本發(fā)明屬于植物育性基因調(diào)控領域，具體涉及一種含有地塞米松誘導系統(tǒng)的表達載體；還涉及該表達載體的用途。
背景技術：
：隱性核不育材料不育性遺傳穩(wěn)定、受外界環(huán)境條件影響小，雜交制種安全，易于配制高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗組合，但是由于缺乏有效的保持和繁殖體系，限制了其在種子商業(yè)化生產(chǎn)上的應用。美國杜邦先鋒公司(美國專利us5426041)通過在核不育材料中導入與不育基因同源且能恢復育性的基因、花粉致死基因和篩選基因，實現(xiàn)了核不育系的繁殖制種。轉基因植株后代由于攜帶恢復育性基因而表現(xiàn)為花粉可育，即成為保持系。由于花粉致死基因的存在，轉基因后代只產(chǎn)生一種花粉，即只帶有核不育基因的花粉。這樣所結的種子也就只有兩種基因型，一種是與轉基因前的植株相同的具有純合隱性核不育基因的種子，另一種是與轉基因植株相同的攜帶有轉基因片段的種子。然后通過篩選基因(如熒光、殺蟲劑)將兩種種子區(qū)分開，前者作為不育系用于生產(chǎn)上雜交種的制種，后者作為保持系繼續(xù)繁殖獲得不育系和保持系，實現(xiàn)一系兩用。擬南芥ms1基因是控制花粉發(fā)育的關鍵轉錄因子，利用化學誘變劑甲基磺酸乙酯(ems)篩選，已獲得了該基因的雄性不育突變體ms1-1(zoea.等，theplantjournal，2001，28(1):27-39)；該基因不僅在油菜等雙子葉植物中功能保守，而且在水稻和大麥等單子葉植物中具有極高的功能相似性(gjfernández等，plantbiotechnologyjournal,2014,12(6):765–777；huil等，plantphysiology,2011,156(2):615-30)?；瘜W誘導表達系統(tǒng)是一種調(diào)控基因表達的技術手段，已在基因功能分析、rna沉默等領域得到廣泛應用。利用糖皮質(zhì)激素受體能結合包括地塞米松等在內(nèi)的甾類激素的原理(wagnerd.等，science,1999,285(5427):582)，將地塞米松誘導系統(tǒng)轉入隱性核不育擬南芥中，從而對不育性進行保持，有可能成為將隱性核不育基因用于商業(yè)化生產(chǎn)的有效途徑。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種含有地塞米松誘導系統(tǒng)的表達載體。本發(fā)明另一目的在于提供上述含有地塞米松誘導系統(tǒng)的表達載體的制備方法。本發(fā)明第三目的在于提供上述表達載體在誘導植物隱性核不育育性恢復上的用途。本發(fā)明第四目的在于提供一種獲得含有地塞米松誘導系統(tǒng)轉基因擬南芥的方法。本發(fā)明第五目的在于提供用于鑒定上述含有塞米松誘導系統(tǒng)轉基因植物的分子標記。本發(fā)明第六目的在于提供用于鑒定上述含有塞米松誘導系統(tǒng)轉基因植物的引物對。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術方案如下：一種含有地塞米松誘導系統(tǒng)的表達載體，所述的表達載體含有一個融合基因，在融合基因的上游為擬南芥ms1基因的啟動子序列；其中所述的融合基因由擬南芥ms1基因和小鼠糖皮質(zhì)激素受體甾醇結合域基因片段組成。上述表達載體中所述的擬南芥ms1基因由seqidno.2所示的核苷酸序列組成。上述表達載體中所述的小鼠糖皮質(zhì)激素受體甾醇結合域基因片段由seqidno.1所示的核苷酸序列組成。上述表達載體中所述的擬南芥ms1基因的啟動子序列由seqidno.3所示的核苷酸序列組成。上述表達載體中所述的融合基因由seqidno.10所示的核苷酸序列組成。