專利名稱：：類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白編碼序列及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及分子生物學、酶學、生理學以及基因工程等領域。具體地，本發(fā)明涉及一種在類番茄茄(SolanumlycopersicoidesDun.)中表達的抗大麗輪枝菌受體蛋白[VerticilliumdahliaeKleb.resistanceprotein(Ve)fromSolanumlycopersicoidesDun.，SlVe1]及其核酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白和核酸序列的制備方法和用途。
背景技術：
：由大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaeKleb.)等引起的黃萎病是一種世界范圍的頑固性維管束病害，嚴重為害棉花、番茄、茄子、馬鈴薯、苜蓿等重要農(nóng)作物的生長。作為一種土傳病害，黃萎病的寄主廣，危害重，化學防治成本高、效果差，并且存在食品安全性和生態(tài)安全性問題。選育抗黃萎病作物品種是黃萎病防治的根本途徑，但卻面臨育種周期長和抗黃萎病資源嚴重匱乏的限制，利用基因工程技術分離植物抗黃萎病基因并通過遺傳轉(zhuǎn)化創(chuàng)造作物抗黃萎病新材料，具有基因型資源廣泛、周期相對較短和不受生殖障礙限制等優(yōu)點，是抗黃萎病遺傳改良的一個重要方向。根據(jù)基因?qū)驅(qū)W說(Gene-for-geneTheory)，植物抗病基因R的產(chǎn)物即受體蛋白R與來自病原菌無毒基因Avr的直接或間接產(chǎn)物即Avr配體之間的原初識別，是介導植物抗病反應的根本分子機制。許多抗病和感病植物材料之間的本質(zhì)差異并不在于個別下游防衛(wèi)反應基因的有無，而在于負責原初識別的抗病基因的有無或啟動抗病信號傳導的機制上存在差異，所以克隆和利用受體蛋白類的抗病基因是植物抗病基因工程的核心內(nèi)容。采用類番茄茄的無菌苗，人工接種大麗輪枝菌誘導，構(gòu)建了一個全長cDNA文庫。首先從cDNA中經(jīng)PCR擴增獲得SlVe1的保守區(qū)685bp片斷，進而擴增得到主體編碼區(qū)2.9kb片斷，據(jù)此設計兩個正向引物和兩個反向引物，分別進行cDNA的3’和5’末端錨定擴增，再根據(jù)cDNA末端序列信息設計引物成功擴增出全長3400bp(不計poly(dA))的類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因SlVe1。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中提及的類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白SlVe1序列及其核酸序列。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一目的就是提供一種新的類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因(SlVe1)，該基因是一個抗大麗輪枝菌受體蛋白基因。本發(fā)明的第二目的是提供一種新的類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白(SlVe1)。本發(fā)明的第三目的是提供這種類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白多肽和編碼序列在利用轉(zhuǎn)基因技術改良植物抗病特別是抗黃萎病上的應用。在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸第23-3175位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQIDNO.3中從核苷酸第23-3175位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼具有SEQIDNO.4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQIDNO.3中從核苷酸第23-3175位的核苷酸序列。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離出的類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白質(zhì)多肽，它包括具有SEQIDNO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQIDNO.4序列的多肽。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。在實例中該宿主細胞是煙草。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種利用轉(zhuǎn)基因技術將編碼具有類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白活性多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化入植物以提高植物抗病能力的方法，其步驟如下(1)將編碼具有類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白活性的多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于植物表達調(diào)控序列，形成含類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因的植物表達載體，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸第23-3175位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，將含表達載體的農(nóng)桿菌同真核宿主細胞如植物細胞共培養(yǎng)，在22-28℃條件下，暗培養(yǎng)1-2天后，通過篩選如抗生素篩選，獲得含有類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因的轉(zhuǎn)化細胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。含有類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因的轉(zhuǎn)基因植株對植物病害具有增強的抗性作用。較佳地，在該方法中使用的核酸序列具有SEQIDNO.3中第23-3175位的序列。在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。在本發(fā)明中，術語“類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQIDNO.3中第23-3175位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQIDNO.3序列的編碼框第23-3175位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQIDNO.3中第23-3175位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQIDNO.4所述的序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQIDNO.3中從核苷酸第23-3175位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQIDNO.3中從核苷酸第23-3175位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。該術語還包括能編碼具有與天然的類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白相同功能的蛋白的SEQIDNO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)；若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。在本發(fā)明中，術語“類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白或多肽”指具有類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白活性的SEQIDNO.4序列的多肽。該術語還包括具有與天然類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白相同功能的、SEQIDNO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術語還包括類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白的活性片段和活性衍生物。