本發(fā)明涉及煙用香料技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種基于生物產(chǎn)香制備無花果香料的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

在煙草制品中，既要保證煙氣感官品質(zhì)，包括香氣、濃度、刺激性、雜氣、余味等綜合指標(biāo)，又要保證卷煙的低危害性。在煙草中添加天然的功能性煙用香料，能起到降害與補(bǔ)償香氣的作用，也能滿足消費(fèi)者對(duì)于天然產(chǎn)品的需求。加料加香技術(shù)是提高卷煙產(chǎn)品品質(zhì)與市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的重要部分，是構(gòu)筑卷煙獨(dú)特口味和風(fēng)格，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品品質(zhì)差異化的最重要手段之一，是穩(wěn)定卷煙抽吸品質(zhì)的重要手段；是卷煙生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)，獲得特色加料加香材料，具有非?，F(xiàn)實(shí)的意義。而煙用天然添加劑通常是植物水提或醇提的粗提物，存在雜氣重、刺激性大和口感不適等吸味缺陷。

無花果又名映日果、隱花果和蜜果等，屬?？崎艑俾淙~喬木或灌木果實(shí)，皮薄無核，肉質(zhì)松軟，營養(yǎng)豐富。無花果的果實(shí)富含葡萄糖、果糖、氨基酸、維生素和礦質(zhì)元素等。無花果香料能改善卷煙吸味、減輕刺激性和豐滿煙氣，賦予卷煙一種獨(dú)特的香味,并且能與卷煙香味諧調(diào),其在卷煙加料中的應(yīng)用相當(dāng)廣泛。

但由于無花果浸膏含有多糖大分子，因此在卷煙中存在刺激性大的負(fù)面效果。本發(fā)明人在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的過程中經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)：產(chǎn)香菌植生拉烏爾菌(raoultellaplanticolavp4-4)是能將糖或者乙醇氧化成乙酸等酸香物質(zhì)的一類細(xì)菌，其能消耗糖類大分子，消除這些大分子物質(zhì)對(duì)卷煙的負(fù)面影響，同時(shí)轉(zhuǎn)化部分物質(zhì)生成香蘭素以及其他香味物質(zhì)，而產(chǎn)生的香味物質(zhì)可以在卷煙中起到增加清香香韻和飄逸感的作用，能協(xié)調(diào)和增強(qiáng)“黃鶴樓”品牌卷煙的風(fēng)格特征。

現(xiàn)有技術(shù)中，以產(chǎn)香菌植生拉烏爾菌發(fā)酵無花果粗提液，轉(zhuǎn)化、降解多糖等大分子物質(zhì)，生成小分子致香物質(zhì)或香味前體物，豐富香氣，減少無花果香料刺激性成分，提高香氣品質(zhì)；在卷煙中應(yīng)用，與煙氣協(xié)調(diào)，降低煙氣刺激性，具有奶香、果甜香等香氣，能豐富煙香，改善煙香品質(zhì)，突出黃鶴樓品牌卷煙的風(fēng)格特征，克服無花果香料在卷煙中應(yīng)用有刺激性大、雜氣重、余味不凈的缺陷，尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于生物產(chǎn)香技術(shù)制備無花果香料的方法及其應(yīng)用，采用產(chǎn)香菌植生拉烏爾菌(raoultellaplanticolavp4-4)發(fā)酵轉(zhuǎn)化無花果水提液，降解、轉(zhuǎn)化無花果粗提液中的多糖等大分子物質(zhì)為小分子致香物質(zhì)或香味前體物，提高香料品質(zhì)；應(yīng)用于卷煙中，可有效改善煙香品質(zhì)，具有奶香、果甜香等香氣，能豐富煙香，突出黃鶴樓品牌卷煙的風(fēng)格特征，克服無花果香料在卷煙中應(yīng)用刺激性大、雜氣重、余味不凈的缺陷。

本發(fā)明提供一種基于生物產(chǎn)香制備無花果香料的方法，包括以下步驟：

(1)無花果粗提液的制備：將無花果與水按重量比1:20～50混合均勻，90～100℃回流提取1～3次，每次3～5小時(shí)，抽濾，合并濾液，得到無花果提取液；

(2)菌種活化：將植生拉烏爾菌(raoultellaplanticolavp4-4)接種到固體斜面培養(yǎng)基上，在28～40℃，靜置培養(yǎng)24～96h后得到活化菌種，置于4℃冰箱中；

所述的植生拉烏爾菌(raoultellaplanticolavp4-4)，保藏號(hào)為cctccm2012005，于2012年1月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國武漢武漢大學(xué)；

(3)制備種子培養(yǎng)液：將步驟2)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在28～40℃、100～150r/min條件下振蕩培養(yǎng)24～96h，連續(xù)轉(zhuǎn)接1～3次，制得種子培養(yǎng)液；