上述含有地塞米松誘導系統(tǒng)的表達載體的制備方法，包括如下步驟：(1)、以小鼠肝臟的cdna為模板，以gr-f和gr-r為引物進行pcr擴增，得小鼠糖皮質(zhì)激素受體甾醇結合域基因片段，命名為gr；其中所述的引物gr-f和gr-r為：gr-f：5’-cagcaagccactgcaggagtct-3’(seqidno.4)，gr-r：5’-tcatttttgatgaaacagaagcttt-3’(seqidno.5)；(2)、以野生型擬南芥ler花的cdna為模板，以ms1-f和ms1-r為引物進行pcr擴增，得不含終止密碼子的擬南芥ms1基因，命名為ms1cds；其中所述的引物ms1-f和ms1-r為：ms1-f：5’-tccccccgggctagactagtatggcgaatctgattcgaaca-3’(seqidno.6)，ms1-r：5’-ctagtctagagggtaaaaaagagagaggaataaga-3’(seqidno.7)；(3)、以野生型擬南芥ler的dna為模板，用ms1pro-f和ms1pro-r為引物進行pcr擴增，得擬南芥ms1基因的啟動子序列，命名為ms1promoter；其中所述的引物ms1pro-f和ms1pro-r為：ms1pro-f：5’-cggggtaccgagaccctctctcatcttgcgtgt-3’(seqidno.8)，ms1pro-r：5’-ctagtctagacgaatcagaaatttggtttgatcttga-3’(seqidno.9)；(4)、回收步驟(1)的pcr擴增產(chǎn)物gr；用t4連接酶將gr與pmd19-t載體過夜連接，得連接產(chǎn)物；然后將所得連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌dh5a，37℃過夜培養(yǎng)；將陽性單克隆菌過夜擴大培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒，即獲得gr的克隆載體，命名為pmd19t-gr；(5)、回收步驟(2)的pcr擴增產(chǎn)物ms1cds；將步驟(4)所得的pmd19t-gr和ms1cds分別用xmai和xbai進行雙酶切，得酶切產(chǎn)物；將酶切產(chǎn)物回收，再用t4連接酶連接，獲得ms1cds和gr的融合基因，命名為ms1cds-gr；再轉化，構建成該融合基因的克隆載體，命名為pmd19t-ms1cds-gr；(6)、回收步驟(3)的pcr擴增產(chǎn)物ms1promoter；將pcactn載體和ms1promoter分別用kpni和xbai進行雙酶切，將酶切產(chǎn)物回收，再用t4連接酶連接、轉化，構建成ms1promoter的克隆載體，命名為pcactn-ms1promoter；(7)、將步驟(5)所得克隆載體pmd19t-ms1cds-gr用spei和sali進行雙酶切，將酶切產(chǎn)物回收，獲得ms1和gr的融合基因，命名為ms1cds-gr；(8)、將步驟(6)所得的克隆載體pcactn-ms1promoter用xbai和sali進行雙酶切，將酶切產(chǎn)物回收，獲得線性化的ms1promoter的克隆載體；(9)、用t4連接酶將步驟(7)所得的融合基因ms1cds-gr和步驟(8)所得的線性化的ms1promoter的克隆載體連接，轉化至大腸桿菌dh5a并進行質(zhì)粒提取，獲得含有地塞米松誘導系統(tǒng)的表達載體，命名為pms1pro-ms1cds-gr；將pms1pro-ms1cds-gr載體轉化到農(nóng)桿菌eha105菌株中，轉化后所得菌株命名為eha105-pms1pro-ms1cds-gr。上述制備方法步驟(1)、(2)或(3)中所述的pcr的反應體系(20ul)為：taq酶0.2ul，dntp2ul，10xbuffer2ul，模板dna1ul，depch2o14.8ul。上述制備方法步驟(1)、(2)或(3)中所述的pcr的反應條件為：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min，20℃2min。上述制備方法步驟(2)或(3)中所述的野生型擬南芥ler是指野生型擬南芥lansbergerecta生態(tài)型。本發(fā)明還提供了上述表達載體在誘導植物隱性核不育育性恢復上的應用。所述的植物是指擬南芥、油菜、水稻、玉米或大豆等。本發(fā)明還提供了一種獲得含有地塞米松誘導系統(tǒng)轉基因擬南芥的方法，包括如下步驟：(1)、以雄性不育突變體ms1-1材料為母本，以野生型擬南芥ler為父本雜交，得f1代；(2)、將步驟(1)所得f1代的花序浸入上述含有地塞米松誘導系統(tǒng)的農(nóng)桿菌(eha105-pms1pro-ms1cds-gr)溶液里3秒，用保鮮膜輕輕的包裹整個花序；再用黑色塑料袋罩住整個植株，培養(yǎng)室暗培養(yǎng)24h，然后去除遮蓋物，于長日照下正常培養(yǎng)，收獲種子收種，獲得t0代種子；(3)、將步驟(2)所得t0代種子均勻撒播到含有遺傳霉素g418的平板培養(yǎng)基上，先在4℃預處理2-3d，然后轉入人工培養(yǎng)室，長出的綠色幼苗即為轉有地塞米松誘導系統(tǒng)的t0代陽性植株；(4)選擇不結實的t0代陽性植株，于幼蕾期均勻地噴施地塞米松溶液，每天1次，直到植株開花結實，收獲t1代種子；如此連續(xù)4代繼續(xù)噴施地塞米松溶液，將t0代通過連續(xù)4代自交，且每代噴施地塞米松溶液誘導，最終獲得穩(wěn)定純合的含有地塞米松誘導系統(tǒng)、且受地塞米松誘導育性恢復的ms1-1背景的轉基因擬南芥。