大麗輪枝菌硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白病程關(guān)鍵靶基因及其干擾載體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及大麗輪枝菌硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白病程關(guān)鍵靶基因，還涉及含有所述硫胺素 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白病程關(guān)鍵靶基因的干擾載體，本發(fā)明還涉及所述大麗輪枝菌硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白病程 關(guān)鍵靶基因或干擾載體在提高植物對(duì)大麗輪枝菌抗病性中的應(yīng)用，屬于大麗輪枝菌病程關(guān) 鍵基因的克隆及應(yīng)用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大麗輪枝菌（Verticillium dahliae)是一種土傳維管束真菌病害，侵染范圍非常 廣泛，能侵染包括木本植物、草本植物和藤本植物在內(nèi)的兩百多種經(jīng)濟(jì)作物，給中國(guó)乃至世 界造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。鑒于其嚴(yán)重的危害性，探宄大麗輪枝菌致病機(jī)理和寄主與病原菌 之間的相互作用機(jī)制一直是研宄的熱點(diǎn)。如何提高寄主植物體對(duì)大麗輪枝菌的抗病性是急 待解決的問(wèn)題。
[0003] 殘留在土壤中的大麗輪枝菌微菌核受到植物分泌液的誘導(dǎo)而萌發(fā)，萌發(fā)的微菌核 不需要任何的吸附結(jié)構(gòu)直接定殖在植物根的表面并滲透到表皮細(xì)胞的皮層中去（Reusche Mj Thole Kj Janz D，Truskina J，Rindfleisch Sj Drlibert C，Polle A，Lipka V，Teichmann T:Verticillium infection triggers VASCULAR-RELATED NAC D0MAIN7-dependent de novo xylem formation and enhances drought tolerance in Arabidopsis. Plant Cell 2012, 24:3823 - 3837 ；Zhao PjZhao Y-LjJin YjZhang TjGuo H-S:Colonization process of Arabidopsis thaliana roots by a green fluorescent protein-tagged isolate of Verticillium dahliae. Protein Cell 2014,5:94 _98·)。滲透到植物表皮細(xì)胞的菌絲穿 過(guò)細(xì)胞壁在根部的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間生長(zhǎng)并延伸到根部的維管束組織，改變植物體細(xì)胞的 內(nèi)生環(huán)境，形成一種共生環(huán)境（?688,6.?.，311(18以(17,8.1^(2002)./61^;!_(3；!_11;!_11111?;!_1七8· (Wellingford, UK:CABI Publishing) ；Klosterman SJ，Atallah ZKj Vallad GE,Subbarao KV:Diversity，pathogenicity，and management of Verticillium species.Ann Rev Phytopathol2009, 47:39 - 62.) ^在共生環(huán)境中，植物體阻礙菌絲體的入侵，而菌絲體利 用共生環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)維持菌絲體的入侵和孢子的產(chǎn)生與釋放（Fradin EF，Thomma BP:Physiology and molecular aspects of Verticillium wilt diseases caused by V. dahliae and V.albo-atrum· Mol Plant Pathol 2006,7:71 - 86·)。釋放到維管束的抱 子可以通過(guò)植物體的蒸騰作用向上運(yùn)輸，被運(yùn)輸?shù)骄S管束壁的孢子萌發(fā)形成萌發(fā)管，向植 物體細(xì)胞滲透、定殖、侵染和繁殖。
[0004] 目前為止，大麗輪枝菌致病機(jī)理仍停留在初步探索階段。大麗輪枝菌定殖在寄主 植物體內(nèi)，如何適應(yīng)寄主體內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和如何吸收寄主細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分至今還沒(méi)報(bào) 道。因此，探索大麗輪枝致病機(jī)制過(guò)程中入侵繁殖機(jī)制顯得更加重要，尋找到參與吸收過(guò)程 中關(guān)鍵的蛋白因子，"反向基因組學(xué)"為培育抗病的新材料品種提供了一條新的技術(shù)路線。
[0005] 硫胺素也叫維生素 B1，是一種可溶性的B族維生素，作為很多重要的輔酶在細(xì)胞 的物質(zhì)和能量代謝過(guò)程中起著重要作用，是生物體必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。硫胺素在真菌的營(yíng) 養(yǎng)生長(zhǎng)、入侵、生殖生長(zhǎng)過(guò)程中必不可少的營(yíng)養(yǎng)成分。通過(guò)質(zhì)膜上的硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將環(huán) 境外的硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)是真菌微生物獲得硫胺素的主要方式（Mojzita D.，Hohmann S.Pdc2coordinates expression of the THI regulon in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular genetics and genomics，2006, 276 (2) : 147-16L ) 〇 石荒胺素車(chē)專(zhuān)運(yùn) 蛋白（Thiamine transporter)是一個(gè)質(zhì)膜蛋白，屬于還原型的葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，包含膜 嵌入底物結(jié)合蛋白、兩個(gè)ATP結(jié)合蛋白和一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞基（Lagarde, W. H.，Underwood, L. E. , Moats - Staats, Β. Μ. , &Calikoglu, A.S. (2004). Novel mutation in the SLC19A2gene in an African - American female with thiamine - responsive megaloblastic anemia syndrome. American Journal of Medical Genetics Part A, 125 (3) ,299-305·)。主要將 外界低濃度的硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)到生物體內(nèi)，供機(jī)體進(jìn)行新陳代謝。
