本發(fā)明涉及一種制備麥芽糖漿的方法，屬于淀粉糖轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

麥芽糖是由兩個(gè)葡萄糖單元經(jīng)α-1，4糖苷鍵連接而成的還原性二糖。其具有諸多優(yōu)良特性：如甜度柔和(甜度只有蔗糖的30％-40％)、入口不留后味、熬糖溫度高、熱穩(wěn)定性好、抗結(jié)晶性好，且具有多種生理功能，可廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)。在食品工業(yè)中，麥芽糖漿用于制作糕點(diǎn)，可使糕點(diǎn)更加柔潤(rùn)、膨松可口，且色澤鮮亮；用于制作牛軋?zhí)?、沙琪瑪?shù)劝局铺菨{的時(shí)候，麥芽糖的加入可以防止糖漿反砂，使成品更清澈、質(zhì)地更佳；麥芽糖還可用于制造麥芽糖醇，是糖尿病、高血壓患者的理想甜味劑。在醫(yī)藥工業(yè)中，麥芽糖在血液中代謝不需要胰島素控制，可避免血糖升高，可用于制造麥芽糖靜脈注射液。

目前，麥芽糖的制備方法通常采用以下技術(shù)路線：

(1)調(diào)漿：將淀粉調(diào)成濃度為10-25％的淀粉乳，攪拌均勻后，調(diào)節(jié)ph至5.2-6.2，加入0.2-0.5％的氯化鈣，充分?jǐn)嚢瑁?2)液化：向調(diào)好的淀粉乳中加入高溫α-淀粉酶，100℃分批液化或者連續(xù)噴射液化，控制液化液de值小于4，液化結(jié)束后加酸液調(diào)ph至4.0-4.5，并升溫滅酶；(3)糖化：將液化液冷卻至50-62℃，加堿液調(diào)節(jié)ph至5.0-5.5，加入β-淀粉酶、普魯蘭酶、麥芽糖淀粉酶(又稱麥芽三糖水解酶)，利用三種酶協(xié)同作用進(jìn)行糖化，反應(yīng)24-60小時(shí)；(4)過(guò)濾：糖化結(jié)束后，升高糖化液溫度滅酶，加入活性炭進(jìn)行脫色，然后再過(guò)濾、脫鹽、濃縮得到麥芽糖漿。

然而，上述制備方法仍然存在以下問(wèn)題：

首先，目前大多數(shù)方法采用的高溫α-淀粉酶的最適溫度一般為95-100℃，而β-淀粉酶、普魯蘭酶、麥芽糖淀粉酶一般為中溫酶，最適溫度為50-60℃。由于高溫α-淀粉酶和普魯蘭酶最適溫度相差較大，因此淀粉液化和脫支需要分開(kāi)進(jìn)行；淀粉液化程度需控制在較低(de值一般在4左右)水平才能有利于提高麥芽糖收率；為了降低體系粘度，底物濃度一般低于20％，糖化結(jié)束時(shí)，糖液中麥芽糖濃度低，后續(xù)需要提高蒸發(fā)倍數(shù)，增加了生產(chǎn)成本。

其次，由于采用的β-淀粉酶、普魯蘭酶、麥芽糖淀粉酶都是中溫酶，糖化過(guò)程中為了有利于三種酶的協(xié)同作用，糖化反應(yīng)的條件一般控制在50-62℃，反應(yīng)24-60小時(shí)。該條件下容易污染雜菌(如乳酸菌等)，雜菌是生長(zhǎng)會(huì)消耗糖分，產(chǎn)生雜酸，進(jìn)而導(dǎo)致反應(yīng)體系ph下降及酶快速失活，因此反應(yīng)后期需補(bǔ)加酶液；此外，雜酸的生成還會(huì)導(dǎo)致麥芽糖收率下降，純度降低，后續(xù)提取的難度加大，生產(chǎn)成本增加。

第三，反應(yīng)過(guò)程中需要多次添加酸堿、調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的ph值。首先調(diào)節(jié)體系初始ph至5.2-6.2，液化結(jié)束加酸液調(diào)ph至4.0-4.5后，再升溫滅活高溫α-淀粉酶；進(jìn)入糖化工序后，還需要加堿液調(diào)節(jié)ph至5.0-5.5。該工藝存在多次添加酸堿，一方面導(dǎo)致工藝操作復(fù)雜，另外一方面酸堿的加入，會(huì)給反應(yīng)體系帶入較多的鹽離子，后續(xù)需要脫鹽，增加了純化工序的負(fù)擔(dān)。