上述方法步驟(1)中所述的雄性不育突變體ms1-1是擬南芥ms1基因的隱性核不育基因突變體。雄性不育突變體ms1-1可通過擬南芥tair數(shù)據(jù)庫(www.arabidopsis.org)購買獲得。上述方法步驟(2)中所述的農(nóng)桿菌溶液的制備方法：將上述的農(nóng)桿菌菌株(eha105-pms1pro-ms1cds-gr)接種于含有利福平和卡那霉素(終濃度均為50ug/ml)的液體lb培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)過夜；將菌液于4℃、2000r/min離心5min，再用5％的蔗糖溶液重懸，調(diào)od600值約為0.8，并加入表面活性劑silwetl-77(終濃度為0.05％)，混勻，獲得eha105-pms1pro-ms1cds-gr農(nóng)桿菌溶液。上述方法步驟(3)中所述的地塞米松誘導系統(tǒng)是指含有ms1啟動子、以及ms1和gr的融合基因序列(如seqidno.10所示的核苷酸序列)，且能受地塞米松誘導調(diào)控植物育性表達的系統(tǒng)。上述方法步驟(3)中所述的平板培養(yǎng)基的組成成分及其比例為：每100ml蒸餾水中含ms基礎培養(yǎng)基0.443g，蔗糖3g，植物凝膠0.3g，以及終濃度為10mg/lg418。上述方法步驟(3)中所述的地塞米松溶液的濃度為5umol/l。所述的地塞米松溶液的制備方法，按照比例將地塞米松粉末溶解于無水乙醇中即可。本發(fā)明還提供了用于鑒定上述含有塞米松誘導系統(tǒng)轉基因植物的分子標記，所述的分子標記由seqidno.1所示的核苷酸序列組成。利用上述分子標記鑒定含有塞米松誘導系統(tǒng)轉基因植物的方法，包括以待測材料的總dna為模板，以gr-f和gr-r為引物進行pcr擴增，所得pcr產(chǎn)物大小為的828bp的基因片段，即為含有塞米松誘導系統(tǒng)的轉基因植物；其中其中gr-f由seqidno.4所示的核苷酸序列組成；gr-r由seqidno.5所示的核苷酸序列組成。用于鑒定上述含有塞米松誘導系統(tǒng)轉基因擬南芥的引物對，所述的引物對為gr-f和gr-r；其中gr-f由seqidno.4所示的核苷酸序列組成；gr-r由seqidno.5所示的核苷酸序列組成。本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果：本發(fā)明首次利用糖皮質(zhì)激素受體能結合地塞米松而被誘導的原理，獲得能受地塞米松誘導而恢復育性的隱性核不育擬南芥材料，在不改變基因型情況下，能夠自由操控轉有該套系統(tǒng)擬南芥的育性，可作為保持系用于生產(chǎn)不育系，從而能用于雜交制種，取代人工去雄，節(jié)約勞力，降低生產(chǎn)成本。同時，本發(fā)明為其他作物的隱性核不育應用該系統(tǒng)提供了模板。附圖說明圖1.本發(fā)明含有地塞米松誘導系統(tǒng)的表達載體構建過程示意圖。圖2.轉有地塞米松誘導系統(tǒng)的ms1-gr材料受地塞米松誘導前后的擬南芥植株表型照片；其中1為地塞米松誘導前，2-4分別為3個受地塞米松誘導后育性得到恢復的單株。圖3.經(jīng)地塞米松誘導前后的ms1-gr花粉粒對比顯微照片；其中1為地塞米松誘導前，2-4分別為3個受地塞米松誘導后育性得到恢復的單株。圖4.轉有地塞米松誘導系統(tǒng)的ms1-gr材料受地塞米松誘導的擬南芥莢果照片；其中1為地塞米松誘導前，2-4分別為3個受地塞米松誘導后育性得到恢復的單株。圖5.gr分子標記的鑒定電泳圖譜；其中1為地塞米松誘導前，2-4分別為3個受地塞米松誘導后育性得到恢復的單株。具體實施方式以下實施例中所用的試驗材料野生型擬南芥landsbergerecta生態(tài)型(簡稱ler)，以及擬南芥雄性不育突變體ms1-1等材料均種植在人工培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件為：光照強度為4000勒克斯，持續(xù)光照16小時，溫度25℃，；黑暗處理8小時，溫度為22℃，空氣相對濕度75％。