一種大麗輪枝菌的單孢分離純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于真菌分離純化領(lǐng)域，涉及一種大麗輪枝菌的單抱分離純化方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大麗輪枝菌（Verticilliumd址liae)，屬于半知菌亞口輪枝抱屬真菌，寄主范圍 極廣，可危害38科600多種植物，例如棉花、大豆、綠豆、甜菜、芝麻等大田作物，W及茄子、 辣椒、番茄、西瓜、黃瓜、甜瓜等蔬菜瓜果。由大麗輪枝菌引起的棉花黃萎病危害尤為嚴(yán)重， 曾于1993、1995、1996、2002和2003年在我國暴發(fā)5次大流行，每年造成損失約合12億元。 因此，開展大麗輪枝菌致病機(jī)理研究W及防控大麗輪枝菌引起的植物病害，減少經(jīng)濟(jì)損失 就顯得尤為重要。然而開展相關(guān)基礎(chǔ)研究的前提條件是獲得較為理想的純化菌株。若菌株 不純則嚴(yán)重影響深入開展大麗輪枝菌致病機(jī)制的研究。
[0003] 現(xiàn)有植物病原真菌的單抱分離方法主要有平板稀釋法、眉毛針挑取法、 直接注射法等，但因為大麗輪枝菌與其他絲狀真菌相比分生抱子較小，大小僅有 2. 3-8. 7ymX1. 5-3ym，顯微觀察需用40倍目鏡，導(dǎo)致目鏡與培養(yǎng)基之間的距離較小，造 成直接在培養(yǎng)皿內(nèi)尋找單抱進(jìn)行挑取的困難極大，且容易沾染到顯微鏡而造成污染；此外 分生抱子體積小容易聚集成團(tuán)，運用平板稀釋法獲得的單個菌落也不能保證就是單個抱子 生長而成，仍需后續(xù)試驗驗證其純度，試驗流程復(fù)雜，費時費力。
[0004]CN102140432A公開了一種對真菌單個抱子的分離方法，其技術(shù)方案是將玻璃毛細(xì) 管從尖端插入己斯德吸管中，用ParafiIm封口膜將己斯德吸管尖端管口處封閉，用解剖針 挑取待分離的真菌材料，將毛細(xì)管管口中必正對并接近抱子，轉(zhuǎn)移抱子至培養(yǎng)基上方，完成 單抱分離。雖然此發(fā)明可W實現(xiàn)真菌的單抱分離，但是其分離操作必須在復(fù)式顯微鏡或解 剖鏡下進(jìn)行，且對于操作人員的技術(shù)與經(jīng)驗具有較高的要求，而且其分離的成功率會因人 員操作因素的影響而發(fā)生很大變化，不適宜大批量的真菌單胞分離；同時，該發(fā)明對小型分 生抱子的分離效果并不理想，也不適宜于像大麗輪枝菌送樣產(chǎn)生小型分生抱子的真菌的單 抱分離。
[0005]因此，在對大麗輪枝菌等真菌的致病機(jī)理的研究中，迫切需要開發(fā)一種穩(wěn)定，快 速，高效且適合進(jìn)行大批量分離的單抱分離方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種大麗輪枝菌的單抱分離純化方法。
[0007] 為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供一種大麗輪枝菌的單抱分離純化方法，包括W下步驟：
[0009] (1)配制水瓊脂培養(yǎng)基、PDA固體培養(yǎng)基和察氏（Czapek'S)液體培養(yǎng)基，并制備 水瓊脂平板和PDA平板待用；
[0010] (2)選用直徑1mm的玻璃毛細(xì)管，在水瓊脂平板上打取水瓊脂培養(yǎng)基圓柱體，用滅 菌挑針將其移至經(jīng)過滅菌的載玻片上；
[0011] (3)將大剛輪枝菌菌株在PDA培養(yǎng)基中活化，于察氏液體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)；
[0012] (4)過濾步驟（3)得到的培養(yǎng)物，在顯微鏡下統(tǒng)計抱子濃度，用無菌水將抱子濃度 調(diào)至10 2-106c化，制成抱子懸浮液；
[0013] (5)吸取luL抱子懸浮液，滴至載玻片上的水瓊脂圓柱體表面，將載玻片移至培 養(yǎng)皿內(nèi)，用封口膜封口，25°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)；
[0014] (6)顯微鏡檢測步驟（5)獲得的載玻片上的水瓊脂圓柱體，將含有已萌發(fā)產(chǎn)生芽 管的單個分生抱子的水瓊脂圓柱體轉(zhuǎn)移至PDA平板上培養(yǎng)，觀察菌落生長情況。
[0015] 在本發(fā)明所述的大麗輪枝菌的單抱分離純化方法中，步驟（1)所述水瓊脂培養(yǎng) 基配方如下；瓊脂粉4-5g，蒸傭水lOOmL;所述PDA固體培養(yǎng)基配方如下；馬鈴墓200g，葡 萄糖20g，瓊脂15-20g，蒸傭水1L;所述察氏液體培養(yǎng)基配方如下；FeS〇4〇. 02g，NaN〇32g， M拆〇4lg，KCLIg，K&POJg，藏糖 30g，蒸傭水IL，pH= 6. 0。
[0016] 在水瓊脂培養(yǎng)基配方中瓊脂粉可W為4g、4. 2g、4. 4g、4. 5g、4. 6g、4. 7g、4. 8g、4. 9g 或5g。在PDA固體培養(yǎng)基配方中瓊脂可W為15g、16g、17g、18g、19g或20g。