第四，反應(yīng)過(guò)程需要先升溫至100℃液化，然后降溫至50-62℃，再升溫滅酶，最后降溫脫色、過(guò)濾。整個(gè)過(guò)程升溫降溫幅度較大，需要消耗較多的冷凝水和蒸汽，不僅造成能源的浪費(fèi)，而且增加了生產(chǎn)成本。

申請(qǐng)?zhí)枮?01610458938.7，公開(kāi)(公告)號(hào)為cn106119316a，名稱《一種提高高濃度淀粉糖化生產(chǎn)麥芽糖漿中麥芽糖得率的方法》的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)，通過(guò)兩階段溫度控制以及復(fù)合酶處理，可以在高濃度淀粉底物條件下，制備麥芽糖漿，有利于減少后期的蒸發(fā)能耗。然而，該技術(shù)方案的主要目的是提高淀粉底物濃度，仍然存在需要多次添加酸堿、降溫升溫幅度大、存在染菌幾率大的問(wèn)題，無(wú)法解決上述現(xiàn)有的技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是：克服現(xiàn)有工藝中存在的問(wèn)題，提供一種麥芽糖漿制備工藝，液化與脫支同步進(jìn)行，反應(yīng)溫度高、淀粉底物濃度高、液化后無(wú)需滅酶，僅需調(diào)節(jié)一次初始ph，工藝簡(jiǎn)單，大幅提高麥芽糖漿制備的整體效率。

本發(fā)明以30－40％的淀粉乳為底物，采用高溫淀粉普魯蘭酶(ec:3.2.1.41)進(jìn)行同步液化與脫支反應(yīng)，然后分步或同時(shí)加入耐熱β-淀粉酶(ec:3.2.1.2.)和耐熱麥芽糖淀粉酶(ec3.2.1.133)進(jìn)行糖化，經(jīng)過(guò)脫色、濃縮，即可獲得麥芽糖漿。

具體的，本發(fā)明技術(shù)方案可包括以下步驟：

(1)將淀粉與水充分?jǐn)嚢?、混合，制備質(zhì)量濃度(以干基計(jì))為30－40％的淀粉乳；加入0.1－0.3％的氯化鈣，再將淀粉乳的ph值調(diào)節(jié)至5.3－5.6；然后以3－6u/g淀粉的比例向淀粉乳中加入高溫淀粉普魯蘭酶；混勻后，升溫至95－100℃，進(jìn)行同步液化和脫支，控制de值在8-10范圍內(nèi)；淀粉普魯蘭酶具有雙重活性，即普魯蘭多糖水解酶活性和α-淀粉酶活性；為方便計(jì)算加酶量，此處所述高溫淀粉普魯蘭酶酶活力為α-淀粉酶活力；

(2)將步驟(1)所得淀粉液化液體系降溫至70－75℃，并向其中加入30－60u/g耐熱β－淀粉酶，充分反應(yīng)18－24小時(shí)；

(3)將步驟(2)所得糖化液體系降溫至65－70℃，并向其中加入20－40u/g耐熱麥芽糖淀粉酶，繼續(xù)攪拌反應(yīng)18－22小時(shí)后，糖化后料液的麥芽糖含量達(dá)到86－92％；

(4)用無(wú)水酒精檢驗(yàn)步驟(3)糖化后料液無(wú)糊精存在時(shí)，將反應(yīng)液加熱至95－100℃，保溫20分鐘－30分鐘；

(5)將步驟(4)料液冷卻至70－80℃，加入占料液固形物重量0.2－1.0％的活性炭，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，過(guò)濾、濃縮后即得到麥芽糖漿。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(2)、(3)合并進(jìn)行，即將步驟(1)所得淀粉液化液體系降溫至70－75℃，并向其中加入30－60u/g耐熱β－淀粉酶、20－40u/g耐熱麥芽糖淀粉酶充分反應(yīng)18－24小時(shí)；糖化后料液的麥芽糖含量達(dá)到86－92％。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(1)所述高溫淀粉普魯蘭酶具有液化活性(類似于高溫α－淀粉酶水解α－1,4－糖苷鍵的活性)和脫支活性(類似于普魯蘭酶水解α－1,6－糖苷鍵的活性)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，步驟(1)～(3)中所述高溫淀粉普魯蘭酶、耐熱β-淀粉酶、耐熱麥芽糖淀粉酶均來(lái)源于微生物。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)采用雙功能的高溫淀粉普魯蘭酶對(duì)淀粉進(jìn)行同步液化和脫支反應(yīng)，淀粉液化de值可以控制的較高，淀粉底物濃度高，可以30－40％的淀粉乳為底物，而現(xiàn)有制備方法針對(duì)10－20％的淀粉乳，本發(fā)明有利于提高最終糖化液中麥芽糖濃度，減少后續(xù)濃縮蒸發(fā)功耗，降低生產(chǎn)成本。