如無特別說明，以下實施例中所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均為常規(guī)試劑。實施例1含有地塞米松誘導系統(tǒng)的表達載體的構建按照如下方法進行：(1)、參考網(wǎng)站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/公布的小鼠糖皮質(zhì)激素受體基因nr3c1的序列設計引物gr-f和gr-r，用于擴增編碼該蛋白甾醇結合域的基因片段：gr-f：5’-cagcaagccactgcaggagtct-3’(seqidno.4)，gr-r：5’-tcatttttgatgaaacagaagcttt-3’(seqidno.5)。以小鼠肝臟的cdna為模板，以gr-f和gr-r為引物進行pcr擴增，得pcr擴增產(chǎn)物，命名為gr。其中pcr的反應體系(20ul)為：taq酶0.2ul，dntp2ul，10xbuffer2ul，cdna1ul，無rna酶水14.8ul。pcr的反應條件為：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min，20℃2min。經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收該pcr產(chǎn)物(方法參照omega回收試劑盒說明書)，送交測序，得序列長度為828bp的pcr擴增產(chǎn)物(見seqidno.1)；然后按照載體說明書將其連接至pmd19-t載體(寶生物公司)，得連接產(chǎn)物；將所得連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌dh5a(參照薩姆布魯克《分子克隆實驗指南》第三版，科學出版社，2002年)，37℃過夜培養(yǎng)；最后將陽性單克隆菌過夜擴大培養(yǎng)后，參照質(zhì)粒提取試劑盒使用說明書(omega公司)提取質(zhì)粒，即獲得gr的克隆載體，命名為pmd19t-gr(見圖1)。(2)、參考網(wǎng)站http://www.arabidopsis.org/index.jsp公布的野生型擬南芥ler中ms1基因的啟動子和cdna序列，分別設計引物：ms1pro-f：5’-cggggtaccgagaccctctctcatcttgcgtgt-3’(seqidno.8)，ms1pro-r：5’-ctagtctagacgaatcagaaatttggtttgatcttga-3’(seqidno.9)；ms1-f：5’-tccccccgggctagactagtatggcgaatctgattcgaaca-3’(seqidno.6)，ms1-r：5’-ctagtctagagggtaaaaaagagagaggaataaga-3’(seqidno.7)。以野生型擬南芥ler花的cdna為模板，以ms1-f和ms1-r為引物進行pcr擴增，參照步驟(1)中所述的pcr反應體系和反應條件以及膠回收方法，獲得不含終止密碼子且序列長度為2016bp(見seqidno.2)的ms1基因片段，命名為ms1cds。將該膠回收產(chǎn)物和步驟(1)所得的克隆載體pmd19t-gr分別用xmai和xbai在37℃下進行過夜酶切反應(酶切反應體系(20ul)為：10xnebbuffer2ul，xmai1ul，xbai1ul，ms1基因片段或克隆載體pmd19t-gr16ul)，然后將酶切產(chǎn)物參照步驟(1)所述方法進行回收、t4連接酶(neb公司)連接、轉化、菌液pcr以及質(zhì)粒提取，最后構建成ms1cds和gr的克隆載體，命名為pmd19t-ms1cds-gr(見圖1)。(3)、以野生型擬南芥ler的dna為模板，以ms1pro-f和ms1pro-r為引物進行pcr擴增，參照步驟(1)中pcr的反應體系和反應條件以及膠回收方法，獲得序列長度為2981bp(見seqidno.3)的ms1啟動子序列，命名為ms1promoter；對該膠回收產(chǎn)物和載體pcactn分別用kpni和xbai在37℃下進行過夜雙酶切反應(酶切反應體系(20ul)為：10xnebbuffer2ul，kpni1ul，xbai1ul，ms1啟動子序列或載體16ul)，然后將酶切產(chǎn)物參照步驟(1)所述方法進行回收、t4連接酶(neb公司)連接、轉化、菌液pcr以及質(zhì)粒提取，最后構建成ms1promoter的克隆載體，命名為pcactn-ms1promoter(見圖1)。