大麗輪枝菌致病相關(guān)基因VdGFP的功能分析及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)致病相關(guān)基因 VdGFP的功能分析 及其潛在應(yīng)用的研究，屬于植物病理學(xué)研究領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)是引起植物黃萎病的重要土傳病原 真菌，寄主廣泛，可危害多種重要的經(jīng)濟(jì)作物和園藝作物。傳統(tǒng)的防治技術(shù)，如輪作、抗性品 種選育、化學(xué)藥劑等對(duì)黃萎病的防治有一定的效果，但是由于大麗輪枝菌具有豐富的遺傳 多樣性，致病力易發(fā)生分化，且主要以抗逆性強(qiáng)的微菌核結(jié)構(gòu)在土壤中存活，因而在世界范 圍內(nèi)黃萎病的危害依然嚴(yán)重。
[0003] 明確大麗輪枝菌的侵染和致病機(jī)制是有效防控該病害的關(guān)鍵。但是目前對(duì)于大麗 輪枝菌從侵染、定殖到發(fā)病等方面的研究，仍存在諸多問(wèn)題。首先，大麗輪枝菌侵染過(guò)程不 明確研究表明，當(dāng)生長(zhǎng)環(huán)境適宜時(shí)，土壤中距離寄主根部較近或與根部直接接觸的大麗輪 枝菌的孢子或微菌核會(huì)受到根冠細(xì)胞分泌物的刺激，萌發(fā)形成芽管或菌絲，這些菌絲起初 在根表面隨機(jī)分布，隨著生長(zhǎng)開(kāi)始聚集，僅有少許菌絲能從初始侵入位點(diǎn)成功侵入寄主植 物的皮層，絕大部分菌絲不能建立系統(tǒng)侵染，最終逐漸死亡。菌絲侵入寄主根部后進(jìn)入維管 組織，隨著蒸騰作用向植株的莖和葉片擴(kuò)展，最終侵染整個(gè)植株。在這一系列過(guò)程中，菌絲 聚集的調(diào)控、初始侵入位點(diǎn)的選擇、哪些菌絲能侵染、侵染過(guò)程中是否產(chǎn)生附著孢等問(wèn)題均 存在爭(zhēng)議。其次，大麗輪枝菌的致病機(jī)理未闡明。目前對(duì)于大麗輪枝菌所分泌的次級(jí)代謝物 (細(xì)胞壁降解酶、蛋白酶和致病毒素)在致病中的作用，爭(zhēng)議較大。Cander等研究表明，果膠 酶活性與大麗輪枝菌毒性呈正相關(guān)，強(qiáng)致病力菌株果膠酶活性高，弱致病力菌株則幾乎不 產(chǎn)果膠酶。因而果膠酶曾一度被看作是黃萎病菌致病的主導(dǎo)生化因子。但是，Durrands等通 過(guò)研究喪失了果膠酶分泌能力的大麗輪枝菌突變體菌株后發(fā)現(xiàn)，該突變體仍然對(duì)棉花具有 定殖和侵染的能力，從而證明了胞外果膠降解酶是大麗輪枝菌侵染寄主植物的重要因素， 但并不是決定性因素。章元壽等對(duì)病菌胞外蛋白-脂多糖復(fù)合物中的蛋白質(zhì)、多糖、脂質(zhì)成 分的致萎作用作了鑒定，認(rèn)為復(fù)合物中蛋白質(zhì)成分起主要致萎作用，推測(cè)脂質(zhì)和多糖成分 可能在病菌、寄主互作時(shí)起識(shí)別作用。EI-Bebany等通過(guò)蛋白質(zhì)組分析，發(fā)現(xiàn)大麗輪枝菌的 致病作用很可能是由多種物質(zhì)（因子)與寄主互作誘發(fā)寄主病變。所以，對(duì)病菌次級(jí)代謝物 單組分的純化與致病性鑒定很可能不夠全面、深入地了解黃萎病菌的致病機(jī)制。而且，病菌 分泌的毒素蛋白含量低，成分復(fù)雜且難于分離純化，目前對(duì)該類(lèi)物質(zhì)的研究也僅僅停留在 體外處理和生化分析層面上，其致病的分子機(jī)理尚不明了。有研究者借鑒在其他病原真菌 如核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum(Lib · )de Bary)、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani)致病性方而的研究成果，來(lái)獲得大麗輪枝菌中的同源致病基因，分析其生物學(xué)功 能。例如，編碼促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的 VMK1，編碼cAMP依賴(lài)性蛋白激酶A-個(gè)催化亞基的VdPKACl，編碼sucrose nonfermenting 1 調(diào)控分解代謝阻遏的VdSNFL編碼G蛋白β亞基的VGB，這些同源基因被敲除后的大麗輪枝菌 突變體致病力均顯著下降。Wang等通過(guò)同源克隆的方法獲得了誘導(dǎo)棉花產(chǎn)生黃萎病的激發(fā) 子VdNEP，可誘導(dǎo)煙草葉片的超敏反應(yīng)以及棉花葉片的萎蔫。但是大麗輪枝菌生物學(xué)特性和 遺傳背景不同于其他的病原真菌，同源基因在大麗輪枝菌中的功能也可能有所不同。
