌性SPF BALB/c小鼠12只，分成3組，每組4只。 用弗氏完全佐劑乳化與等體積的抗原進(jìn)行一免，皮下注射；然后分別在第15d和29d，用弗 氏不完全佐劑乳化與等體積的抗原分別進(jìn)行二免及三免。一般在三免后第IOd檢測小鼠抗 體效價，當(dāng)抗體效價達(dá)到1 :1〇5后，于融合前3d用非乳化抗原加強免疫一次。3d后，無菌取 脾進(jìn)行融合。免疫方案見表1。
[0083] 表1BALB/c鼠免疫方案
[0084]
[0085] 表1中選擇6周齡的體重為18~22g雌性SPF BALB/c小鼠12只，分成3組，每 組4只。用弗氏完全佐劑乳化與等體積的抗原進(jìn)行一免，皮下注射；然后分別在第15d和 29d，用弗氏不完全佐劑乳化與等體積的抗原分別進(jìn)行二免及三免。一般在三免后第IOd檢 測小鼠抗體效價，當(dāng)抗體效價達(dá)到1 :1〇5后，于融合前3d用非乳化抗原加強免疫一次。3d 后，無菌取脾進(jìn)行融合。
[0086] 小鼠在三免后第IOd斷尾采血，分離血清，檢測血清效價，結(jié)果如表2。
[0087] 表2三免后免疫鼠抗體水平檢測結(jié)果
[0088]
[0089] 表2中小鼠在三免后第IOd斷尾采血，分離血清，檢測血清效價，結(jié)果見表2。高 劑量組所免疫的蛋白量太多，以致小鼠出現(xiàn)不適，甚至死亡的現(xiàn)象。中劑量組的血清效價最 高，其中1號和3號小鼠三免后，抗體效價經(jīng)104倍稀釋，0D450nm+0D630nm值分別達(dá)到了 1. 893和1. 892 ;血清經(jīng)105倍稀釋，0D450nm+0D630nm值均大于0. 1，已符合制備單克隆抗 體的要求，故選擇中劑量組小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。
[0090] 高劑量組所免疫的蛋白量太多，以致小鼠出現(xiàn)不適，甚至死亡的現(xiàn)象。中劑量組的 血清效價最高，其中1號和3號小鼠三免后，抗體效價經(jīng)IO4倍稀釋，0D45(lnm+0D 63(lnm值分別達(dá) 到了 1. 893和1. 892 ;血清經(jīng)IO5倍稀釋，OD 45(lnm+0D63J直均大于0. 1 (如表3)，已符合制備 單克隆抗體的要求，故選擇中劑量組小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。
[0091] 表3篩選試驗中包被抗原最佳使用濃度的結(jié)果 [00921
[0093] 表3中不同量的純化的G3重組蛋白包被ELISA板后，與不同稀釋倍數(shù)的免疫小鼠 血清感作，進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果如表3,確定最佳包被量在8 μ g/mL。
[0094] 3、篩選方法的建立
[0095] ⑴間接ELISA反應(yīng)程序
[0096] 包被：用包被液稀釋純化的G3重組蛋白抗原，100 μ L/孔，4°C過夜；洗滌：甩干包 被液，洗滌液振蕩洗滌4次，2min/次；封閉：加入封閉液，100 μ L/孔，37°C濕盒封閉3h。甩 干，同上洗絳；加樣：用抗體稀釋液適當(dāng)稀釋血清，100 μ L/孔，37°C反應(yīng)70min。甩干，同上 洗滌；加二抗：用PBS按1:10000倍濃度稀釋酶標(biāo)羊抗鼠 IgG，100 μ L/孔，37°C作用40min。 甩干，同上洗滌；加底物：每孔加入底物溶液100 μ L，室溫反應(yīng)10min ;加終止液：每孔加 50 yL H2SCM終止反應(yīng)；測值：用雙波長（0D45Qmi+0D63QJ測定各孔吸光度值，同時設(shè)陰性血清