(4)、對步驟(2)所得的pmd19t-ms1cds-gr用spei和sali在37℃下進行過夜雙酶切反應；經(jīng)膠回收后，獲得序列長度為2853bp(見seqidno.10)的ms1和gr的融合基因片段，命名為ms1cds-gr；所述的酶切反應體系(20ul)為：10xnebbuffer2ul，spei1ul，sali1ul，pmd19t-ms1cds-gr克隆載體16ul。(5)、對步驟(3)所得的pcactn-ms1promoter用xbai和sali在37℃下進行過夜雙酶切反應，經(jīng)膠回收后，獲得線性化的克隆載體；所述的酶切反應體系(20ul)為：10xnebbuffer2ul，xbai1ul，sali1ul，pcactn-ms1promoter載體16ul。(6)用t4連接酶(neb公司)將步驟(4)所得的ms1cds-gr融合基因片段和步驟(5)所得線性化的克隆載體連接、轉化、菌液pcr檢測以及質(zhì)粒提取，最后構建成終載體，即含有地塞米松誘導系統(tǒng)的表達載體，命名為pms1pro-ms1cds-gr(見圖1)。然后將該終載體轉化到農(nóng)桿菌eha105菌株(方法參照薩姆布魯克《分子克隆實驗指南》第三版，科學出版社，2002年)，將轉化后的陽性菌株命名為eha105-pms1pro-ms1cds-gr。實施例2含有地塞米松誘導系統(tǒng)的轉基因擬南芥的制備按照如下方法進行：(1)、以雄性不育突變體ms1-1(購自擬南芥tair數(shù)據(jù)庫www.arabidopsis.org)為母本，以野生型擬南芥ler為父本雜交，獲得f1代種子；待該f1代植株生長至花蕾期時備轉化；(2)、農(nóng)桿菌溶液的制備：將實施例1中所得的陽性農(nóng)桿菌菌株eha105-pms1pro-ms1cds-gr接種于含有利福平和卡那霉素(終濃度均為50ug/ml)的液體lb培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)過夜；將菌液于4℃、2000r/min離心5min，再用5％的蔗糖溶液重懸，調(diào)od600值約為0.8，并加入表面活性劑silwetl-77(終濃度為0.05％)，混勻，獲得eha105-pms1pro-ms1cds-gr農(nóng)桿菌溶液；(3)、將步驟(1)所得f1代擬南芥的花序浸入步驟(2)所得的農(nóng)桿菌溶液里3秒，并輕輕攪動使整個花序覆蓋一層液體，隨后用吸水紙輕輕的吸干多余的農(nóng)桿菌液體，用保鮮膜輕輕的包裹整個花序；再用黑色塑料袋罩住整個植株，培養(yǎng)室暗培養(yǎng)24h后去除遮蓋物，于長日照下正常培養(yǎng)收種，獲得t0代種子。(4)、將100ml的1/2ms固體培養(yǎng)基(100ml蒸餾水中含ms基礎培養(yǎng)基0.443g，蔗糖3g，植物凝膠0.3g)，經(jīng)滅菌后(滅菌條件為120℃，15min)置于超凈工作臺冷卻到50℃左右，再加入遺傳霉素g418(終濃度為10mg/l)，搖勻后倒成培養(yǎng)基平板，備用。(5)、取(3)中所得的t0代種子均勻撒播到(4)的培養(yǎng)基平板上，平板正面朝上，先在4℃預處理2-3d，然后轉入人工培養(yǎng)室；7d后長出的綠色幼苗，即為轉有地塞米松誘導系統(tǒng)的t0代陽性植株，隨后轉移到土質(zhì)培養(yǎng)基生長。(6)、選擇不結實的t0代陽性植株，于幼蕾期均勻地噴施濃度為5umol/l的地塞米松溶液，每天1次，直到植株開花結實，收獲t1代種子；隨后如此連續(xù)4代繼續(xù)噴施地塞米松溶液，將t0代陽性植株通過連續(xù)4代自交，且每代噴施地塞米松溶液誘導，最終獲得穩(wěn)定純合帶有地塞米松誘導系統(tǒng)且受地塞米松誘導育性恢復好的ms1-1背景的轉基因擬南芥3株(見圖2)，將該材料命名為ms1-gr。實施例3含有地塞米松誘導系統(tǒng)的轉基因擬南芥育性恢復材料鑒定試驗(一)、花粉育性鑒定和莢果長度的比較(1)在實施例2獲得的ms1-gr和受地塞米松誘導后育性得到恢復單株的盛花期，分別選取三朵小花的花藥并擠出花粉粒，經(jīng)孔雀綠染液(其組成成分及其比例見表1)染色10min，然后在光學顯微鏡下觀察，拍照記錄。