(4)無花果提取液的微生物發(fā)酵：將上述步驟(3)的種子培養(yǎng)液，按體積比15～30％接種到上述步驟1)的無花果提取液中，接種后的濾液的裝罐量為40～70％，ph5～7，28～40℃，攪拌速度100～120r/min，避光條件下發(fā)酵1～6天，得到無花果發(fā)酵液；

(5)醇沉純化：將步驟4)的無花果發(fā)酵液濃縮至相對(duì)密度1.1～1.3，與95％乙醇按質(zhì)量比1:3～5混合，靜置過夜，4000～10000r/min離心5～20min，取上清液，55～65℃減壓濃縮至相對(duì)密度為1.0～1.2的無花果浸膏，即為基于生物產(chǎn)香技術(shù)制備的無花果香料。

進(jìn)一步的，所述的斜面培養(yǎng)基組成為：黃豆汁125ml，木糖20g/l，瓊脂15g/l。

進(jìn)一步的，所述的種子培養(yǎng)基組成為：木糖45g/l，酵母粉8g/l，氯化鈉4g/l。

本發(fā)明提供一種基于上述生物產(chǎn)香方法制備的無花果香料。

本發(fā)明還提供一種基于生物產(chǎn)香方法制備的無花果香料在卷煙煙絲中的應(yīng)用，所述無花果香料作為天然煙用添加劑加入卷煙煙絲中，添加量為煙絲質(zhì)量的百萬分之1～3，與煙氣協(xié)調(diào)，具有奶香、果甜香等香氣，能豐富煙香，改善煙香品質(zhì)，突出黃鶴樓品牌卷煙的風(fēng)格特征，克服無花果香料在卷煙中應(yīng)用刺激性大、雜氣重、余味不凈的缺陷。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明先將無花果進(jìn)行水溶液回流提取有效成分，再以無花果提取液為底物，經(jīng)產(chǎn)香菌植生拉烏爾菌((raoultellaplanticolavp4-4))發(fā)酵，降解、轉(zhuǎn)化無花果提取液中的大分子物質(zhì)，生成小分子致香物質(zhì)和香味前體物質(zhì)，減少刺激性成分，具有奶香、果甜香等豐富香氣，提高香氣品質(zhì)；在卷煙中應(yīng)用，與煙氣協(xié)調(diào)，降低煙氣刺激性，具有奶香、果甜香等香氣，能豐富煙香，有回甜感，改善煙香品質(zhì)，增強(qiáng)黃鶴樓品牌卷煙的風(fēng)格特征，克服無花果香料在卷煙中應(yīng)用刺激性大、雜氣重、余味不凈的缺陷。

本發(fā)明工藝條件溫和，產(chǎn)品收率高，且所用的植物原料具有天然環(huán)保無害、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點(diǎn)，克服了無花果香料在卷煙中應(yīng)用刺激較大、雜氣較重的缺陷，生產(chǎn)工藝條件溫和，具有工業(yè)應(yīng)用轉(zhuǎn)化前景。

具體實(shí)施方式

下面通過具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述。應(yīng)當(dāng)理解，此部分所描述的具體實(shí)施例僅可用于解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1

一種基于生物產(chǎn)香技術(shù)制備無花果香料的方法，包括以下步驟：

(1)無花果提取液的制備：將無花果與水按重量比1:25混合均勻，92℃回流提取3次，每次3小時(shí)，抽濾，合并濾液，得到無花果提取液；

(2)菌種活化：將植生拉烏爾菌(raoultellaplanticolavp4-4)接種到固體斜面培養(yǎng)基上，在28℃，靜置培養(yǎng)32h后得到活化菌種，置于4℃冰箱中；

(3)制備種子培養(yǎng)液：將步驟2)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在30℃、100r/min條件下振蕩培養(yǎng)30h，連續(xù)轉(zhuǎn)接2次，制得種子培養(yǎng)液；

(4)無花果提取液的微生物發(fā)酵：將上述步驟(3)的種子培養(yǎng)液，按體積比12.5％接種到上述步驟1)的無花果提取液中，接種后的濾液的裝罐量為45％，ph5.5，30℃，攪拌速度100r/min，避光條件下發(fā)酵1.5天，得到無花果發(fā)酵液；

(5)醇沉純化：將步驟4)的無花果發(fā)酵液濃縮至相對(duì)密度1.15，與95％乙醇按質(zhì)量比1:3混合均勻，靜置過夜，5000r/min離心15min，取上清液，60℃減壓濃縮至相對(duì)密度為1.13的無花果浸膏，即為生物產(chǎn)香制備的無花果香料。

