專利名稱：一種利用固定化細(xì)胞制備鳥苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用固定化微生物細(xì)胞制備鳥苷的方法，屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鳥苷是廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中的重要中間體，可用于合成阿昔洛韋、利巴 韋林等核苷類抗病毒藥物，也是用于制造5’ -鳥苷酸(5’ -GMP)、三氧唑核苷(ATC)、三磷酸 鳥苷鈉(GTP)等藥物的主要原料，同時(shí)它是繼味精之后的又一種廣泛應(yīng)用的新一代食品增 鮮劑，其市場(chǎng)前景十分廣闊。由于目前鳥苷生產(chǎn)基本上是采用發(fā)酵法進(jìn)行，所以發(fā)酵液中會(huì) 含有大量菌體蛋白和其它雜質(zhì)，不利于產(chǎn)物的分離純化，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用固定化微生物細(xì)胞制備鳥苷的方法，簡(jiǎn)化了工藝 過程，提高了底物的利用率，且有利于工業(yè)化生產(chǎn)過程中的自動(dòng)控制。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下在本發(fā)明中，用于鳥苷生產(chǎn)的菌種為枯草芽孢桿菌(B. subtilis)TA208。培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件(1)液體種子活化培養(yǎng)基(g/1000mL)葡萄糖5g，谷氨酸鈉 5g，蛋白胨 10g，酵母膏 10g，NaCl 2. 5g，pH7. 0-7. 2，121°C滅 菌，30min ；(2)搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)基(g/1000mL)葡萄糖20g，谷氨酸鈉5g，NaCl 2. 5g，尿素2g，蛋白胨10g，酵母膏10g，玉米漿 10g, ρΗ7· 0-7. 2，121°C滅菌，30min ；(3)發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液(g/1000mL)葡萄糖120-160，豆餅水解液 10-20，酵母粉 10-16，(NH4)2S0415, MgSO4 · 7H204， KH2P042，谷氨酸鈉 10，ρΗ7· 0 7· 2，121°C滅菌，30min。該利用固定化細(xì)胞制備鳥苷的方法，其步驟如下⑴菌種活化取經(jīng)冷凍干燥保藏的菌種枯草芽孢桿菌(B. subtilis)TA208用適量的無(wú)菌生理 鹽水溶解后，即接入液體種子培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)，然后取上述種子接入搖瓶培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò) 大培養(yǎng)；(2)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)與菌體細(xì)胞的收集將上述菌種接到搖瓶培養(yǎng)基中，裝液量為50-100mL/250mL三角瓶，接種量為 2% -10%，于 35°C -37°C、150r/min-200r/min 振蕩培養(yǎng) 18h_24h，然后將發(fā)酵液于 3000r/ min離心IOmin收集菌體；(3)菌體細(xì)胞固定化將所收集的菌體細(xì)胞和一定量的包埋劑混合均勻，滴入成型劑中固化成型，即得固定化菌體細(xì)胞；(4)鳥苷的轉(zhuǎn)化將上述固定化細(xì)胞膠體裝入固定床反應(yīng)器中，將發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液流經(jīng)該固定床反 應(yīng)器進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，收集流出的轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化液可重復(fù)流經(jīng)該固定床反應(yīng)器，直到培養(yǎng)液中 的底物被完全轉(zhuǎn)化成鳥苷；(5)鳥苷的分離純化將上述轉(zhuǎn)化液用活性炭脫色去除雜質(zhì)后，濃縮至合適濃度，結(jié)晶，即可得到鳥苷結(jié) 晶，結(jié)晶粗品可以通過重結(jié)晶進(jìn)行精制。上述步驟(3)中所述的包埋劑為海藻酸鈉；成型劑為氯化鈣溶液。上述步驟(3)中所述的包埋劑海藻酸鈉的濃度為1_5%，菌體細(xì)胞的量為 10-20%，成型劑氯化鈣的濃度為1-5%，固化時(shí)間為2-3h，固化溫度為30-40°C。上述步驟(4)中所述的固定床反應(yīng)器為內(nèi)徑40mm，高500mm，底部具砂芯及活塞的