(2)由于糖化過(guò)程中采用的耐熱β-淀粉酶和耐熱麥芽糖淀粉酶具有很好的熱穩(wěn)定性，反應(yīng)可以在較高的溫度下進(jìn)行，高于常見(jiàn)的淀粉糖生產(chǎn)過(guò)程中雜菌的生長(zhǎng)溫度，反應(yīng)體系不易污染雜菌，有利于提高產(chǎn)物收率，減少后續(xù)分離提取壓力。

(3)由于所采用的三種酶最適ph比較接近，且在較寬的ph范圍內(nèi)可以保持較好的活性，因此反應(yīng)只需調(diào)節(jié)一次初始ph，后續(xù)無(wú)需調(diào)節(jié)ph，不會(huì)引入過(guò)多的酸、堿，可以減輕后續(xù)脫鹽純化工序的負(fù)擔(dān)，有利于簡(jiǎn)化工藝。

(4)反應(yīng)過(guò)程中只需在糖化后進(jìn)行一次升溫滅酶，反應(yīng)過(guò)程中無(wú)需多次大幅度升溫、降溫，有利于減少蒸汽和冷凝水的消耗，降低成本。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明一種實(shí)施方式的工藝路線圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。

實(shí)驗(yàn)材料：玉米淀粉為山東西王集團(tuán)公司產(chǎn)品；木薯淀粉為廣西南寧市武鳴隆禧淀粉廠產(chǎn)品。大腸桿菌表達(dá)宿主bl21(de3)和pet20b為novagen公司產(chǎn)品。常用化學(xué)試劑為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。本發(fā)明中高溫淀粉普魯蘭酶、耐熱β-淀粉酶和耐熱麥芽糖淀粉酶均為采用基因工程方法構(gòu)建重組菌株，并誘導(dǎo)表達(dá)獲得。

實(shí)施例1

(1)高溫淀粉普魯蘭酶的制備

從atcc購(gòu)買獲得thermococcuslitoralisdsm5473，以該菌的基因組為模版，pcr獲得序列如ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中g(shù)eneid為16549640的序列，連接到表達(dá)載體pet20b中，再轉(zhuǎn)化宿主菌株bl21(de3)；將重組菌株接種到tb培養(yǎng)基(甘油5g/l，蛋白胨12g/l，酵母膏24g/l，磷酸氫二鉀12.54g/l，磷酸二氫鉀2.31g/l，卡那霉素30μg/ml)培養(yǎng)，并采用iptg誘導(dǎo)表達(dá)，離心后獲得重組高溫淀粉普魯蘭酶。酶活力測(cè)定顯示發(fā)酵上清液中普魯蘭酶酶活力為36.8u/ml，α-淀粉酶酶活力為103.6u/ml。

所述淀粉普魯蘭酶具有普魯蘭酶和α-淀粉酶雙重活性，可以同時(shí)水解淀粉底物中的α-1，6糖苷鍵和α-1，4糖苷鍵。酶活力測(cè)定需要分別測(cè)定普魯蘭酶和α-淀粉酶活性。使用過(guò)程中為方便計(jì)算加酶量，所述加酶量為α-淀粉酶活力。

普魯蘭酶酶活測(cè)定方法：

取1.9ml的底物(0.5％普魯蘭多糖溶解于50mmph5.5的磷酸緩沖液中)，95℃水浴預(yù)熱10min。加入0.1ml稀釋的酶液樣品，反應(yīng)10min，加入3mldns，沸水浴7min。向上述反應(yīng)體系中加入10ml的蒸餾水，混勻，在540nm下測(cè)量其吸光值。酶活單位定義為，在上述條件下，每分鐘催化產(chǎn)生相當(dāng)于1μmol葡萄糖還原力的還原糖的酶量定義為一個(gè)活力單位。

α-淀粉酶酶活測(cè)定方法：

準(zhǔn)確吸取2.5ml1％可溶性淀粉溶液(溶解于50mmph6.0磷酸緩沖溶液)，于95℃水浴預(yù)熱5min，加入100μl酶液，反應(yīng)5min，立即取出1ml反應(yīng)液，置于含有0.5ml0.1mol/l鹽酸溶液中終止酶解反應(yīng)，加入5ml稀碘液，搖勻。以稀碘液為空白，在660nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度(a)。根據(jù)吸光度計(jì)算測(cè)試酶液的活力。α-淀粉酶酶活單位定義：在上述條件下，1分鐘液化1mg可溶性淀粉所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

