一種用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物、探針和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因 的引物、探針和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 碳青霉烯類(lèi)抗生素抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)，殺菌作用快。碳青霉烯類(lèi)抗生素一直 以來(lái)是治療肺炎克雷伯菌等腸桿菌科細(xì)菌感染最有效的抗生素。近年來(lái)碳青霉烯水解酶 的出現(xiàn)使得碳青霉烯類(lèi)抗生素的耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，其中最典型的就是KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemases，肺炎克雷伯菌碳青霉稀酶）的產(chǎn)生是目前引起腸桿菌科細(xì)菌 對(duì)碳青霉烯類(lèi)抗生素耐藥的主要原因。
[0003] 隨著肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的感染率逐漸上升，臨床上采用改良的Hodge實(shí)驗(yàn) 進(jìn)行檢測(cè)，但是該方法的假陽(yáng)性率較高，而當(dāng)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶低水平表達(dá)時(shí)又會(huì) 產(chǎn)生假陰性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶不準(zhǔn)確的問(wèn)題，本發(fā)明實(shí)施例提 供了一種用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物、探針和試劑盒。所述技術(shù)方案如 下：
[0005] -方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物 和探針，所述引物和探針包括：用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物、用于檢 測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物和用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的 探針，其中，
[0006] 所述用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1 所示；
[0007] 所述用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2 所示；
[0008] 所述用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探針如序列表中SEQ ID NO. 3所 示；
[0009] 所述探針的5'端連接有熒光基團(tuán)FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3或Cy5,所述 探針的 3' 端連接有淬滅基團(tuán) TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
[0010] 另一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的試 劑盒，所述試劑盒包括上述引物和探針。
[0011]具體地，所述試劑盒還包括：核酸釋放劑、PCR反應(yīng)液、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控 品、陰性質(zhì)控品和工作標(biāo)準(zhǔn)品。
[0012] 具體地，所述工作標(biāo)準(zhǔn)品包括：工作標(biāo)準(zhǔn)品1、工作標(biāo)準(zhǔn)品2、工作標(biāo)準(zhǔn)品3和工作 標(biāo)準(zhǔn)品4,其中，
[0013] 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品1為IX 107拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片 段；
[0014] 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品2為IX 106拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片 段；
[0015] 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品3為IX 105拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片 段；
[0016] 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品4為IX 104拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片 段。
[0017] 具體地，所述陽(yáng)性質(zhì)控品為1. OX 106拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的 基因片段。
[0018] 具體地，所述正向引物和所述反向引物的終濃度均為0. 05-0. 9 yM，所述探針的終 濃度為 0.05-0. 9 yM。
[0019] 具體地，所述PCR反應(yīng)液各組分在PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系中包括：終濃度為0.01U/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、終濃度為0. 2~0. 6mM的dNTPs、10XPCR緩沖液和終濃度為 1. 5~5. OmM的含Mg離子的溶液。
[0020] 具體地，所述核酸釋放劑包括無(wú)菌水、終濃度為0. 03-0. 3 %的聚乙二醇辛基苯基 醚、終濃度為0. 04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH值為8. 3的終濃度為0. 01-0. 1M 的三（羥甲基）氨基甲烷。
[0021] 具體地，所述臨界陽(yáng)性質(zhì)控品為1. ox 104拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯 酶的基因片段。
[0022] 具體地，所述陰性質(zhì)控品為濃度0. 8%的生理鹽水。
[0023] 本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來(lái)的有益效果是：本發(fā)明實(shí)施例提供的用于檢測(cè) 肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物和探針，該引物和探針具有靈敏度高的特性，使得本 發(fā)明實(shí)施例提供的用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的試劑盒，也具有靈敏度高的特 性，該試劑盒采用儀器收集熒光信號(hào)，避免了肉眼判斷的主觀性，其檢測(cè)結(jié)果可靠，提高了 檢測(cè)的靈敏度，即使僅存在單拷貝的目的片段該試劑盒也可以進(jìn)行有效的檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他 的附圖。
[0025] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例2提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0026] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例3提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0027] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例4提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0028] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例5提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0029] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例5提供的熒光擴(kuò)增曲線圖；
[0030] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例5提供的由圖4得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，圖6橫坐標(biāo)為 LogStarting Quantity copy number，縱坐標(biāo)為 Threshold Cycle。