玻璃管。上述步驟(4)中所述的發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液流速為500_1000mL/h，轉(zhuǎn)化溫度為 35-40 0C ο利用固定化細(xì)胞制備鳥苷的方法，可以方便地收集轉(zhuǎn)化液進(jìn)行鳥苷的制備，簡(jiǎn)化 了工藝過程，提高了底物的利用率，底物鳥苷轉(zhuǎn)化率在90%以上，產(chǎn)品得率高于80%，且有 利于工業(yè)化生產(chǎn)過程中的自動(dòng)控制。到目前為止，有關(guān)固定化細(xì)胞酶法制備鳥苷的方法未 見報(bào)道。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11.培養(yǎng)基(1) 一種液體種子活化培養(yǎng)基(g/1000mL)葡萄糖5g，谷氨酸鈉 5g，蛋白胨 10g，酵母膏 10g，NaCl 2. 5g，pH7. 0-7. 2，121°C滅 菌，30min ；(2) 一種搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)基(g/1000mL)葡萄糖20g，谷氨酸鈉5g，NaCl 2. 5g，尿素2g，蛋白胨10g，酵母膏10g，玉米漿 10g, ρΗ7· 0-7. 2，121°C滅菌，30min ；(3) 一種發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液(g/1000mL)葡萄糖120，豆餅水解液 10，酵母粉 16，(NH4) 2S0415，MgSO4 · 7H204，KH2P042，谷氨酸 鈉 10，ρΗ7· 0-7. 2，121°C滅菌，30min ；2.菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)與菌體細(xì)胞的收集取經(jīng)冷凍干燥保藏的枯草芽孢桿菌(B. subtilis)TA208用適量的無(wú)菌生理鹽水 溶解后，即接入液體種子培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)，然后取上述種子接入搖瓶培養(yǎng)基，搖瓶裝液量 為50-100mL/250mL三角瓶，接種量為5%，于37°C、180r/min振蕩培養(yǎng)24h，然后將發(fā)酵液 于3000r/min離心IOmin收集菌體；3.菌體細(xì)胞固定化將所收集的菌體細(xì)胞按1 5的比例與濃度為5%的海藻酸鈉包埋劑混合均勻，滴入濃度為5%的氯化鈣、溫度為40°C的成型劑中固化成型2h，即得固定化菌體細(xì)胞；4.鳥苷的轉(zhuǎn)化將上述固定化細(xì)胞裝入固定床反應(yīng)器中，將發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液流經(jīng)該固定床反應(yīng)器 進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液流控制為500mL/h，收集流出的轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化液可重復(fù)流經(jīng) 該固定床反應(yīng)器，直到培養(yǎng)液中的底物被完全轉(zhuǎn)化成鳥苷；5.鳥苷的分離純化將上述轉(zhuǎn)化液用活性炭脫色去除雜質(zhì)后，濃縮至合適濃度，結(jié)晶，即可得到鳥苷結(jié) 晶，結(jié)晶粗品可以通過重結(jié)晶進(jìn)行精制。實(shí)施例21.培養(yǎng)基一種液體種子活化培養(yǎng)基(g/1000mL)(1)葡萄糖 5g，谷氨酸鈉 5g，蛋白胨 10g，酵母膏 10g，NaCl 2. 5g，pH7. 0-7. 2，121°C 滅菌，30min ；(2) 一種搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)基(g/1000mL)葡萄糖20g，谷氨酸鈉5g，NaCl 2. 5g，尿素2g，蛋白胨10g，酵母膏10g，玉米漿 10g, ρΗ7· 0-7. 2，121°C滅菌，30min ；(3) 一種發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液(g/1000mL)葡萄糖150，豆餅水解液 12，酵母粉 15，(NH4)2S0415, MgSO4 · 7H20 4，KH2P042，谷氨 酸鈉 10，ρΗ7· 0-7. 