(2)在實施例2獲得的ms1-gr和受地塞米松誘導后育性得到恢復單株的成熟初期，分別取3個莢果在體式顯微鏡下解剖，并觀察種子形態(tài)。表1孔雀綠染液的組成成分及其比例成分含量(100ml)苯酚5g水合三氯乙醛5g橙黃g(1％的水溶液)0.5ml孔雀石綠(1％的95％酒精溶液)1ml冰醋酸2ml酸性品紅(1％的水溶液)5ml95％酒精溶液10ml甘油25ml滅菌超純水50ml結果(見圖3)ms1-gr花藥內(nèi)無花粉粒，受地塞米松誘導后育性得到恢復單株的花藥內(nèi)均含有可育花粉粒；所獲得的3株穩(wěn)定純合帶有地塞米松誘導系統(tǒng)經(jīng)地塞米松誘導后的單株均能正常結實(見圖4)。(二).利用分子標記對育性恢復材料的遺傳背景進行鑒定提取實施例2獲得的ms1-gr和受地塞米松誘導后育性得到恢復單株的dna，以gr-f和gr-r為引物進行pcr擴增；其pcr的反應體系(20ul)為：taq酶0.2ul，dntp2ul，10xbuffer2ul，dna1ul，超純水14.8ul；pcr的反應條件為：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min，20℃2min。將所得pcr擴增產(chǎn)物進行電泳。結果(見圖5)ms1-gr和3株恢復材料分別獲得長度為828bp的pcr擴增產(chǎn)物，說明均含有ms1-gr誘導系統(tǒng)，由此說明該套利用核不育轉基因擬南芥篩選育性恢復材料的方法是成功的。sequencelisting<110>四川農(nóng)業(yè)大學<120>一種含有地塞米松誘導系統(tǒng)的表達載體及其應用<160>10<170>patentinversion3.5<210>1<211>828<212>dna<213>musmusculus<400>1caagccactgcaggagtctcacaagacacttcggaaaatcctaacaaaacaatagttcct60gcagcattaccacagctcacccctaccttggtgtcactgctggaggtgattgaacccgag120gtgttgtatgcaggatatgatagctctgttccagattcagcatggagaattatgaccaca180ctcaacatgttaggtgggcgtcaagtgattgcagcagtgaaatgggcaaaggcgatacca240ggcttcagaaacttacacctggatgaccaaatgaccctgctacagtactcatggatgttt300ctcatggcatttgccctgggttggagatcatacagacaatcaagtggaaacctgctctgc360tttgctcctgatctgattattaatgagcagagaatgtctctaccctgcatgtatgaccaa420tgtaaacacatgctgtttgtctcctctgaattacaaagattgcaggtatcctatgaagag480tatctctgtatgaaaaccttactgcttctctcctcagttcctaaggaaggtctgaagagc540caagagttatttgatgagattcgaatgacttatatcaaagagctaggaaaagccatcgtc600aaaagggaagggaactccagtcagaactggcaacggttttaccaactgacaaagcttctg660gactccatgcatgaggtggttgagaatctccttacctactgcttccagacatttttggat720aagaccatgagtattgaattcccagagatgttagctgaaatcatcactaatcagatacca780aaatattcaaatggaaatatcaaaaagcttctgtttcatcaaaaatga828<210>2<211>2016<212>dna<213>arabidopsisthaliana<400>2atggcgaatctgattcgaacagaccatcagcaacatattccaaagaagaggaagagaggg60gaaagtagagtttttaggctgaagacgttcggagagtctggacatccagctgagatgaac120gagttgtcttttcgagataacctcgctaaactacttgagtttggtcactttgagagctcc180ggtctaatgggaagttggtcttttcagctcgagattcaacgaaatccaaatcctctctat240gttcttctctttgtcgtagaagagcccatcgaagcctctctcaatctccgttgcaaccat300tgccaatatgttggttggggaaatcaaatgatatgcaacaagaagtaccatttcgtgatc360ccctcaaaggaaacaatggcggcttttttaaaactggaaggtggaggctacgcttttccc420gaaaaggaaagtttctcccatcttgtggagcttcaaggccatgtccttcacggcttcttt480cactccaacggatttggtcacttgctctctctcaacggcattgaaaccggctccgactta540accggtcatcaggtcatggatttgtgggaccggctctgcaccggtttaaaggccaggaaa600atagggttgaatgacgcgtcgcacaaaaaaggaatggagttgaggctgctgcatggggta660gcaaaaggagagccatggttcggtcgttggggctaccggttcgggtcagggacatacgga720gtgactcaaaagatttacgagaaggcacttgagtcggtccgtaacatacccttgtgcttg780cttaaccatcacctaaccagccttaaccgagaaactccaatcctcttgtcaaagtaccaa840agtttatccaccgagccattgatcactctcagtgacctcttcaggttcatgcttcatctc900cattcacgtcttccaagagataactacatgagtaactcccgaaaccaaatcatctccatt960gatagtaccaactgcagatggtctcaaaaacggatccaaatggctatcaaagtggtcata1020gagtcactgaaaagagtcgaataccgatggatatcgagacaagaagtgagggatgcagct1080agaaattacattggggacactggtttgcttgattttgtgttgaagtcgcttgggaaccag1140gtggttggaaactatttggtccgacgtagtctaaatccggtgaagaaagtgctagagtat1200tccttggaggatatatcaaatttgttaccaagtagtaacaatgaactcataacccttcaa1260aaccaaaactcaatggggaagatggcgacaaacggtcacaataagatcacaagaggtcaa1320gttatgaaagacatgttttatttttacaaacacattctcatggactacaagggagtgtta1380ggccccataggaggtatattgaaccaaatcggaatggcttcaagagcaatcctcgacgct1440aagtacttcatcaaagagtatcactacattagagatacatcggcgaaaacgttacactta1500gatcgaggggaagaattaggaatattctgcacgatcgcgtggaaatgtcatcatcataac1560aacgagataaaagttcctccacaagaatgcattgtagtgaagaaagatgcaacattgagt1620gaagtgtacggagaggcagaaagagtgtttagagatatctattgggaactaagagacgtc1680gtggtggagtcagtggtgggtggtcaaatagagatcacaagggtcgatgaaatggccttg1740aatgggaataagggattggtgttagaagggaacgtaggaatgatgatgaacattgaagtg1800acgaaatgttatgaagatgatgataaaaagaaggataagagaatagagtgtgagtgtgga1860gcaacggaagaagatggagagagaatggtgtgttgtgatatttgtgaagtatggcaacac1920acaaggtgtgttggtgttcaacacaatgaggaagtgcctcgcatttttctttgtcaaagt1980tgtgatcaacatcttattcctctctcttttttaccc2016<210>3<211>2981<212