本發(fā)明的類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊條件下能與類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。在本發(fā)明中，“類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白保守性變異多肽”指與SEQIDNO.4的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行替換而產(chǎn)生。表1發(fā)明還包括類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白多肽時，可以將類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白編碼序列可操作地連于表達調(diào)控序列，從而形成類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白表達載體。如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本發(fā)明中，術語“宿主細胞”為真核細胞。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、煙草細胞和其它植物細胞。還可用Northern印跡法技術分析類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因產(chǎn)物的表達，即分析類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因的RNA轉(zhuǎn)錄物在細胞中的存在與否和數(shù)量。此外，根據(jù)本發(fā)明的類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達蛋白質(zhì)的同源性基礎上，篩選類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白同源基因或同源蛋白。為了得到與類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因相關的類番茄茄cDNAs的點陣，可以用DNA探針篩選類番茄茄cDNA文庫，這些探針是在低嚴緊條件下，用32P對類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白的全部或部分做放射活性標記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫是來自類番茄茄的文庫。構(gòu)建來自感興趣的細胞或者組織的cDNA文庫的方法是分子生物學領域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫也可以購買到，例如購自Clontech，Stratagene，PaloAlto，Cal.。這種篩選方法可以識別與類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因相關的基因家族的核苷酸序列。本發(fā)明的類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。此外，還可用人工化學合成的方法來合成有關序列。在本申請之前，現(xiàn)有技術已完全可以通過先合成多個多核苷酸小片段，然后再進行連接而獲得編碼本發(fā)明類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白的核酸序列。然后，可將該核酸序列引入本領域中各種現(xiàn)有的DNA分子(如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-PhasePeptideSynthesis，WHFreemanCo.，SanFrancisco；MerrifieldJ.(1963)J.AmChem.Soc852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動進行。例如，可以用AppliedBiosystems的431A型肽合成儀(FosterCity，CA)來自動合成肽?？梢苑謩e化學合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學方法加以連接以產(chǎn)生全長的分子。利用本發(fā)明的類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。表2為本發(fā)明的類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白(SlVe1)與普通番茄抗黃萎病蛋白的核苷酸序列的同源比較(GAP)表。表3為本發(fā)明的類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白(SlVe1)與普通番茄抗黃萎病蛋白的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用氨基酸單字符標出，相似的氨基酸用“+”標出。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白(SlVe1)基因的克隆1.植物材料和RNA分離((PlantmaterialandRNAisolation)類番茄茄種系LA2386的種子由美國戴維斯加利福尼亞大學蔬菜作物系C.M.Rick番茄遺傳資源中心(C.M.RickTomatoGeneticResourcesCenter，Dept.VegetableCrops，UniversityofCalifornia，Davis，USA)的Chetelat博士惠贈。種子經(jīng)15％的次氯酸鈉消毒液浸種30min，在4次換水的滅菌蒸餾水中漂洗4h，然后接種到幾層滅菌濾紙中間于25℃催芽，萌發(fā)的種子播種到含有1∶1∶1比例壤土、蛭石和珍珠巖的培養(yǎng)罐中，保持于20℃和14h光/10h暗的條件待其出苗和生長，對再生植株進行大麗輪枝菌接種處理0、2、4、6、8、12、24、48、72、96和120小時后取植物根、莖、葉的混合樣抽提總RNA。RNA抽提采用TRIZOL試劑(GIBCOBRL，USA)根據(jù)其說明的方法進行。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計上測定RNA含量。2.大麗輪枝菌誘導的類番茄茄全長cDNA文庫的構(gòu)建(ConstructionofcDNAlibraryfromVerticilliumdahliae-inducedSolanumlycopersicoidesplantmaterials)鑒于普通番茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因Ve1的mRNA很長及在總mRNA中的豐度較低，我們構(gòu)建了類番茄茄的全長cDNA文庫。來自不同誘導時間的總RNA各取相等比例混合形成的250μg總RNA按試劑盒(OligotexmRNASpinColumn，QIAGEN)的方法過Oligotex層析柱，純化獲得的總mRNA馬上用于全長cDNA文庫構(gòu)建(SMARTcDNALibraryConstructionKit，CLONTECHLaboratories)。反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA一鏈經(jīng)LDPCR擴增文庫得到文庫cDNA雙鏈(dd-cDNA)，取5μLdd-cDNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后獲得一條分子量為約250bp-8kb大小的smear，豐度的重心在1000bp-4000bp左右)，說明合成的文庫dd-cDNA質(zhì)量是理想的。經(jīng)cDNA純化、SfiI酶切、cDNA的大小分級、目的cDNA最后與λ載體的兩臂(A、B)的連接，獲得的誘導全長cDNA文庫重組λ最后包裝到Stratagene公司的GoldenPackaging包裝蛋白中形成λ文庫，經(jīng)檢測其滴度達到1.2×106pfu·mL-1，重組率85.9％。3.類番茄茄中Ve同源基因保守區(qū)片斷的擴增(AmplificationofconservativefragmentofVehomologuefromSolanumlycopersicoides)根據(jù)普通番茄抗大麗輪枝菌受體蛋白Ve1的mRNA全長和來自馬鈴薯的幾條類似Ve基因3’近中部序列的EST在VectorNTISuite6上的多重比的結(jié)果，我們設計了一對擴增類番茄茄中Ve同源基因保守區(qū)的PCR引物FVE685(5’-GTTGTTGGAGGTCCTGAATGTTGGAAATAA-3’，SEQIDNO.1)和RVE685(5’-GTTTCCTTCAAAGGAATCTGCTGAGAATGT-3’，SEQIDNO.2)。50μL的反應體系中包括文庫dd-cDNA1μL，10×PCRbuffer5μL，25mmol·L-1MgCl23μL，10mmol·L-1dNTP1μL，10μmol·L-1FVE6851μL，10μmol·L-1RVE6851μL，TaqDNA聚合酶0.5μL(2.5單位)和ddH2O37.5μL?；靹蚝蟾采w1滴礦物油，PCR反應條件如下94℃預變性3min→35個擴增循環(huán)(94℃變性45sec→55℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃繼續(xù)延伸10min。