2，121°C滅菌，30min ；2.菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)與菌體細(xì)胞的收集取經(jīng)冷凍干燥保藏的枯草芽孢桿菌(B. subtilis)TA208用適量的無(wú)菌生理鹽水 溶解后，即接入液體種子培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)，然后取上述種子接入搖瓶培養(yǎng)基，搖瓶裝液量 為50-100mL/250mL三角瓶，接種量為10%，于35°C、180r/min振蕩培養(yǎng)18h，然后將發(fā)酵液 于3000r/min離心IOmin收集菌體；3.菌體細(xì)胞固定化將所收集的菌體細(xì)胞按1 5的比例和濃度為5%的海藻酸鈉包埋劑混合均勻，滴 入濃度為5%的氯化鈣、溫度為35°C的成型劑中固化成型3h，即得固定化菌體細(xì)胞；4.鳥苷的轉(zhuǎn)化將上述固定化細(xì)胞裝入固定床反應(yīng)器中，將發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液流經(jīng)該固定床反應(yīng)器 進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液流控制為500mL/h，收集流出的轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化液可重復(fù)流經(jīng) 該固定床反應(yīng)器，直到培養(yǎng)液中的底物被完全轉(zhuǎn)化成鳥苷；5.鳥苷的分離純化將上述轉(zhuǎn)化液用活性炭脫色去除雜質(zhì)后，濃縮至合適濃度，結(jié)晶，即可得到鳥苷結(jié) 晶，結(jié)晶粗品可以通過重結(jié)晶進(jìn)行精制。實(shí)施例31.培養(yǎng)基(1) 一種液體種子活化培養(yǎng)基(g/1000mL)葡萄糖5g，谷氨酸鈉 5g，蛋白胨 10g，酵母膏 10g，NaCl 2. 5g，pH7. 0-7. 2，121°C滅 菌，30min ；
(2) 一種搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)基(g/1000mL)葡萄糖20g，谷氨酸鈉5g，NaCl 2. 5g，尿素2g，蛋白胨10g，酵母膏10g，玉米漿 10g, ρΗ7· 0-7. 2，121°C滅菌，30min ；(3) 一種發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液(g/1000mL)葡萄糖160，豆餅水解液 15，酵母粉 16，(NH4) 2S0415, MgSO4 · 7H20 4，KH2P042，谷氨 酸鈉 10，ρΗ7· 0-7. 2，121°C滅菌，30min ；2.菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)與菌體細(xì)胞的收集取經(jīng)冷凍干燥保藏的枯草芽孢桿菌(B. subtilis)TA208用適量的無(wú)菌生理鹽水 溶解后，即接入液體種子培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)，然后取上述種子接入搖瓶培養(yǎng)基，搖瓶裝液量 為50-100mL/250mL三角瓶，接種量為5%，于37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)18h，然后將發(fā)酵液 于3000r/min離心IOmin收集菌體；3.菌體細(xì)胞固定化將所收集的菌體細(xì)胞按1 5的比例和濃度為5%的海藻酸鈉包埋劑混合均勻，滴 入濃度為5%的氯化鈣、溫度為40°C的成型劑中固化成型2h，即得固定化菌體細(xì)胞；4.鳥苷的轉(zhuǎn)化將上述固定化細(xì)胞裝入固定床反應(yīng)器中，將發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液流經(jīng)該固定床反應(yīng)器 進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液流控制為800mL/h，收集流出的轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化液可重復(fù)流經(jīng) 該固定床反應(yīng)器，直到培養(yǎng)液中的底物被完全轉(zhuǎn)化成鳥苷；5.鳥苷的分離純化將上述轉(zhuǎn)化液用活性炭脫色去除雜質(zhì)后，濃縮至合適濃度，結(jié)晶，即可得到鳥苷結(jié) 晶，結(jié)晶粗品可以通過重結(jié)晶進(jìn)行精制。
權(quán)利要求
一種利用固定化細(xì)胞制備鳥苷的方法，其步驟如下(1)菌種活化取經(jīng)冷凍干燥保藏的菌種枯草芽孢桿菌(B.subtilis)TA208用無(wú)菌生理鹽水溶解，并接入液體種子培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)，然后取上述種子接入搖瓶培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)；(2)菌種擴(kuò)大培養(yǎng)與菌體細(xì)胞的收集將上述菌種接到搖瓶培養(yǎng)基中，裝液量為50 100mL/250mL三角瓶，接種量為5％ 10％，于35℃ 37℃、150r/min 200r/min振蕩培養(yǎng)18h 24h，然后將發(fā)酵液于3000r/min離心10min收集菌體；(3)菌體細(xì)胞固定化將所收集的菌體細(xì)胞和一定量的包埋劑混合均勻，滴入成型劑中固化成型，即得固定化菌體細(xì)胞；(4)鳥苷的轉(zhuǎn)化將上述固定化細(xì)胞膠體裝入固定床反應(yīng)器中，將發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液流經(jīng)該固定床反應(yīng)器進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，收集流出的轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化液可重復(fù)流經(jīng)該固定床反應(yīng)器，直到培養(yǎng)液中的底物被完全轉(zhuǎn)化成鳥苷；(5)鳥苷的分離純化將上述轉(zhuǎn)化液用活性炭脫色去除雜質(zhì)后，濃縮，結(jié)晶，即可得到鳥苷結(jié)晶，結(jié)晶粗品可以通過重結(jié)晶進(jìn)行精制。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用固定化細(xì)胞制備鳥苷的方法，其特征在于在步驟(3)中 所述的包埋劑為海藻酸鈉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用固定化細(xì)胞制備鳥苷的方法，其特征在于在步驟(3)中 所述的成型劑為氯化鈣溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用固定化細(xì)胞制備鳥苷的方法，其特征在于在步驟(3)中 所述的包埋劑海藻酸鈉的濃度為1_5%，菌體細(xì)胞的量為10-20%，成型劑氯化鈣的濃度為 1-5%，固化時(shí)間為2-3h，固化溫度為30-40°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用固定化細(xì)胞制備鳥苷的方法，其特征在于在步驟(4)中 所述的固定床反應(yīng)器為內(nèi)徑40mm，高500mm，底部具砂芯及活塞的玻璃管。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用固定化細(xì)胞制備鳥苷的方法，其特征在于在步驟(4)中 所述的發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液流速為500-1000mL/h，轉(zhuǎn)化溫度為35_40°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用固定化細(xì)胞生產(chǎn)鳥苷的方法，即采用固定化細(xì)胞將其裝入固定床反應(yīng)器中生產(chǎn)鳥苷。其特點(diǎn)是采用發(fā)酵轉(zhuǎn)化培養(yǎng)液作底物，將其通過含枯草芽孢桿菌(B.subtilis)TA208的固定化細(xì)胞，經(jīng)菌種活化、菌種擴(kuò)大培養(yǎng)與菌體細(xì)胞的收集、菌體細(xì)胞固定化、鳥苷的轉(zhuǎn)化和鳥苷的分離純化等步驟制備鳥苷。由于采用固定化細(xì)胞的方法，可以簡(jiǎn)便的收集轉(zhuǎn)化液進(jìn)行鳥苷的制備，簡(jiǎn)化了工藝過程，提高了底物的利用率，底物鳥苷轉(zhuǎn)化率在90％以上，產(chǎn)品得率高于80％，且有利于工業(yè)化生產(chǎn)過程中的自動(dòng)控制。
文檔編號(hào)C12N11/10GK101979646SQ20101053214
公開日2011年2月23日 申請(qǐng)日期2010年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月5日
發(fā)明者史詠華, 宋麗燕, 李盤欣, 段紅江, 邵偉, 韓曉凱 申請(qǐng)人:河南省南街村(集團(tuán))有限公司