碳青霉烯類抗生素耐藥基因檢測dna芯片的制備和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及碳青霉締類抗生素耐藥基因檢測DNA巧片的制備和用途，屬于基因巧 片檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 碳青霉締類抗生素具有廣譜、強效、對絕大多數(shù)0 -內(nèi)酷胺酶高度穩(wěn)定、對頭抱菌 素耐藥菌仍可發(fā)揮優(yōu)良抗菌作用的特點。細菌對該類藥物不存在交叉耐藥性，因而碳青霉 締類抗生素對革蘭氏陽性菌、陰性菌及厭氧菌都有強大的抗菌活性，是治療危重感染或初 始抗生素治療失敗的復(fù)雜感染的常用抗菌藥物之一。碳青霉締類抗生素在大多數(shù)情況下耐 受性良好，不良反應(yīng)發(fā)生率較低，適用于嚴重的革蘭陰性菌感染、混合感染、耐藥菌感染和 免疫缺陷者感染，在抗菌治療中基本處于最后一道防線的地位
[0003] 但隨著廣譜抗生素的廣泛使用，世界各地陸續(xù)出現(xiàn)了產(chǎn)碳青霉締酶菌株感染造成 的暴發(fā)流行，給臨床帶來了極大的麻煩，因其對臨床常用的廣譜抗生素均耐藥，由此引發(fā)的 感染往往無藥可救，病死率極高。而且耐藥菌株一旦無法及時清除，就有可能通過克隆傳播 引起交叉感染，至造成院內(nèi)感染的暴發(fā)流行。另外，由于腸桿菌科細菌對碳青霉締耐藥主要 由質(zhì)粒介導(dǎo)，耐藥基因容易隨質(zhì)粒在不同菌種之間傳播，造成耐藥性的擴散。因此快速、準 確的早期診斷是預(yù)防及控制耐藥株暴發(fā)流行、延緩耐藥性的發(fā)展的關(guān)鍵。常見的碳青霉締 類耐藥檢測方法有紙片擴散法、稀釋法、Etest(表型確認）、改良化dge實驗、自動化藥敏檢 測（V口EK2系統(tǒng)、抓化oenix、ATB系統(tǒng)）等。但紙片擴散法和稀釋法影響因素多，操作技 術(shù)誤差大；Etest和自動化藥敏檢測價格昂貴，抗生素選擇自由度差，不適用于基層臨床單 位開展。基因巧片技術(shù)具有快速、準確、低成本等特點，適用于碳青霉締類抗生素耐藥基因 的高通量檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于針對碳青霉締類抗生素耐藥檢測領(lǐng)域存在的一些不足，研制一 種高通量、特異、敏感、快速的碳青霉締類抗生素耐藥基因檢測DNA巧片，能同時檢測九種 常見的碳青霉締類耐藥基因，包括KPC、NDM-1、0XA-23、0XA-48、0XA-51、IMP、VIM、SIM、DIM， 為碳青霉締類抗生素耐藥的臨床診斷、表型確證及分子流行病學(xué)調(diào)查提供一種新的檢測手 段。
[0005] 為了達到上述目的，本發(fā)明碳青霉締類抗生素耐藥基因檢測DNA巧片，其制備方 法如下：
[000引 1.步驟一：制備碳青霉締類耐藥基因特異性引物
[0007]選擇碳青霉締類耐藥基因KPC、NDM-1、0XA-23、0XA-48、0XA-51、IMP、VIM、SIM、DIM作為檢測基因，優(yōu)選9對引物序列，如表1所示：
[000引表1弓I物序列及對應(yīng)的擴增祀標 [0009]
【主權(quán)項】
1. 一種檢測碳青霉烯類抗生素耐藥基因的DNA芯片，本發(fā)明的基因芯片可以用于同時 檢測耐藥基因KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、0XA-51、MP、SIM、VIM、DIM。其特征是包含檢測 碳青霉烯類抗生素常見耐藥基因的9對通用及特異性引物15條碳青霉烯類耐藥基因特異 性寡核苷酸探針；1條片基質(zhì)控探針和1條陰性對照探針和載體。上述探針分別分布在載 體上。 表1碳青霉烯類耐藥基因擴增引物
表2碳青霉烯類耐藥基因特異性寡核苷酸探針序列
2. 根據(jù)權(quán)利1所述的碳青霉烯類抗生素耐藥基因檢測DNA芯片，其特征是所述的載體 為醛基化修飾的玻璃片、硅片、聚苯乙烯基片、尼龍基片。
3. -種碳青霉烯類抗生素耐藥基因檢測DNA芯片的制備方法，包括以下步驟： 步驟一，探針和引物的設(shè)計：首先從NCBI基因數(shù)據(jù)庫中下載碳青霉烯類耐藥基因序 列，使用VectorNTIAdvancelO(invitrogen)軟件包中的AlignX程序按照默認的參數(shù)設(shè) 置對各碳青霉烯類耐藥基因序列進行全局比對。根據(jù)比對結(jié)果在基因序列的保守位置設(shè)計 特異性寡核苷酸探針、特異性引物。 步驟二，探針的合成，每條探針的3'端加入12個堿基T且3'末端T氨基修飾作為連 接臂，以使其能固定在醛基化修飾玻璃基片上；質(zhì)控探針除3'末端T進行氨基修飾外，5'端 同時標記生物素標記； 步驟三，芯片的制備：將合成后的探針用去離子水稀釋成100yM，分別取10yL探針溶 液，和10yL體積芯片點樣液混勻，使探針點樣終濃度為50yM，裝于384孔板，將芯片表面 貼上10樣品孔陣列膜，用芯片制備儀將探針點制在載體上，點樣過程中保持一定濕度，點 樣完成后將芯片置于干燥器中避光常溫靜置48h，使探針和芯片表面醛基共價結(jié)合，點制好 的芯片常溫干燥保存。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的碳青霉烯類抗生素耐藥基因檢測DNA芯片的制備和用途的制 備方法，其特征是步驟一中15條特異性寡核苷酸探針及9對引物，探針長度在33-42nt，引 物長度在16-20nt。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的碳青霉烯類抗生素耐藥基因檢測DNA芯片的制備和用途的 制備方法，其特征是步驟三中所述的載體為醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龍基 片。