(2)耐熱β-淀粉酶的制備

耐熱β-淀粉酶來(lái)源于thermoanaerobacteriumthermosulfurigenesatcc33743，耐熱β-淀粉酶編碼基因在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中的aaa23204.1。菌株基因組dna從atcc購(gòu)買，同樣采用pcr方法獲得目的基因片段并連接到表達(dá)載體pet20b中，再轉(zhuǎn)化宿主菌株bl21(de3)；將重組菌株接種到tb培養(yǎng)基培養(yǎng)，并采用iptg誘導(dǎo)表達(dá)，離心后獲得重組耐熱β-淀粉酶。酶活力測(cè)定顯示發(fā)酵上清液中β-淀粉酶酶活力為208.1u/ml。

β-淀粉酶樣品酶活力測(cè)定：

吸取0.9ml1％可溶性淀粉溶液(溶解于50mmph5.5磷酸鹽緩沖溶液)，于70℃水浴預(yù)熱5min；然后加入100μl酶液，反應(yīng)10min后，立即加入0.8mldns溶液。沸水浴中煮沸5min。上述反應(yīng)體系加適量蒸餾水并定容至13ml；混勻后用1cm比色皿在540nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度(a)。根據(jù)吸光度求得測(cè)試酶液的濃度。酶活力單位定義：在上述條件下條件下，每分鐘水解可溶性淀粉生成1μmol麥芽糖所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(u)。

(3)耐熱麥芽糖淀粉酶的制備

耐熱麥芽糖淀粉酶thermotoganeapolitanala10，耐熱麥芽糖淀粉酶蛋白在ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)中的登錄號(hào)為la10_rs03670。根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化編碼基因序列，并通過(guò)人工合成獲得目的基因片段并連接到表達(dá)載體pet29b中，再轉(zhuǎn)化宿主菌株bl21(de3)；將重組菌株接種到tb培養(yǎng)基培養(yǎng)，并采用iptg誘導(dǎo)表達(dá)，離心后獲得重組耐熱麥芽糖淀粉酶。酶活力測(cè)定顯示發(fā)酵上清液中麥芽糖淀粉酶酶活力為118.0u/ml。

酶活力測(cè)定方法：

取2ml的0.5％可溶性淀粉溶液(溶解于50mmph5.5磷酸鹽緩沖液)于試管中，置于65℃水浴鍋中預(yù)熱10min。加入0.1ml酶液，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)10min，加入3mldns振蕩均勻，放入冰水中終止反應(yīng)，沸水浴煮沸7min，加入蒸餾水并定容至15ml，混勻。在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值并計(jì)算酶活力。酶活力單位定義：上述條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1μmol還原糖所需的酶量作為一個(gè)活力單位。

實(shí)施例2

稱取500克玉米淀粉，加入適量的水制備成質(zhì)量濃度(以純淀粉干基計(jì))為30％的淀粉乳，加入0.2％的氯化鈣，調(diào)節(jié)淀粉乳的ph值至5.5，然后加入高溫淀粉普魯蘭酶，該酶的加量為每克淀粉(以純淀粉干基計(jì))加5u(以α-淀粉酶活性計(jì))，充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆?，逐步升溫?5℃，控制攪拌轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘，液化80分鐘，測(cè)定液化體系的de值為8.1。

將淀粉液化液體系降溫至70℃，并向其中加入耐熱β－淀粉酶和耐熱麥芽糖淀粉酶，加入量為每克純淀粉分別加30u和40u，控制攪拌轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，繼續(xù)反應(yīng)20小時(shí)。

取樣用無(wú)水酒精檢驗(yàn)糖化料液中無(wú)糊精存在時(shí)，將反應(yīng)液加熱迅速升溫至100℃，保溫30分鐘滅酶。將料液冷卻至70℃，加入占料液固形物重量0.3％的活性炭，攪拌均勻，過(guò)濾后即得到糖化液。

通過(guò)高壓液相色譜檢測(cè)糖液成分，結(jié)果顯示體系中麥芽糖含量達(dá)到86.5％，濃度為256.8克/升。糖液再經(jīng)過(guò)濃縮得到濃度為80％、麥芽糖含量為86％以上的麥芽糖糖漿。