所述的斜面培養(yǎng)基組成為：黃豆汁125ml，木糖20g/l，瓊脂15g/l。

所述的種子培養(yǎng)基組成為：木糖45g/l，酵母粉8g/l，氯化鈉4g/l。

實(shí)施例2

一種基于生物產(chǎn)香制備無花果香料的方法，包括以下步驟：

(1)無花果提取液的制備：將無花果與水按重量比1:30混合均勻，95℃回流提取2次，每次4小時(shí)，抽濾，合并濾液，得到無花果提取液；

(2)菌種活化：將植生拉烏爾菌(raoultellaplanticolavp4-4)接種到固體斜面培養(yǎng)基上，在32℃，靜置培養(yǎng)48h后得到活化菌種，置于4℃冰箱中；

(3)制備種子培養(yǎng)液：將步驟2)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在32℃、110r/min條件下振蕩培養(yǎng)36h，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，制得種子培養(yǎng)液；

(4)無花果提取液的微生物發(fā)酵：將上述步驟(3)的種子培養(yǎng)液，按體積比18％接種到上述步驟1)的無花果提取液中，接種后的濾液的裝罐量為55％，ph6，32℃，攪拌速度110r/min，避光條件下發(fā)酵2.5天，得到無花果發(fā)酵液；

(5)醇沉純化：將步驟4)的無花果發(fā)酵液濃縮至相對(duì)密度1.14，與95％乙醇按質(zhì)量比1:4混合均勻，靜置過夜，6000r/min離心10min，取上清液，65℃減壓濃縮至相對(duì)密度為1.16的無花果浸膏，即為生物產(chǎn)香制備的無花果香料。

所述的斜面培養(yǎng)基組成為：黃豆汁125ml，木糖20g/l，瓊脂15g/l。

所述的種子培養(yǎng)基組成為：木糖45g/l，酵母粉8g/l，氯化鈉4g/l。

實(shí)施例3一種基于生物產(chǎn)香制備無花果香料的方法，包括以下步驟：

(1)無花果提取液的制備：將無花果與水按重量比1:45混合均勻，96℃回流提取1次，5小時(shí)，抽濾，合并濾液，得到無花果提取液；

(2)菌種活化：將植生拉烏爾菌(raoultellaplanticolavp4-4)接種到固體斜面培養(yǎng)基上，在38℃，靜置培養(yǎng)72h后得到活化菌種，置于4℃冰箱中；

(3)制備種子培養(yǎng)液：將步驟2)所得的斜面培養(yǎng)物，接種到種子培養(yǎng)基，在38℃、120r/min條件下振蕩培養(yǎng)72h，連續(xù)轉(zhuǎn)接2次，制得種子培養(yǎng)液；

(4)無花果提取液的微生物發(fā)酵：將上述步驟(3)的種子培養(yǎng)液，按體積比22％接種到上述步驟1)的無花果提取液中，接種后的濾液的裝罐量為50％，ph7，38℃，攪拌速度120r/min，避光條件下發(fā)酵4.2天，得到無花果發(fā)酵液；

(5)醇沉純化：將步驟4)的無花果發(fā)酵液濃縮至相對(duì)密度1.18，與95％乙醇按質(zhì)量比1:5混合均勻，靜置過夜，8000r/min離心6min，取上清液，70℃減壓濃縮至相對(duì)密度為1.312的無花果浸膏，即為生物產(chǎn)香制備的無花果香料。

所述的斜面培養(yǎng)基組成為：黃豆汁125ml，木糖20g/l，瓊脂15g/l。

所述的種子培養(yǎng)基組成為：木糖45g/l，酵母粉8g/l，氯化鈉4g/l。

試驗(yàn)例1感官評(píng)價(jià)

將實(shí)施例1-3基于生物產(chǎn)香技術(shù)制備的無花果香料按煙絲質(zhì)量比的百萬分之1、百萬分之2、百萬分之3分別添加到某中檔卷煙品牌配方煙絲中，煙絲裝入密封袋，放置在烘箱中80℃恒溫30min，至含水量合適，卷制成煙支，放入恒溫恒濕箱內(nèi)(22℃+1、相對(duì)濕度為60％+2％)平衡48h，請(qǐng)專家評(píng)吸小組評(píng)吸。

經(jīng)評(píng)吸小組反復(fù)評(píng)吸，感官評(píng)價(jià)結(jié)果如表1，表明：本發(fā)明的生物產(chǎn)香制備的無花果香料，在添加量百萬分之1～3時(shí)，與煙氣協(xié)調(diào)，具有奶香、果甜香等香氣，能豐富煙香，能降低煙氣刺激性，余味較好，煙氣柔和，增加喉部舒適性，明顯改善了無花果提取液使煙氣刺激變大、有雜氣的吸味缺陷。

表1.基于生物產(chǎn)香技術(shù)制備的無花果香料的感官評(píng)價(jià)