6. 碳青霉烯類抗生素耐藥基因檢測DNA芯片的制備和用途的使用方法，其特征是包括 以下步驟： 1) 步驟一，細菌基因組DNA的提取，采用核酸裂解液與樣本按照1 : 1比例混合，提取 采用煮沸法，98°C水浴lOmin后置于4°C冰箱30min(期間每隔lOmin中晃動一下離心管）， 短暫離心，吸取上清液備用； 2) 步驟二，多重不對稱PCR擴增：擴增使用多重PCR體系，將整個擴增體系分為A、B兩 管。A管包括即(：、冊1-1、(《六-23、(《六-48、(《六-51、內(nèi)標一出管包括頂?、￥]、5]、0]、內(nèi) 標二。擴增按以下循環(huán)參數(shù)進行擴增：95°C預(yù)變性lOmin;95°C30s，55°C30s，72°C，60s，共 40個循環(huán)；72°C延伸5min;4°C保存或進行下一步實驗； 3) 步驟三，芯片雜交：將基因芯片分別置0.2%SDS和去離子水中分別清洗30s，離心 干燥；將步驟二得到的擴增產(chǎn)物在98°C變性5min后立即置于冰浴中5min，取變性的A管產(chǎn) 物2. 5yL和B管產(chǎn)物2. 5.yL與5yL雜交液混勻，加于芯片加樣孔使其均勻覆蓋于陣列 表面，將基因芯片放入雜交盒內(nèi)在45°C雜交lh; 4) 步驟四，雜交后清洗基因芯片：基因芯片雜交完成后，從雜交盒中取出芯片，并立即 依次在洗液1XSSC+0. 2%SDS、0. 2XSSC和0. 1XSSC中各清洗30s，最后將基因芯片表面 液體離心干燥； 5) 步驟五，樣品標記：向芯片加入10yL標記液，用移液器涂勻后將芯片放回雜交盒中 置37°C水浴中反應(yīng)30min，取出芯片以PBST清洗10s，離心干燥； 6) 步驟六，掃描：向芯片反應(yīng)區(qū)加入剛剛1 : 1混合的化學(xué)發(fā)光液A和B的混合溶液， 用移液器涂勻后立即置化學(xué)發(fā)光成像儀中掃描，成像模式為觸發(fā)模式，曝光參數(shù)511，增益 參數(shù)300,曝光時間10s，觸發(fā)次數(shù)1次； 7) 步驟六，數(shù)據(jù)分析：成像結(jié)束后使用化學(xué)發(fā)光分析軟件進行芯片探針信號分析。每 條探針的信號取其三個重復(fù)點的平均值，根據(jù)探針Cutoff值，探針信號值>該探針Cutoff 值的判讀為該探針信號陽性。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的碳青霉烯類抗生素耐藥基因檢測DNA芯片的使用方法，其特 征是步驟二中使用的用于擴增各碳青霉烯類耐藥基因的反向引物5'端進行修飾。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的反向引物5'端修飾分子可以是CY3、CY5、生物素。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的碳青霉烯類抗生素耐藥基因檢測DNA芯片的使用方法，其特 征是步驟三中使用的雜交液組分為8XSSC，0. 6%SDS，10%甲酰胺，lOXDenhardt。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的碳青霉烯類抗生素耐藥基因檢測DNA芯片的使用方法，其特 征是步驟六中使用的掃描方法，根據(jù)權(quán)利要求8中反向引物修飾分子的不同，掃描方法包 括熒光掃描，可見光掃描，化學(xué)發(fā)光成像。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種碳青霉烯類抗生素耐藥基因檢測DNA芯片的制備和用途，其制備方法包括制備九種碳青霉烯類耐藥基因特異性引物，制備九種碳青霉烯類抗生素耐藥基因特異性探針，制備寡核苷酸芯片，建立多重PCR體系，建立雜交體系。利用本發(fā)明制備的基因芯片可同時檢測九種常見的碳青霉烯類耐藥基因，包括KPC、NDM-1、OXA-23、OXA-48、OXA-51、IMP、VIM、SIM、DIM。該DNA芯片具有快速、準確、高通量、高特異的優(yōu)勢，可為碳青霉烯類抗生素耐藥表型的耐藥基因確認及分子流行病學(xué)調(diào)查提供一種新的檢測手段。
【IPC分類】C40B50-18, C12Q1-68, C40B40-06
【公開號】CN104774941
【申請?zhí)枴緾N201510162146
【發(fā)明人】王升啟, 宋燚, 劉琪琦, 陳蘇紅, 張敏麗
【申請人】中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月8日