[0031] 圖中：Cycles 為循環(huán)數(shù)，RFU為焚光值，Log Starting Quantity copy number為肺 炎克雷伯菌碳青霉稀酶基因起始濃度的對(duì)數(shù)值，Ct (Threshold Cycle)值為循環(huán)數(shù)；la-實(shí) 施例2中樣品1，4a-實(shí)施例2中樣品4，5a-實(shí)施例2中樣品5，6a-實(shí)施例2中樣品6，7a-實(shí) 施例2中樣品7。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方 式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。以下實(shí)施例中所用試劑和探針主要購(gòu)自寶生物工程（大連）有限 公司。
[0033] 實(shí)施例1. 一種用于肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因核酸定量檢測(cè)的引物和探針 [0034] 本發(fā)明實(shí)施例提供了一種用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物和探針， 該引物和探針包括：用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物、用于檢測(cè)肺炎克 雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物和用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探針，其 中，
[0035] 用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所 示；
[0036] 用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物如序列表中SEQ ID N0. 2所 示；
[0037] 用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探針如序列表中SEQ ID N0. 3所示；
[0038] 探針的5'端連接有熒光基團(tuán)？411、冊(cè)乂、了￡1\1(^、￥1(：、1?(?、〇73或〇75，探針的3' 端連接有淬滅基團(tuán)TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、BHQ3或DABCYL。在本發(fā)明實(shí)施例中，探針 的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，F(xiàn)AM的激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，接收波長(zhǎng)為527nm ;淬滅基團(tuán)為Eclipse。 純化方式可選自：HAP、PAGE和HPLC純化方式，具體地引物和探針如下表：
[0039] 表1.肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物和探針
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物和探針，其特征在于，所述引物 和探針包括：用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物、用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌 碳青霉烯酶基因的反向引物和用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探針，其中， 所述用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物如序列表中SEQ ID NO. 1所 示； 所述用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物如序列表中SEQ ID NO. 2所 示； 所述用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探針如序列表中SEQ ID NO. 3所示； 所述探針的5'端連接有熒光基團(tuán)FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5,所述探針 的 3' 端連接有淬滅基團(tuán) TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3 或 DABCYL。
2. -種用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包 括如權(quán)利要求1所述的引物和探針。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括：核酸釋放劑、PCR反 應(yīng)液、臨界陽(yáng)性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和工作標(biāo)準(zhǔn)品。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述工作標(biāo)準(zhǔn)品包括：工作標(biāo)準(zhǔn)品1、工 作標(biāo)準(zhǔn)品2、工作標(biāo)準(zhǔn)品3和工作標(biāo)準(zhǔn)品4,其中， 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品1為IX IO7拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段； 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品2為I X IO6拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段； 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品3為I X IO5拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段； 所述工作標(biāo)準(zhǔn)品4為I X IO4拷貝/mL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陽(yáng)性質(zhì)控品為1.0 X 10 6拷貝/mL 的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述正向引物和所述反向引物的終濃 度均為0. 05-0. 9 y M，所述探針的終濃度為0. 05-0. 9 y M。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液各組分在PCR擴(kuò)增反應(yīng) 體系中包括：終濃度為0.0 lU/ y L~0. 05U/ y L的Taq酶、終濃度為0. 2~0. 6mM的dNTPs、 10XPCR緩沖液和終濃度為1. 5~5. OmM的含Mg離子的溶液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述核酸釋放劑包括無(wú)菌水、終濃度為 0.03-0. 3%的聚乙二醇辛基苯基醚、終濃度為0.04-0. 4%的壬基酚聚氧乙烯（40)醚和pH 值為8. 3的終濃度為0? 01-0.1 M的三（羥甲基）氨基甲烷。
9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述臨界陽(yáng)性質(zhì)控品為1.0 X 10 4拷貝 AiL的所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的基因片段。
10. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性質(zhì)控品為濃度0. 8%的生理 鹽水。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的引物、探針和試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。所述引物和探針包括：用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的正向引物、用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的反向引物和用于檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因的探針。所述試劑盒包括上述的引物和探針。所述引物、探針和試劑盒具有靈敏度高的特性，能夠快速檢測(cè)肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因。
【IPC分類(lèi)】C12N15-11, C12Q1-68, C12R1-22
【公開(kāi)號(hào)】CN104745690
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510052461
【發(fā)明人】劉茹, 桑筱筱
【申請(qǐng)人】湖北永邦醫(yī)療科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年1月30日