獲得一條685bp的PCR擴增片斷。4.SlVe1主要編碼區(qū)2.9kb片斷的擴增(Amplificationof2.9kbfragmentofSlVe1codingregion)685bp片斷測序后經(jīng)多重比對和BLAST發(fā)現(xiàn)與Ve1基因具有高相似性(similarity)，所以根據(jù)Ve1的起始密碼區(qū)設計了一條上游引物FSLO(5’-ATGAAAATGATGGCAACTCTGTACT-3’)與RVE685聯(lián)合擴增SlVe1編碼區(qū)的主體片斷。50μLPCR的反應體系中包括文庫dd-cDNA1μL，10×LAPCRbufferwithMg2+5μL，10mmol·L-1dNTP2μL，10μmol·L-1FSLO2μL，10μmol·L-1RVE6852μL，LATaqDNA聚合酶0.5μL(2.5單位)和ddH2O37.5μL?；靹蚝蟾采w1滴礦物油，PCR反應條件如下94℃預變性3min→30個擴增循環(huán)(94℃變性60sec→52℃退火90sec→72℃延伸3min)→72℃繼續(xù)延伸10min。5.SlVe13’cDNA末端的擴增(Ampiificationof3’endofSlVe1)根據(jù)SlVe1主要編碼區(qū)2.9kb片斷的測序結(jié)果，設計了兩條擴增SlVe13’cDNA末端的PCR引物FSL3-1(5’-CGATTGGGAAGCTACAAATGCTTGAATCAC-3’)和FSL3-2(5’-CCACCTGTCCGGGGAGATCCCATCAGAGCT-3’)。引物FSL3-1與文庫試劑盒提供的CDSIII/3’PCRPrimer(5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3’)聯(lián)合進行SlVe13’cDNA末端的PCR初擴。50μL的反應體系中包括文庫dd-cDNA1μL，10×PCRbuffer5μL，25mmol·L-1MgCl23μL，10mmol·L-1dNTP1μL，10μmol·L-1FSL3-11μL，10μmol·L-1CDSIII/3’PCRPrimer1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL(2.5單位)和ddH2O37.5μL?；靹蚝蟾采w1滴礦物油，PCR反應條件如下94℃預變性3min→30個擴增循環(huán)(94℃變性1min→65℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃繼續(xù)延伸10min。初擴產(chǎn)物15μL經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，直接吸取0.25μL初擴產(chǎn)物為模板進入PCR巢式擴增，50μL的反應體系中包括初擴產(chǎn)物0.25μL，10×PCRbuffer5μL，25mmol·L-1MgCl23μL，10mmol·L-1dNTP1μL，10μmol·L-1FSL3-21μL，10μmol·L-1CDSIII/3’PCRPrimer1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL(2.5單位)和ddH2O38.25μL。混勻后覆蓋1滴礦物油，PCR反應條件如下94℃預變性3min→28個擴增循環(huán)(94℃變性1min→68℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃繼續(xù)延伸10min。6.SlVe15’cDNA末端的擴增(Amplificationof5’endofSlVe1)根據(jù)SlVe1主要編碼區(qū)2.9kb片斷的測序結(jié)果，設計了兩條擴增SlVe15’cDNA末端的PCR引RSL5-1(5’-CCATCAAGGTAAAGCTCTCTAAGCTCTG-3’)andRSL5-2(5’-GAGTTCTCAATGAAATGTCTCAAATTGGGA-3’)。采用RSL5-1與文庫試劑盒提供的5’PCRPrimer(5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’)聯(lián)合進行SlVe15’cDNA末端的PCR初擴。50μL的反應體系中包括文庫dd-cDNA1μL，10×PCRbuffer5μL，25mmol·L-1MgCl23μL，10mmol·L-1dNTP1μL，10μmol·L-1RSL5-11μL，10μmol·L-15’PCRPrimer1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL(2.5單位)和ddH2O37.5μL?；靹蚝蟾采w1滴礦物油，PCR反應條件如下94℃預變性3min→30個擴增循環(huán)(94℃變性1min→60℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃繼續(xù)延伸10min。初擴產(chǎn)物15μL經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，直接吸取0.25μL初擴產(chǎn)物為模板進入PCR巢式擴增，50μL的反應體系中包括初擴產(chǎn)物0.25μL，10×PCRbuffer5μL，25mmol·L-1MgCl23μL，10mmol·L-1dNTP1μL，10μmol·L-1RSL5-21μL，10μmol·L-15’PCRPrimer1μL，TaqDNA聚合酶0.5μL(2.5單位)和ddH2O38.25μL?；靹蚝蟾采w1滴礦物油，PCR反應條件如下94℃預變性3min→28個擴增循環(huán)(94℃變性1min→60℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃繼續(xù)延伸10min。7.SlVe1cDNA全長的擴增(Cloningoffull-lengthSlVe1cDNA)將上面測序得到的SlVe1cDNA5’末端、3’末端及2.9kb主體編碼區(qū)序列在VectorNTISuite6上經(jīng)拼接而成SlVe1cDNA全長contig。我們據(jù)此序列設計了一對擴增SlVe1cDNA全長(不含poly(dA)尾)的PCR引物FSL1(5’-CATATTCAAGCTAACAAGTTGCATGAAA-3’)和RSL1(5’-AAGCCATAATAAGTTTGGGATATCATTA-3’)。50μL的反應體系中包括文庫dd-cDNA1μL，10×LAPCRbufferwithMg2+5μL，10mmol·L-1dNTP2μL，10μmol·L-1FSL12μL，10μmol·L-1RSL12μL，LATaqDNA聚合酶0.5μL(2.5單位)和ddH2O37.5μL?；靹蚝蟾采w1滴礦物油，PCR反應條件如下94℃預變性3min→30個擴增循環(huán)(94℃變性1min→55℃退火1min→72℃延伸4min)→72℃繼續(xù)延伸10min。BLAST的結(jié)果證明從類番茄茄中新得到的基因確為一個與植物抗黃萎病相關的基因。因此通過研究最終獲得了類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白的全長編碼序列(SEQIDNO.3)。實施例2類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白(SlVe1)基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白(SlVe1)全長cDNA的長度為3400bp(不計polyA)，詳細序列見SEQIDNO.3，其中開放讀框位于23-3175位核苷酸。根據(jù)全長cDNA推導出SlVe1編碼的氨基酸序列，共1050個氨基酸殘基，分子量為116.97kDa，等電點(pI)為5.22。詳細序列見SEQIDNO.3。將類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白的全長cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與普通番茄抗黃萎病基因(AF272307)在核苷酸水平上具有91％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它與普通番茄抗黃萎病蛋白(AAK58682)也有84％的相同性(附表3)。由此可見，類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因與普通番茄抗黃萎病蛋白基因無論在核酸還是在蛋白水平上都存在較高的同源性，故可以認為類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因在抗黃萎病上也具有相似的作用。實施例3類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白(SlVe1)基因的在類番茄茄中的拷貝數(shù)分析采用常規(guī)方法從類番茄茄葉片中提取DNA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分別用DraI，EcoRV和HindIII酶切DNA[13μg(微克)/樣品]后，將DNA轉(zhuǎn)至雜交膜(尼龍膜)上。