[0004] 因此，希望通過(guò)分子生物學(xué)手段從大麗輪枝菌中直接挖掘更多參與侵染和致病相 關(guān)的基因，探索其調(diào)控的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)途徑和與寄主植物的互作機(jī)制，從分子層面來(lái)揭示大麗 輪枝菌的致病機(jī)理，為作物抗病育種、新型殺菌劑的研發(fā)提供新的思路和靶標(biāo)。對(duì)于一部分 細(xì)菌和真菌，在構(gòu)建載體時(shí)，將其基因組上靶標(biāo)基因兩側(cè)一定長(zhǎng)度的同源序列進(jìn)行克隆，并 且將抗生素抗性基因盒連接到兩者當(dāng)中。利用如原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法， 將這一帶有同源序列的質(zhì)粒導(dǎo)入該微生物細(xì)胞內(nèi)后，細(xì)胞會(huì)在一定比例上啟動(dòng)核酸修復(fù)機(jī) 制，而原靶標(biāo)基因的核酸序列將被載體上帶有抗性基因盒的序列替換，從而產(chǎn)生不含有靶 基因的敲除突變體。而通過(guò)對(duì)敲除突變體表型的觀察和檢測(cè)，可以確定該基因的生物學(xué)功 能及其在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 從大麗輪枝菌V07DF2菌株中克隆了 VdGFP基因，該基因全長(zhǎng)為1264個(gè)堿基，核苷酸 序列為SEQ ID N0:1，該基因的0RF序列具有SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。本發(fā)明同時(shí)提 供了VdGFP基因編碼的蛋白質(zhì)序列，該蛋白質(zhì)序列具有SEQ ID N0:3所不的氣基酸序列。根 據(jù)該基因及其側(cè)翼的核酸序列，構(gòu)建了針對(duì)該基因的敲除、回補(bǔ)載體。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn) 化方法，獲得了該基因的敲除突變體和回補(bǔ)突變體。通過(guò)對(duì)這些轉(zhuǎn)基因材料的表型觀察和 分析，發(fā)現(xiàn)VdGFP基因影響病原菌對(duì)棉花的致病能力。
[0006] 相關(guān)技術(shù)路線如下：
[0007] 1.利用網(wǎng)上共享的生物信息資源，設(shè)計(jì)核酸引物，構(gòu)建VdGFP基因的敲除載體，并 將載體導(dǎo)入大腸桿菌和農(nóng)桿菌菌株中。
[0008] 2.利用網(wǎng)上共享的生物信息資源，設(shè)計(jì)核酸引物，構(gòu)建VdGFP回補(bǔ)載體，并將載體 導(dǎo)入大腸桿菌和農(nóng)桿菌菌株中。
[0009] 3.分別將敲除載體和回補(bǔ)載體利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到大麗輪枝菌V07DF2 中，獲得敲除和回補(bǔ)突變體。
[0010] 4.觀察野生型菌株以及敲除和回補(bǔ)突變體在侵染植物過(guò)程中的差異。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1. VdGFP敲除突變體熒光定量圖（V07DF2為野生菌株；51A12為T(mén)-DNA篩選突變 體;51A12敲3、51A12敲 4、51A12敲5、51A12敲7、51A12敲9、51A12敲 10 為 6個(gè)敲除 VdGFP 基因的 突變體菌株）
[0012] 圖2 . VdGFP回補(bǔ)突變體熒光定量圖（V07DF2為野生菌株；51A12為T(mén)-DNA篩選突變 體;51A12回1、51A12回2、51A12回3、51A12回7為4個(gè)回補(bǔ)VdGFP基因的突變體菌株）
[0013] 圖3.野生型菌株以及敲除和回補(bǔ)突變體對(duì)寄主棉花的致病力分析結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0014] 1. VdGFP基因的敲除載體和回補(bǔ)載體的構(gòu)建，并將構(gòu)建好的載體用化學(xué)轉(zhuǎn)化法導(dǎo) 入農(nóng)桿菌AGL-1菌株中，分別獲得具有VdGFP基因敲除功能以及回補(bǔ)功能的AGL-1農(nóng)桿菌各 一個(gè)，具體流程描述如下：
[0015] A.