>dna<213>arabidopsisthaliana<400>3gagaccctctctcatcttgcgtgtatcttctcctctatctatatatatataacagccact60aacatgcagacatcaaactatctctctttaaatctcaagaacaagaactaaactactact120agtcttcaccaaggtaaagctactttggaacccgagaaccaagttaatttgttctcatcg180aattttttttgttctcatatgttgaaattttgttattgtcatcttcactttttgattgat240cgatagaaaaataagtattcaattgatcaattctttttatatatatacatgttttataaa300ccatggatctccatctaaagttttgttttactgtgtttcttattctgattcttgtagaat360aatatatcaacacacatagtatactcttcttggaaggcaaggaacatgaatcaagaagct420gcgagtaaccttggacttgatctgaaactaaatatttcaccgtcgttggattcatctttg480ctcactgagagttcatcgtcatcgttatgctcggaggaagctgagggtggaggaggagag540gctaaatcaatggtggtcgttggctgccctaattgcatcatgtacatcatcacttcttta600gagaatgaccctagatgccctagatgcaacagccatgttttgcttgattttctcacagga660aaccatagcaagaagagcactagttaaaaaaaaaaataaaaaaaaaatacataatattaa720attaaggatgttcttttatttttctttcttttttcttttccttaatttgttgccacattt780attgatagtttgaattaatccacaatgaacggatatgttcataaaatcgaaacctatata840cttatgtttttaaaacatccttaacttcatttgtaatattgactgcttaacgatggataa900ttcttgtagaaaactaagcaatattaatattgattctttgcaacgggtgattacaaaaat960ttaaacttggattaatagctagtataaatgatggatgtgtcattgtgtcctcatcaaaag1020gttacgtattcggactattgcgatatttaattttataaatggaaaatggtcgttgttgac1080ttgttataagttcaatgtatatgtacatggcacaattaattatgtttttaatatgaaaaa1140tgtggaacaatgacttttttttcttttcctttttttgcactatgtaattctagcgttaaa1200tgcgaagtatatacataaatatatacacatcatacgtcaaacaataaataggtttggttt1260acttgttaccaaagttgttgaactaacaaattaaatgtttataaaaacatgaaaaagagt1320tatgcttattataaatgtgaaaaatcttcacctaaacttactataaaaaaaatgcatgtt1380ggttttacattaatgtcggattcaacattacgtgtgttttgttcctttccccaactatca1440aaagaaacaacacgtatcctttaagtagatttctcacatttttatcattatatttaccgc1500tactggcaatttcaattggacaaaccaaaaccaaatatatattttttcgctgacgtaaga1560cctatcaaagaaatctatcattcaaccaacaactataaaaacgaatcaaagtcacttgtt1620ggctactattcaactaacaatataatgtatcgctgcctcgctggtcgttgttacttgtta1680ctaagaatcgtgaaacaaaaatgatacaaaattatcaacaattattcagtctacgtacgt1740atatacctacttatacta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