采用AmershamPharmacia公司的GeneImagesTMContentsCDP-StarTMlabelingmodule(PRN3540)雜交及檢測系統(tǒng)以SlVe1基因部分編碼序列(685bp，利用FVE685和RVE685為引物經(jīng)PCR擴增類番茄茄cDNA得到)為探針對雜交膜進行雜交(于60℃雜交16小時)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同樣15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照RocheDIGlabeled試劑盒說明書)。結(jié)果(Southernblot)發(fā)現(xiàn)在雜交膜上出現(xiàn)2-3雜交條帶(附圖1)，說明類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因在類番茄茄中屬于低拷貝基因。實施例4類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白在煙草細胞中進行真核細胞表達及轉(zhuǎn)基因植株的抗病性(抗黃萎病性)鑒定含目的基因(類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因SlVe1)的表達載體的構(gòu)建含目的基因(類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因)的表達載體的構(gòu)建，根據(jù)類番茄茄抗大麗輪枝菌受體的全長序列(SEQIDNO.3)，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴增后，將類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進一步克隆到雙元表達載體pCAMBIA2301中，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，獲得含有類番茄茄抗大麗輪枝菌受體基因SlVe1表達載體pSL1(附圖2)的農(nóng)桿菌EHA105(pSL1)，利用葉盤法技術轉(zhuǎn)化煙草。利用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草1.用無菌牙簽挑取YEB選擇平板上的陽性菌落，接種于2mlYEB液體(Sm+，Kan+)，28度，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時；2.室溫下4,000g離心10min；3.棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600＝0.5左右；4.取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1平方厘米見方的小葉片；5.將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5min，在無菌濾紙上吸干菌液；6.把經(jīng)侵染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)48小時；7.將葉片轉(zhuǎn)到愈傷培養(yǎng)基(MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+Kan50mg/L+cb250mg/L)上，25-28℃光照下培養(yǎng)，7-15天可見愈傷組織的形成；8.約20天后可見分化芽長出，待芽長大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan25mg/L)上進行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；9.待根系生長發(fā)達后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。利用Southernblot檢測類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因(SlVe1)是否已整合入植物(煙草)基因組中采用常規(guī)方法從轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓曛刑崛NA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，用SacI酶切植物DNA[8μg(微克)/樣品]后，將DNA轉(zhuǎn)至雜交膜(尼龍膜)上，采用AmershamPharmacia公司的GeneImagesTMContentsCDP-StarTMlabelingmodule(PRN3540)雜交及檢測系統(tǒng)以SlVe1基因部分編碼序列(685bp，利用FVE685和RVE685為引物經(jīng)PCR擴增類番茄茄cDNA得到)為探針對雜交膜進行雜交(于60℃雜交16小時)。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同樣15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照RocheDIGlabeled試劑盒說明書)。結(jié)果(Southernblot)發(fā)現(xiàn)，不同轉(zhuǎn)基因植株具有不同的雜交帶型，證明SlVe1基因已整合入煙草基因組中，且所獲得的轉(zhuǎn)基因植株為不同的獨立轉(zhuǎn)基因植株(附圖3。1非轉(zhuǎn)基因植株；2-4不同的轉(zhuǎn)基因植株)。為了研究外源基因(SlVe1)在轉(zhuǎn)基因植株中是否表達，對轉(zhuǎn)基因植株進一步進行了Northernblot分析。利用Northernblot檢測類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白(SlVe1)在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達1.RNA的提取制備參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)2.RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計測OD260；RNA含量計算1OD260＝40μg/ml。3總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml25*電泳緩沖液，假如117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液張，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55℃水浴中。3)于通風櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(30μg)溶解于15mlRNA稀釋溶液中，在55℃-65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2μl10*上樣緩沖液，混勻。9)在電泳液未蓋過膠的條件下點樣，80V電壓電泳10分鐘，待樣品全部進入膠后，加電泳液蓋過膠面約半厘米。80-100V電泳5小時。4.RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤的膜準確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時。4)轉(zhuǎn)移后，將膜于80℃烘烤1-2小時。5.膜上RNA的檢測1)將膜浸在4*SSC中10分鐘，取出膜置濾紙上吸去多余的液體，將膜放入預雜交液中(50％甲酰胺，5*SSC，50mmol/L磷酸鈉(pH6.4)，5*Denhart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA)，42℃下預雜交過夜。2)倒出預雜交液，換入等量的雜交液，將用32P標記的DNA探針(SlVe1基因部分編碼序列，685bp，利用FVE685和RVE685為引物經(jīng)PCR擴增類番茄茄cDNA得到)在沸水中變性5分鐘，加入雜交液(50％甲酰胺，5*SSC，50mmol/L磷酸鈉(pH6.4)，10％葡聚糖硫酸脂，1*Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA)中，于42℃雜交24-48小時。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于42℃漂洗3次，每次5分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于55℃-65℃漂洗1-3次。4)用X光片壓片1-7天，然后顯影、定影。結(jié)果(Northernblot)發(fā)現(xiàn)，類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因(SlVe1)在不同轉(zhuǎn)基因植株中的表達量不同(附圖4。1非轉(zhuǎn)基因植株；2-4不同轉(zhuǎn)基因植株)，因此Northernblot分析證實了類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因(SlVe1)在轉(zhuǎn)基因植株中的表達。