[0006] 目前有關(guān)大麗輪枝菌的硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的研宄還未見(jiàn)任何報(bào)道，從硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋 白基因中篩選得到病程關(guān)鍵靶基因?qū)τ谔岣咧参飳?duì)大麗輪枝菌的抗病性將具有重要的意 義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供大麗輪枝菌（Verticillium dahliae)的硫胺 素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白病程關(guān)鍵靶基因以及含有所述硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白病程關(guān)鍵靶基因的RNA干擾載 體；
[0008] 本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是將所述硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白病程關(guān)鍵靶基因的 RNA干擾載體應(yīng)用于提高植物對(duì)大麗輪枝菌的抗病性。
[0009] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0010] 本發(fā)明首先公開(kāi)了大麗輪枝菌（Verticillium dahliae)的硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白病程 關(guān)鍵靶基因，其核苷酸序列為 SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 4 或 SEQ ID No. 5所示；優(yōu)選的，所述硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白病程關(guān)鍵靶基因，其核苷酸序列為SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4 或 SEQ ID No. 5 所示。
[0011] 本發(fā)明還公開(kāi)了含有所述的硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白病程關(guān)鍵靶基因的RNA干擾載體以 及含有所述RNA干擾載體的宿主細(xì)胞。
[0012] 本發(fā)明所述硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白病程關(guān)鍵靶基因能夠應(yīng)用于提高植物對(duì)大麗輪枝菌 的抗病性，包括以下步驟：（1)構(gòu)建含有所述硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白病程關(guān)鍵靶基因的RNA干擾載 體；（2)將所構(gòu)建的RNA干擾載體轉(zhuǎn)化到植物或植物細(xì)胞中；（3)篩選獲得對(duì)大麗輪枝菌抗 病性提高的轉(zhuǎn)基因植物。
[0013] 本發(fā)明所述RNA干擾載體能夠應(yīng)用于提高植物對(duì)大麗輪枝菌的抗病性，包括以下 步驟：（1)將所述RNA干擾載體轉(zhuǎn)化到植物或植物細(xì)胞中；（2)篩選獲得對(duì)大麗輪枝菌抗病 性提尚的轉(zhuǎn)基因植物。
[0014] 本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了一種培育抗大麗輪枝菌的轉(zhuǎn)基因植物新品種的方法，包括以 下步驟：（1)構(gòu)建含有所述硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白病程關(guān)鍵靶基因的RNA干擾載體；（2)將所構(gòu)建 的RNA干擾載體轉(zhuǎn)化到植物或植物細(xì)胞中；（3)篩選獲得對(duì)大麗輪枝菌抗病性提高的轉(zhuǎn)基 因植物新品種。
[0015] 所述轉(zhuǎn)化的方案以及將所述核苷酸引入植物的方案可視用于轉(zhuǎn)化的植物或植物 細(xì)胞的類(lèi)型而變化。將所述核苷酸引入植物細(xì)胞的合適方法包括：顯微注射、電穿孔、農(nóng)桿 菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、直接基因轉(zhuǎn)移等。
[0016] 本發(fā)明所述植物為大麗輪枝菌的寄主植物，優(yōu)選為農(nóng)作物，包括：煙草、棉花、番 茄、馬鈴薯、甜瓜、西瓜、黃瓜或花生中的任意一種或多種。
[0017] 本發(fā)明通過(guò)病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)（VIGS)將大麗輪枝菌硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 的 5 段靶基因序列 Thitl (SEQ ID No. 1 所示）、Thit2 (SEQ ID No. 2 所示）、Thit3 (SEQ ID No. 3所示）、Thit4(SEQ ID No. 4所示）、Thit5(SEQ ID No. 5所示）導(dǎo)入本生煙中，使其瞬 時(shí)表達(dá)dsRNA，并進(jìn)行大麗輪枝菌接種，觀察本生煙植株的感病癥狀，并對(duì)其進(jìn)行病情指數(shù) 分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)入5段靶基因片段的本生煙植株的抗病性都顯著提高，在接菌第12天 后，導(dǎo)入干擾基因的本生煙植株感病癥狀不明顯，僅下面葉片出現(xiàn)萎焉，上面葉片沒(méi)出現(xiàn)感 病癥狀，植株整體沒(méi)有出現(xiàn)萎焉、枯死癥狀。同時(shí)，導(dǎo)入5段靶基因的本生煙植株的感病癥 狀之間也存在差異，導(dǎo)入基因片段Thit2、Thit4、Thit5的本生煙植株的感病癥狀低于導(dǎo)入 基因片段Thitl、Thit3的本生煙植株，植株對(duì)大麗輪枝菌的抗病性更強(qiáng)。病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié) 果發(fā)現(xiàn)，注射靶標(biāo)基因片段的本生煙草，病情指數(shù)均顯著低于空載。
[0018] 本發(fā)明在篩選出抗病表型明顯的大麗輪枝菌硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的三段基因片 段Thit2、Thit4、Thit5的基礎(chǔ)上，利用Gateway技術(shù)，構(gòu)建硫胺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白三段靶基因序列 的穩(wěn)定遺傳干擾載體，轉(zhuǎn)化本生煙，獲得轉(zhuǎn)基因的煙草植株。轉(zhuǎn)靶標(biāo)基因的本生煙植株的抗 病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，獲得的三段不同靶基因（VdThit-l(SEQ ID No. 5所示）、VdThit-2(SEQ IDN0.4所示）、VdThit-3(SEQIDN0.2所示））的煙草轉(zhuǎn)化植株對(duì)大麗輪枝菌的抗病性 與野生型相比顯著提高，分別表現(xiàn)為高抗（病情指數(shù)在15 %以下），抗?。ú∏橹笖?shù)在 15-30% )，抗病。
[0019] 轉(zhuǎn)靶標(biāo)基因的本生煙植株接種大麗輪枝菌后，獲得V