實(shí)施例3

稱取500克木薯淀粉，加入適量的水制備成質(zhì)量濃度(以純淀粉干基計(jì))為30％的淀粉乳，加入0.1％的氯化鈣，調(diào)節(jié)淀粉乳的ph值至5.6，然后加入高溫淀粉普魯蘭酶，該酶的加量為每克淀粉(以純淀粉干基計(jì))加5u(以α-淀粉酶活性計(jì))，充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆颍鸩缴郎刂?00℃，控制攪拌轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘，液化80分鐘，測(cè)定液化體系的de值為9.0。

將淀粉液化液體系降溫至70℃，并向其中加入耐熱β－淀粉酶和耐熱麥芽糖淀粉酶，加入量為每克純淀粉分別加60u和30u，控制攪拌轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，繼續(xù)反應(yīng)20小時(shí)。

取樣用無(wú)水酒精檢驗(yàn)糖化料液中無(wú)糊精存在時(shí)，將反應(yīng)液加熱迅速升溫至100℃，保溫30分鐘滅酶。將料液冷卻至70℃，加入占料液固形物重量0.3％的活性炭，攪拌均勻，過(guò)濾后即得到糖化液。

通過(guò)高壓液相色譜檢測(cè)糖液成分，結(jié)果顯示體系中麥芽糖含量達(dá)到89.3％，濃度為265.1克/升。糖液再經(jīng)過(guò)濃縮得到濃度為80％、麥芽糖含量為89％以上的麥芽糖糖漿。

實(shí)施例4

稱取500克玉米淀粉，加入適量的水制備成質(zhì)量濃度(以純淀粉干基計(jì))為30％的淀粉乳，加入0.2％的氯化鈣，調(diào)節(jié)淀粉乳的ph值至5.3，然后加入高溫淀粉普魯蘭酶，該酶的加量為每克淀粉(以純淀粉干基計(jì))加3u(以α-淀粉酶活性計(jì))，充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆?，逐步升溫?00℃，控制攪拌轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘，液化80分鐘，測(cè)定液化體系的de值為9.6。

將淀粉液化液體系降溫至75℃，并向其中加入耐熱β－淀粉酶，加入量為每克純淀粉加50u，控制攪拌轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，繼續(xù)反應(yīng)18小時(shí)。再將糖化液體系降溫至65℃，按照每克純淀粉加入20u的耐熱麥芽糖淀粉酶進(jìn)行添加，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)20小時(shí)。

取樣用無(wú)水酒精檢驗(yàn)糖化料液中無(wú)糊精存在時(shí)，將反應(yīng)液加熱迅速升溫至100℃，保溫30分鐘滅酶。將料液冷卻至70℃，加入占料液固形物重量0.3％的活性炭，攪拌均勻，過(guò)濾后即得到糖化液。

通過(guò)高壓液相色譜檢測(cè)糖液成分，結(jié)果顯示體系中麥芽糖含量達(dá)到91％，濃度為270.1克/升。糖液再經(jīng)過(guò)濃縮得到濃度為80％、麥芽糖含量為91％的麥芽糖糖漿。

實(shí)施例5

稱取500克木薯淀粉，加入適量的水制備成質(zhì)量濃度(以純淀粉干基計(jì))為40％的淀粉乳，加入0.2％的氯化鈣，調(diào)節(jié)淀粉乳的ph值至5.5，然后加入高溫淀粉普魯蘭酶，該酶的加量為每克淀粉(以純淀粉干基計(jì))加6u(以α-淀粉酶活性計(jì))，充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆颍鸩缴郎刂?00℃，控制攪拌轉(zhuǎn)速為100轉(zhuǎn)/分鐘，液化90分鐘，測(cè)定液化體系的de值為10。

將淀粉液化液體系降溫至75℃，并向其中加入耐熱β－淀粉酶，加入量為每克純淀粉加60u，控制攪拌轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，繼續(xù)反應(yīng)20小時(shí)。再將糖化液體系降溫至65℃，按照每克純淀粉加入40u的耐熱麥芽糖淀粉酶進(jìn)行添加，繼續(xù)控制攪拌轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)20小時(shí)。

取樣用無(wú)水酒精檢驗(yàn)糖化料液中無(wú)糊精存在時(shí)，將反應(yīng)液加熱迅速升溫至100℃，保溫30分鐘滅酶。將料液冷卻至70℃，加入占料液固形物重量0.3％的活性炭，攪拌均勻，過(guò)濾后即得到糖化液。

通過(guò)高壓液相色譜檢測(cè)糖液成分，結(jié)果顯示體系中麥芽糖含量達(dá)到92.3％，濃度為274.0克/升。糖液再經(jīng)過(guò)濃縮得到濃度為80％、麥芽糖含量為92％以上的麥芽糖糖漿。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。