表達類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因(SlVe1)的轉(zhuǎn)基因植株的抗病性鑒定鑒于編碼抗大麗輪枝菌受體蛋白如番茄的抗大麗輪枝菌受體蛋白的基因已被證明對植物病害特別是黃萎病具有抗性，而類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白(SlVe1)與番茄的抗大麗輪枝菌受體蛋白具有較高的同源性，我們進一步對表達類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白的轉(zhuǎn)基因植株進行黃萎病抗性鑒定。接種大麗輪枝菌菌液3周后調(diào)查發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株的受害程度比對照明顯輕，少數(shù)植株未發(fā)現(xiàn)明顯癥狀，且轉(zhuǎn)基因植株對大麗輪枝菌的抗性與SlVe1的mRNA表達量成正相關，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓昶毡榘l(fā)病，表現(xiàn)出極度萎蔫(附圖5)。研究證明，類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因(SlVe1)對黃萎病確有抗性，因此類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因(SlVe1)可應用于利用轉(zhuǎn)基因技術改良植物抗病性特別是抗黃萎病的研究和產(chǎn)業(yè)化中。表291％identityin3207ntoverlapQuery1catattcaagctaacaagttgcatgaaaatgatgacaactctgtacttcc-tatggcttc59|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1472catattcaagctaacaagttgcatgaaaatgatggcaactctgtacttccctatgg-ttc1530Query60tcttggttcccttgtttcaaatcctgtcaggaaatgacattttcttggtttcctctcaat119|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1531tcttgattccctcgtttcaaatcttatcaggataccacattttcttggtttcctctcaat1590Query120gtcttgatgatcaaaagtcattgttgctgcagttgaagggcagcttccaatatgattcta179|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct1591gccttgacgatcaaaagtcattgttgctgcagtttaagggaagcctccaatatgattcta1650Quer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ccacttggacctttcagacaaccaaatacggggggcaataccaaatt1739||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct3151agtcatggatgatgcacttagacctttcagacaaccaaatattgggggcaataccaaatt3210Query1740ggatttggggaattggtgatcaaggtttgactcacctgaacctttccttcaatcagctgg1799|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct3211ggatctggggaattggtggtggaggtctcacccacctgaatctttcattcaatcagctgg3270Query1800agtacatggaacaaccttacactgcttccagcaatcttgtagtgcttgacttgcatacca1859|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct3271agtacgtggaacagccttacactgcttccagcaatcttgtagtccttgatttgcattcca3330Query1860accgtttgaaaggtgacttactaattccaccttcctctcccatctatgtggattactcga1919|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct3331accgtttaaaaggtgacttactaataccaccttgcactgccatctatgtggactactcta3390Query1920gcaataattcaaataattccatcccactagatattggaaagtctcttggttttgcctcct1979||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct3391gcaataatttaaacaattccatcccaacagatattggaaagtctcttggttttgcctcct3450Query1980ttttctcggtagcaaacaatggcattactggaataattcctgaatccatatgcgatgtca2039||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct3451ttttctcggtagcaaacaatggcattactggaataattcctgaatccatatgcaactgca3510Query2040gctaccttcaaattcttgatttctctaacaacgccttgagtggaacaataccaccatgtc2099||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct3511gctaccttcaagttcttgatttctctaacaatgccttgagtggaacaataccaccatgtc3570Query2100tactggaatatagtacaactcttggagtgctgaatctagggaacaatagactccatggtg2159|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct3571tactggaatatagtacaaaacttggagtgctgaatcttgggaacaataaactcaatggtg3630Query2160ttattccagattcatttccgattgattgtgctctaaatactctagacctcagtgagaata2219|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct3631ttataccagattcattttcaattggttgtgctctacaaacattagacctcagtgcgaata3690Query2220agttacaaggtaggctgccaaaatcgcttgtgaactgcaagttgttggaggtcctgaatg2279|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct3691acttacaaggcaggctgccaaaatcgattgtgaattgtaagttgttggaggtcctgaatg3750Query2280ctggaaataacagacttgttgatcatttcccatgcatgctgaggaactcaaacagtctga2339||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct3751ttggaaataacagacttgttgatcatttcccatgcatgttgaggaactcaaacagtctga3810Query2340gggtccttgtcttgcgctccaatcaattcagtggaaatcttcagtgtgaagtaaccataa2399||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct3811gggtcctagtcttgcgctccaataaattctatggaaatcttatgtgtgatgtaaccagaa3870Query2400atagctggccaaatctccagatcatagatatagcttccaacaacttcactggtgtgttga2459||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct3871atagctggcagaatctccagatcatagatatagcttccaacaacttcactggtgtgttga3930Query2460atgcagaattcttttcaaattggagaggaatgatggttgcagatgattacgtggagacag2519||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct3931atgcagaattcttttcaaattggagaggaatgatggttgcagatgattacgtggagacag3990Query2520gacgcaatcatatccagtataagttcttcgaactaagtaacatgtactatcaggacacag2579|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct3991gacgcaatcatatccagtatgagttcttacaactaagtaaattgtactatcaggacacag4050Query2580tgacattaaccatcaaaggcatggagctggagcttgtgaagattctcagggtcttcacat2639||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct4051tgacattaaccatcaaaggcatggagctggagcttgtgaagattctcagggtcttcacat4110Query2640ctattgatttctcttcaaatagatttcaaggagcgataccagatactatcgggaatctca2699||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct4111ctattgatttctcttccaatagatttcaaggagcgataccagatgctatcgggaatctca4170Query2700gctcactttatgttctgaacttgtcacacaatgcccttgagggaccaatcccaaaatcga2759||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct4171gctcactttatgttctgaatctgtcacacaatgcccttgagggaccaatcccaaaatcga4230Query2760ttgggaagctacaaatgcttgaatcactagacctgtcaagaaaccacctgtccggggaga2819|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct4231ttgggaagctacaaatgcttgaatcactagacctgtcaacaaaccacctgtccggggaga4290Query2820tcccatcagagcttgcaagtctcacattcttagcagctttgaacttatcgttcaacaaat2879||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct4291tcccatcagagcttgcaagtctcacattcttagcagctttgaacttatcgttcaacaaat4350Query2880tttttggcaaaatcccatcaactaatcagtttcaaacattctcagcagattcctttgaag2939||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct4351tgtttggcaaaattccatcaactaatcagtttcaaacattctcagcagattcctttgaag4410Query2940gaaacagtggcctatgcggtctccctctcaacgacagttgtcagagcaatgg------tt2993||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct4411gaaacagtggcctatgcgggctccctctcaacaacagttgtcaaagcaatggctcagcct4470Query2994cggagtccctgcctccactaacttcgcaatcagactcagatgatgaatggaagttcattt3053||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct4471cagagtccctgcctccaccaactccgctaccagactcagatgatgaatgggagttcattt4530Query3054ttgcagcagttggatacttagtaggggcagcaaacaccatttcacctctgtggttttacg3113|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct4531ttgcagcagttggatacatagtaggggcagcaaatactatttcagttgtgtggttttaca4590Query3114agcccgtgaagaaatggtttgataagcatgcggagaaatggttgctttggttttcaagaa3173||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct4591agccagtgaagaaatggtttgataagcatatggagaaatgcttgctttggttttcaagaa4650Query3174tgtgatccttaaacccataactaatgagtttatt3207||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct4651agtgattattaaacccataaataatgagtttatt4684Query類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因的核苷酸序列Sbjct普通番茄抗黃萎病基因核苷酸序列(AF272367)表384％identityin1050aaoverlap，88％similarityin1050aaoverlapQuery1MKMMTTXXXXXXXXXXXXXXXSGNDIFLVXXXXXXXXXXXXXXXXGSFQYDSTLSNKLER60MKMMTSGIFLVGSQYDSTLSKL+Sbjct1MKMMATLYFPMVLLIPSFQILSGYHIFLVSSQCLDDQKSLLLQFKGSLQYDSTLSKKLAK60Query61WNHNTSECCNWNGVTCDLSGHVIALELDDEKISSGIENASALFSLQYLESLNLAYNKFNV120WNTSECCNWNGVTC+LGHVIALELDDEISSGIEN+SALFSLQYLESLNLANFNVSbjct61WNDMTSECCNWNGVTCNLFGHVIALELDDETISSGIENSSALFSLQYLESLNLADNMFNV120Query121GIPVGIGNLTNLKYLNLSNAGFVGQIPMMLSRLTRLVTLDLSTLFPDFDQPLKLENPNLR180GIPYGINLTNLKYLNLSNAGFVGQIP+LSRLTRLVTLDLST+PFDQPLKLENPNLSbjct121GIPVGIDNLTNLKYLNLSNAGFVGQIPITLSRLTRLVTLDLSTILPFFDQPLKLENPNLS180Query181HFIENSTELRELYLDGVDLSAQRTDWCQSLSSYLPNLTVLSLCACQISGPIDESLSKLQI240HFIENSTELRELYLDGVDLS+QRT+WCQSLS+LPNLTVLSLCQISGP+DESLSKLSbjct181HFIENSTELRELYLDGVDLSSQRTEWCQSLSLHLPNLTVLSLRDCQISGPLDESLSKLHF240Query241LSIIRLERNNLSTTVPGYFANFTNLTTLSLDSCNLQGAFPKKIFQVQVLESLDLSNNKLL300LS++L++NNLS+TVPYFANF+NLTTL+LSCNLQGFP++IFQVVLESLDLSNKLLSbjct241LSFVQLDQNNLSSTVPEYFANFSNLTTLTLGSCNLQGTFPERIFQVSVLESLDLSINKLL300Query301SGSIPSFPRNGSLRRISLSYTNFSGSLPESISNLQNLSRLGLSDFNFNGPIPSTMANLIN360GSIPFRNGSLRRISLSYTNFSGSLPESISNQNLSRLLS+NFGIPSTMANLNSbjct301RGSIPIFFRNGSLRRISLSYTNFSGSLPESISNHQNLSRLELSNCNFYGSIPSTMANLRN360Query361LGYLDFSRNNFTGSIPHFQRSKKLTYLDLSRNGLTGLLSRAHFEGLSELVYINVGDNSLN420LGYLDFSNNFTGSIP+F+SKKLTYLDLSRNGLTGLLSRAHFEGLSELV+IN+G+NL+Sbjct361LGYLDFSFNNFTGSIPYFRLSKKLTYLDLSRNGLTGLLSRAHFEGLSELVHINLGNNLLS420Query421GTLPAYIFELPSLQQLFLNSNQFVGQVDEFRNASSSLLDTVDLRNNHLNGSIPKSTFEIG480G+LPAYIFELPSLQQLFLNQFVGQVDEFRNASSSLDTVDLNNHLNGSIPKSFEISbjct421GSLPAYIFELPSLQQLFLYRNQFVGQVDEFRNASSSPLDTVDLTNNHLNGSIPKSMFEIE480Query481RLKVLSLSSNFFSGTVTLDLIGRLNNLSRLELSYNNLTVDASSSNSTSFTFPQLSILKLA540RLKVLSLSSNFFGTVLDLIGRL+NLSRLELSYNNLTVDASSSNSTSFTFPQL+ILKLASbjct481RLKVLSLSSNFFRGTVPLDLIGRLSNLSRLELSYNNLTVDASSSNSTSFTFPQLNILKLA540Query541SCRLQKFPDLMNQSMMIHLDLSDNQIRGAIPNWIWGIGDQGLTHLNLSFNQLEYMEQPYT600SCRLQKFPDLNQSM+HLDLSDNQIGAIPNWIWGIGGLTHLNLSFNQLEY+EQPYTSbjct541SCRLQKFPDLKNQSWMMHLDLSDNQILGAIPNWIWGIGGGGLTHLNLSFNQLEYVEQPYT600Query601ASSNLVVLDLHTNRLKGDLLIPPSSPIYVDYXXXXXXXXIPLDIGKSLGFASFFSVANNG660ASSNLVVLDLH+NRLKGDLLIPP+IYVDYIPDIGKSLGFASFFSVANNGSbjct601ASSNLVVLDLHSNRLKGDLLIPPCTAIYVDYSSNNLNNSIPTDIGKSLGFASFFSVANNG660Query661ITGIIPESICDVSYLQILDFSNNALSGTIPPCLLEYSTTLGVLNLGNNRLHGVIPDSFPI720ITGIIPESIC+SYLQ+LDFSNNALSGTIPPCLLEYSTLGVLNLGNN+L+GVIPDSFISbjct661ITGIIPESICNCSYLQVLDFSNNALSGTIPPCLLEYSTKLGVLNLGNNKLNGVIPDSFSI720Query721DCALNTLDLSENKLQGRLPKSLVNCKLLEVLNAGNNRLVDHFPCMLRNSNSLRVLVLRSN780CALTLDLSNLQGRLPKS+VNCKLLEVLNGNNRLVDHFPCMLRNSNSLRVLVLRSNSbjct721GCALQTLDLSANNLQGRLPKSIVNCKLLEVLNVGNNRLVDHFPCMLRNSNSLRVLVLRSN780Query781QFSGNLQCEVTINSWPNLQIIDIASNNFTGVLNAEFFSNWRGMMVADDYVETGRNHIQYK840+FGNLC+VTNSWNLQIIDIASNNFTGVLNAEFFSNWRGMMVADDYVETGRNHIQY+Sbjct781KFYGNLMCDVTRNSWQNLQIIDIASNNFTGVLNAEFFSNWRGMMVADDYVETGRNHIQYE840Query841FFELSNMYYQDTVTLTIKGMELELVKILRVFTSIDFSSNRFQGAIPDTIGNLSSLYVLNL900F+LS+YYQDTVTLTIKGMELELVKILRVFTSIDFSSNRFQGAIPDIGNLSSLYVLNLSbjct841FLQLSKLYYQDTVTLTIKGMELELVKILRVFTSIDFSSNRFQGAIPDAIGNLSSLYVLNL900Query901SHNALEGPIPKSIGKLQMLESLDLSRNHLSGEIPSELASLTFLAALNLSFNKFFGKIPST960SHNALEGPIPKSIGKLQMLESLDLSNHLSGEIPSELASLTFLAALNLSFNKFGKIPSTSbjct901SHNALEGPIPKSIGKLQMLESLDLSTNHLSGEIPSELASLTFLAALNLSFNKLFGKIPST960Query961NQFQTFSADSFEGNSGLCGLPLNDSCQSNG--SESLPPLTSQSDSDDEWKFIFAAVGYLV1018NQFQTFSADSFEGNSGLCGLPLN+SCQSNGSESLPPTDSDDEW+FIFAAVGY+VSbjct961NQFQTFSADSFEGNSGLCGLPLNNSCQSNGSASESLPPPTPLPDSDDEWEFIFAAVGYIV1020Query1019GAANTISPLWFYEPVKKWFDKHAEKWLLWFSR1050GAANTIS+WFY+PVKKWFDKHEKLLWFSRSbjct1021GAANTISVVWFYKPVKKWFDKHMEKCLLWFSR1052Query類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白氨基酸序列Sbjct普通番茄抗黃萎病基因蛋白氨基酸序列(AAK58682)本發(fā)明涉及的序列及記號分列如下(1)SEQIDNO.1的信息(i)序列特征(A)長度30bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQIDNO.1GTTGTTGGAGGTCCTGAATGTTGGAAATAA(2)SEQIDNO.2的信息(i)序列特征(A)長度30bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQIDNO.2GTTTCCTTCAAAGGAATCTGCTGAGAATGT(3)SEQIDNO.3的信息(i)序列特征(A)長度3400bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型核苷酸(iii).序列描述SEQIDNO.31CATATTCAAGCTAACAAGTTGCATGAAAATGATGACAACTCTGTACTTCCTATGGCTTCT61CTTGGTTCCCTTGTTTCAAATCCTGTCAGGAAATGACATTTTCTTGGTTTCCTCTCAATG121TCTTGATGATCAAAAGTCATTGTTGCTGCAGTTGAAGGGCAGCTTCCAATATGATTCTAC181TTTGTCGAATAAATTGGAAAGATGGAACCACAACACAAGTGAATGTTGCAATTGGAATGG241GGTTACATGTGACCTCTCTGGTCATGTGATTGCCTTGGAACTGGATGATGAGAAAATTTC301TAGTGGAATTGAGAATGCAAGTGCTCTTTTCAGTCTTCAGTATCTTGAGAGCCTAAATTT361GGCTTACAACAAGTTCAATGTTGGCATACCAGTTGGTATAGGCAACCTCACCAACTTGAA421GTACCTGAATTTATCCAATGCCGGTTTTGTTGGCCAAATTCCTATGATGTTATCAAGGTT481AACAAGGCTAGTTACTCTTGATCTCTCAACTCTTTTCCCTGACTTTGACCAGCCACTTAA541ACTTGAGAATCCCAATTTGAGACATTTCATTGAGAACTCAACAGAGCTTAGAGAGCTTTA601CCTTGATGGTGTTGATCTTTCAGCTCAGAGGACTGACTGGTGTCAATCTTTATCTTCATA661TTTGCCTAACTTGACCGTCTTGAGTTTGTGTGCTTGTCAAATTTCAGGCCCTATTGATGA721ATCACTTTCTAAGCTTCAGATTCTCTCTATCATTCGTCTTGAACGGAACAATCTCTCTAC781CACAGTTCCAGGATATTTTGCCAATTTCACAAACTTGACTACCTTGTCCCTCGACTCTTG841TAATCTGCAAGGAGCTTTTCCTAAAAAGATCTTTCAGGTACAAGTTTTAGAGAGTTTGGA901CTTGTCAAATAACAAGTTGCTTAGTGGTAGTATTCCGAGTTTTCCTCGAAATGGATCTTT961GAGGAGGATATCACTAAGCTACACCAACTTTTCGGGTTCATTACCAGAGTCCATTTCGAA1021CCTTCAGAACCTGTCCAGGTTAGGGCTTTCTGATTTCAATTTCAATGGACCAATACCTTC1081CACAATGGCAAACCTTATCAATCTTGGTTATTTGGACTTCTCCCGGAACAACTTCACTGG1141TTCTATCCCACATTTTCAACGGTCCAAGAAACTCACCTACTTGGACCTTTCACGTAATGG1201TCTAACTGGTCTCTTATCTAGAGCTCATTTTGAAGGACTCTCAGAGCTTGTCTACATAAA1261TGTAGGGGACAATTCACTCAACGGAACCCTTCCTGCATATATATTTGAGCTCCCCTCCTT1321GCAGCAGCTTTTTCTTAACAGCAATCAATTTGTTGGCCAAGTCGACGAATTCCGCAATGC1381ATCCTCCTCTCTGTTGGATACAGTTGATCTAAGAAACAACCACCTGAATGGATCGATTCC1441CAAGTCCACATTTGAAATTGGCAGGCTTAAGGTCCTCTCACTTTCTTCCAACTTCTTTAG1501CGGGACAGTGACCCTTGATCTCATTGGGAGGCTGAACAACCTTTCAAGACTGGAGCTTTC1561TTACAATAACTTGACTGTTGATGCAAGTAGCAGCAATTCAACCTCTTTCACATTTCCTCA1621GTTGAGCATATTGAAATTAGCTTCTTGCCGGTTGCAAAAGTTCCCTGATCTCATGAATCA1681GTCAATGATGATCCACTTGGACCTTTCAGACAACCAAATACGGGGGGCAATACCAAATTG1741GATTTGGGGAATTGGTGATCAAGGTTTGACTCACCTGAACCTTTCCTTCAATCAGCTGGA1801GTACATGGAACAACCTTACACTGCTTCCAGCAATCTTGTAGTGCTTGACTTGCATACCAA1861CCGTTTGAAAGGTGACTTACTAATTCCACCTTCCTCTCCCATCTATGTGGATTACTCGAG1921CAATAATTCAAATAATTCCATCCCACTAGATATTGGAAAGTCTCTTGGTTTTGCCTCCTT1981TTTCTCGGTAGCAAACAATGGCATTACTGGAATAATTCCTGAATCCATATGCGATGTCAG2041CTACCTTCAAATTCTTGATTTCTCTAACAACGCCTTGAGTGGAACAATACCACCATGTCT2101ACTGGAATATAGTACAACTCTTGGAGTGCTGAATCTAGGGAACAATAGACTCCATGGTGT2161TATTCCAGATTCATTTCCGATTGATTGTGCTCTAAATACTCTAGACCTCAGTGAGAATAA2221GTTACAAGGTAGGCTGCCAAAATCGCTTGTGAACTGCAAGTTGTTGGAGGTCCTGAATGC2281TGGAAATAACAGACTTGTTGATCATTTCCCATGCATGCTGAGGAACTCAAACAGTCTGAG2341GGTCCTTGTCTTGCGCTCCAATCAATTCAGTGGAAATCTTCAGTGTGAAGTAACCATAAA2401TAGCTGGCCAAATCTCCAGATCATAGATATAGCTTCCAACAACTTCACTGGTGTGTTGAA2461TGCAGAATTCTTTTCAAATTGGAGAGGAATGATGGTTGCAGATGATTACGTGGAGACAGG2521ACGCAATCATATCCAGTATAAGTTCTTCGAACTAAGTAACATGTACTATCAGGACACAGT2581GACATTAACCATCAAAGGCATGGAGCTGGAGCTTGTGAAGATTCTCAGGGTCTTCACATC2641TATTGATTTCTCTTCAAATAGATTTCAAGGAGCGATACCAGATACTATCGGGAATCTCAG2701CTCACTTTATGTTCTGAACTTGTCACACAATGCCCTTGAGGGACCAATCCCAAAATCGAT2761TGGGAAGCTACAAATGCTTGAATCACTAGACCTGTCAAGAAACCACCTGTCCGGGGAGAT2821CCCATCAGAGCTTGCAAGTCTCACATTCTTAGCAGCTTTGAACTTATCGTTCAACAAATT2881TTTTGGCAAAATCCCATCAACTAATCAGTTTCAAACATTCTCAGCAGATTCCTTTGAAGG2941AAACAGTGGCCTATGCGGTCTCCCTCTCAACGACAGTTGTCAGAGCAATGGTTCGGAGTC3001CCTGCCTCCACTAACTTCGCAATCAGACTCAGATGATGAATGGAAGTTCATTTTTGCAGC3061AGTTGGATACTTAGTAGGGGCAGCAAACACCATTTCACCTCTGTGGTTTTACGAGCCCGT3121GAAGAAATGGTTTGATAAGCATGCGGAGAAATGGTTGCTTTGGTTTTCAAGAATGTGATC3181CTTAAACCCATAACTAATGAGTTTATTTAATCCTTGCTTTGTAGTATTAATAAACATCAG3241GATCCAAATTCAAGTTATTTCCCTTGATGAATGTATACAATCAGAAACAGCACCCACTTT3301TGGATTAAATAGCTTGAGTGGGATATAGTACATAGTATCAGACCACAGTGATCGAATCAT3361TGTCTTCATGCATAATGATATCCCAAACTTATTATGGCTT3400(4)SEQIDNO.4的信息(i)序列特征(A)長度1051氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型多肽(iii).序列描述SEQIDNO.41MKMMTTLYFLWLLLVPLFQILSGNDIFLVSSQCLDDQKSLLLQLKGSFQYDSTLSNKLER61WNHNTSECCNWNGVTCDLSGHVIALELDDEKISSGIENASALFSLQYLESLNLAYNKFNV121GIPVGIGNLTNLKYLNLSNAGFVGQIPMMLSRLTRLVTLDLSTLFPDFDQPLKLENPNLR181HFIENSTELRELYLDGVDLSAQRTDWCQSLSSYLPNLTVLSLCACQISGPIDESLSKLQI241LSIIRLERNNLSTTVPGYFANFTNLTTLSLDSCNLQGAFPKKIFQVQVLESLDLSNNKLL301SGSIPSFPRNGSLRRISLSYTNFSGSLPESISNLQNLSRLGLSDFNFNGPIPSTMANLIN361LGYLDFSRNNFTGSIPHFQRSKKLTYLDLSRNGLTGLLSRAHFEGLSELVYINVGDNSLN421GTLPAYIFELPSLQQLFLNSNQFVGQVDEFRNASSSLLDTVDLRNNHLNGSIPKSTFEIG481RLKVLSLSSNFFSGTVTLDLIGRLNNLSRLELSYNNLTVDASSSNSTSFTFPQLSILKLA541SCRLQKFPDLMNQSMMIHLDLSDNQIRGAIPNWIWGIGDQGLTHLNLSFNQLEYMEQPYT601ASSNLVVLDLHTNRLKGDLLIPPSSPIYVDYSSNNSNNSIPLDIGKSLGFASFFSVANNG661ITGIIPESICDVSYLQILDFSNNALSGTIPPCLLEYSTTLGVLNLGNNRLHGVIPDSFPI721DCALNTLDLSENKLQGRLPKSLVNCKLLEVLNAGNNRLVDHFPCMLRNSNSLRVLVLRSN781QFSGNLQCEVTINSWPNLQIIDIASNNFTGVLNAEFFSNWRGMMVADDYVETGRNHIQYK841FFELSNMYYQDTVTLTIKGMELELVKILRVFTSIDFSSNRFQGAIPDTIGNLSSLYVLNL901SHNALEGPIPKSIGKLQMLESLDLSRNHLSGEIPSELASLTFLAALNLSFNKFFGKIPST961NQFQTFSADSFEGNSGLCGLPLNDSCQSNGSESLPPLTSQSDSDDEWKFIFAAVGYLVGA1021ANTISPLWFYEPVKKWFDKHAEKWLLWFSRM105權利要求1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸第23-3175位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴緊條件下與SEQIDNO.3中從核苷酸第23-3175位的核苷酸序列雜交。2.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼具有SEQIDNO.4所示的氨基酸序列的多肽。3.如權利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQIDNO.3中從核苷酸第23-3175位的核苷酸序列。4.一種分離出的類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQIDNO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。5.如權利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQIDNO.4序列的多肽。6.一種載體，其特征在于，它包含權利要求1所述的DNA。7.一種用權利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞，其特征在于它是真核細胞。8.一種利用轉(zhuǎn)基因技術將編碼具有類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白質(zhì)活性多肽的核苷酸序列轉(zhuǎn)化入植物以提高植物抗病特別是抗黃萎病的方法，以及類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白基因在改良植物抗病性特別是抗黃萎病上的應用，特征在于其步驟如下(1)將編碼具有類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白質(zhì)活性的多肽的純化的核苷酸序列可操作地連于植物表達調(diào)控序列，形成含類番茄茄抗大麗輪枝菌受體蛋白質(zhì)的植物表達載體，所述的核苷酸序列與SEQIDNO.3中從核苷酸第23-3175位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)將步驟(1)中的表達載體轉(zhuǎn)入植物細胞；(3)通過篩選如抗生素篩選，獲得轉(zhuǎn)化細胞并最終再生轉(zhuǎn)基因植株及其后代，包括植物種子及植物組織。轉(zhuǎn)基因植物及其后代對植物病害特別是黃萎病具有增強的抗性。全文摘要本發(fā)明提供了一種在類番茄茄(SolanumlycopersicoidesDun.)中表達的新的抗大麗輪枝菌受體蛋白(S1Ve1)、編碼序列及其在改良植物抗病性特別是抗黃萎病上的應用。本發(fā)明涉及包含所說基因的融合基因構(gòu)建體，攜帶該構(gòu)建體的新的重組表達載體。還涉及被所說的表達載體轉(zhuǎn)化植物細胞，以及由轉(zhuǎn)化細胞產(chǎn)生的所說基因的轉(zhuǎn)基因植物及其后代，包括植物種子及植物組織。本發(fā)明將所說基因在植物中表達，所獲得的轉(zhuǎn)基因植物對植物病害特別是黃萎病具有增強的抗性。文檔編號C12N15/82GK1557952SQ20041001609公開日2004年12月29日申請日期2004年2月3日優(yōu)先權日2004年2月3日發(fā)明者唐克軒,柴有榮,孫小芬,左開井,李柱剛申請人:復旦大學