[0017] 在本發(fā)明所述的大麗輪枝菌的單抱分離純化方法中，步驟（1)所述水瓊脂平板內(nèi) 水瓊脂厚度為保證其透明度。為充分利用空間，步驟（2)中所述每張載玻片上放 置20個水瓊脂培養(yǎng)基圓柱體。
[0018] 在本發(fā)明所述的大麗輪枝菌的單抱分離純化方法中，步驟（3)中所述大麗輪枝菌 菌株的活化和培養(yǎng)方法如下：將-8(TC冰箱內(nèi)保存的大麗輪枝菌菌株取出，轉(zhuǎn)移至盛有PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中于25°C恒溫箱內(nèi)活化7-10天，取直徑3-4mm的菌塊，放入盛有50mL察氏 液體培養(yǎng)基的H角瓶中，于25C下振蕩培養(yǎng)5-6天。
[0019] 在本發(fā)明所述的大麗輪枝菌的單抱分離純化方法中，步驟（4)所述過濾采用雙層 紗布進(jìn)行，W除去菌絲團(tuán)和雜質(zhì)；步驟（4)所述在顯微鏡下統(tǒng)計抱子濃度利用血球計數(shù)板 進(jìn)行。
[0020] 在本發(fā)明所述的大麗輪枝菌的單抱分離純化方法中，將步驟（4)所述抱子濃度調(diào) 節(jié)至l〇2-l〇6cfu,例如l〇2cfU、l〇3cfU、l〇4cfU、l〇5cfU或l〇6cfU,優(yōu)選地調(diào)節(jié)至l〇4cfU。
[0021] 在本發(fā)明所述的大麗輪枝菌的單抱分離純化方法中，步驟（5)所述培養(yǎng)的時間為 1化。
[0022] 在本發(fā)明所述的大麗輪枝菌的單抱分離純化方法中，步驟（5)所述培養(yǎng)皿內(nèi)附有 保濕培養(yǎng)基（即PDA培養(yǎng)基），在培養(yǎng)皿內(nèi)事先倒好保濕培養(yǎng)基的目的是防止培養(yǎng)過程中水 瓊脂小圓柱體風(fēng)干而無法使用，進(jìn)而造成真菌培養(yǎng)實驗失敗。在每個12cm培養(yǎng)皿內(nèi)最多放 置3個載玻片（如圖2所示）。
[0023] 在本發(fā)明所述的大麗輪枝菌的單抱分離純化方法中，步驟（6)在用顯微鏡檢測 前，將所需顯微鏡通體用70%酒精擦拭后置于超凈工作臺內(nèi)，開啟紫外燈和風(fēng)機(jī)，滅菌 30min。
[0024] 在本發(fā)明所述的大麗輪枝菌的單抱分離純化方法中，步驟（6)所述將標(biāo)記的已萌 發(fā)產(chǎn)生芽管的單個分生抱子在PDA平板上培養(yǎng)時，使含有分生抱子的一面貼于PDA培養(yǎng)基 表面，在25°C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)7天。
[0025] 在本發(fā)明所述的大麗輪枝菌的單抱分離純化方法中，所用菌株為從感染棉花黃萎 病的棉花植株上分離得到的一株高致病大麗輪枝菌（Verticilliumd址liae)Vd991(中國 農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工所質(zhì)量與生物安全研究室）。
[0026] 本發(fā)明所述單抱分離純化方法不僅適用于大麗輪枝菌的單抱分離純化，對所有可 W產(chǎn)生小型分生抱子的真菌均適用。在本發(fā)明中，若所述產(chǎn)生小型分生抱子的其它真菌樣 品可W在發(fā)病部位直接獲得分生抱子，則可W省略和簡化病原真菌的分離培養(yǎng)過程。
[0027] 本發(fā)明中所述小型分生抱子是指與大麗輪枝菌分生抱子 (2. 3-8. 7ymX1. 5-3ym)大小類似或更小的分生抱子。
[0028] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有W下有益效果：
[0029] 本發(fā)明方法可操作性強(qiáng)，一般的技術(shù)人員經(jīng)簡單的培訓(xùn)即可掌握此項技術(shù)，適合 進(jìn)行大批量的實驗操作，并且此方法可控性較好、污染率低；此外本發(fā)明方法分離的培養(yǎng)物 由抱子直接產(chǎn)生，培養(yǎng)物與抱子的歸屬一致，能夠確認(rèn)分離的培養(yǎng)物為目標(biāo)真菌，分離結(jié)果 更加準(zhǔn)確可靠，分離成功率可達(dá)22%，并且可W完全避免出現(xiàn)單菌落但非單抱的情況，更加 保證了分離所得菌株的純度。
【附圖說明】
[0030] 圖1為本發(fā)明中水瓊脂圓柱體在載玻片上的放置情況。
[0031] 圖2為本發(fā)明中載玻片在培養(yǎng)皿內(nèi)的放置情況。
[0032] 圖3為本發(fā)明利用10X40倍顯微鏡觀察到的大麗輪枝菌的已萌發(fā)的單個分生抱 子。
[0033] 圖4為本發(fā)明對大麗輪枝菌菌株進(jìn)行單抱分離純化后得到的單個分生抱子經(jīng) 25C恒溫培養(yǎng)7天后菌落生長情況。
【具體實施方式】
[0034] 下面通過【具體實施方式】來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明 了，所述實施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。
[0035] 傷|| ^問向本去lif(Verticilliumdahliae)Vd991 白勺|^不旬'^胃會屯ih
[0036] 本實施例通過W下方法對從感染棉花黃