試驗(yàn)例2揮發(fā)性成分氣相質(zhì)譜對(duì)比檢測(cè)分析

采用gc/ms對(duì)基于生物產(chǎn)香技術(shù)制備的無花果香料與無花果粗提物(以下簡(jiǎn)稱對(duì)照)進(jìn)行揮發(fā)性香氣成分gc/ms對(duì)比分析。

(1)同時(shí)蒸餾萃取

將5g生物產(chǎn)香技術(shù)制備的無花果香料或其對(duì)照裝入圓底燒瓶中，加入400ml水，用電熱套加熱至沸騰，另一側(cè)的圓底燒瓶中加入200ml的二氯甲烷，60℃水浴沸騰，待中間分液管處液面出現(xiàn)分層后計(jì)時(shí)萃取4h。萃取結(jié)束后，向二氯甲烷萃取液中加入無水硫酸鈉，過夜，過濾并濃縮至1ml，濃縮液用于進(jìn)行g(shù)c/ms分析。

(2)gc/ms分析：hp-5ms(50m×0.25mm×0.25μm)毛細(xì)管柱；進(jìn)樣溫度：250℃；分流比25:1；載氣：he，1ml/min；升溫程序：從50℃(1min)以5℃/min升到250℃(5min)；傳輸線溫度：250℃；離子源：ei源；電子能量：70ev；掃描范圍：50～550amu；使用wiley和minilab譜庫進(jìn)行檢索。

(3)揮發(fā)性香氣成分對(duì)比分析

通過gc/ms對(duì)本發(fā)明的生物產(chǎn)香技術(shù)制備的無花果香料進(jìn)行香氣成分分析，從表1可以看出，(1)無花果提取物共鑒定出34種揮發(fā)性成分，包括酯類11種、酸類4種、醛類2種、烯類2種及其他烷烴類、醇類、酮類等；而本發(fā)明的基于生物產(chǎn)香技術(shù)制備的無花果香料共鑒定出52種揮發(fā)性成分，包括酯類15種、酸類8種、醇類7種、酮類4種、烯類5種及吡唑、呋喃、噻唑等。揮發(fā)性香氣成分增多，更豐富。(2)基于生物產(chǎn)香技術(shù)制備的無花果香料新增揮發(fā)性成分36種，其中3-羥基-2-丁酮的相對(duì)百分含量為48.6891％，具有強(qiáng)烈的奶油、脂肪、白脫樣香氣，高度稀釋后有令人愉快的奶香氣，4-甲基-2-戊酮，有令人愉快的酮樣香味，3-羥基丁酸乙酯呈果香、葡萄香、青香和白酒似香氣，苯甲醇具有微弱的芳香味，甲酸辛酯具有清甜的水果香氣，苯乙醇具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣，靈貓酮在極度稀釋時(shí)有強(qiáng)烈的愉快的麝香香氣，(3)與對(duì)照相比，揮發(fā)性成分相對(duì)百分含量增加的有肉豆蔻酸，增加了30倍，從0.1101％到3.3854％，肉豆蔻酸有柔和煙氣作用，與煙香諧調(diào)，提高甜而醇和的風(fēng)味，棕櫚酸乙酯相對(duì)量升高了8倍，從0.3730％到2.6269％，呈微弱蠟香、果爵和奶油香氣；(4)與對(duì)照相比，揮發(fā)性香氣成分相對(duì)百分含量減少或消失的有糠醛、乙苯、苯乙醛、大馬酮、2，4-二叔丁基酚、十五烷酸、棕櫚酸、鄰苯二甲酸二異丁酯、亞油酸、鄰苯二甲酸單乙基己基酯、2,2'-亞甲基雙-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)等，其中棕櫚酸有增加煙氣甜味、蠟味、豐滿度的作用，但同時(shí)會(huì)帶來粗糙感和刺激性，其他如鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸單乙基己基酯等大分子物質(zhì)的消失，降低了在煙氣中的刺激性。綜合來看，可能是由于產(chǎn)香菌對(duì)無花果提取液的轉(zhuǎn)化、分解、氧化等作用，使得一些大分子物質(zhì)分解成小分子致香成分或香味前體物，甚至徹底降解轉(zhuǎn)化，所得到的基于生物產(chǎn)香技術(shù)制備的無花果香料，大分子雜質(zhì)減少，與煙氣協(xié)調(diào)，具有濃郁奶香、果甜香等香氣，能豐富煙香，能降低煙氣刺激性，余味較好，煙氣柔和，增加喉部舒適性，明顯改善了無花果提取液使煙氣刺激變大、有雜氣的吸味缺陷。

表1.基于生物產(chǎn)香技術(shù)制備的無花果香料與對(duì)照的揮發(fā)性成分gc/ms對(duì)比分析

表1中內(nèi)標(biāo)為丙酸苯乙酯；“/”表示未檢出。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何屬于本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。