本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種crispr/ncas9介導(dǎo)的定點(diǎn)堿基替換在植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

crispr/cas9介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)已經(jīng)成為分子生物學(xué)中最強(qiáng)大的工具之一。首次在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，由sgrna和cas9兩部分組成(jineketal.,2012)。crispr/cas9是通過自身的核酸內(nèi)切酶活性引起靶位點(diǎn)dna序列雙鏈斷裂(double-strandbreaks，dsbs)，然后通過非同源末端連接(non-homologousendjoining，nhej)或同源重組介導(dǎo)的修復(fù)(homology-directedrepair，hdr)兩種方式引入突變。nhej途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生的突變大部分為核苷酸的插入或缺失，造成移碼突變，而hdr則由同源供體dna介導(dǎo)片段插入或核苷酸修正(jineketal.,2012)。crispr/cas9系統(tǒng)對靶位點(diǎn)的識別依賴于核酸之間堿基互補(bǔ)配對，可對任何緊隨pam(ngg)的20bp的靶點(diǎn)序列進(jìn)行編輯，且其靶點(diǎn)在基因組中的分布頻率很高，因此對于需要定點(diǎn)編輯的靶基因，更容易找到合適的靶位點(diǎn)。另外crispr/cas9系統(tǒng)可同時(shí)對同一基因的不同位點(diǎn)或多個(gè)基因的位點(diǎn)進(jìn)行定向編輯，使其運(yùn)用更加靈活。此外，crispr/cas9系統(tǒng)操作簡單快捷，每次打靶只需替換原有載體上20-30bp的核苷酸序列，更適宜規(guī)?；?，高通量操作(congetal.,2013；fengetal.,2014；gaoandzhao,2014；zhouetal.,2014；lawrensonetal.,2015；liuetal.,2015；maetal.,2015；wangetal.,2015；xieetal.,2015；pauliiiandqi,2016)。隨著crispr/cas9技術(shù)在人類與動物細(xì)胞系中建立并應(yīng)用，經(jīng)過改造的crispr/cas9系統(tǒng)也迅速地被應(yīng)用到擬南芥、煙草、高粱、水稻、小麥、玉米等不同植物基因組的定向編輯研究中，并且獲得較高的誘導(dǎo)突變率和可穩(wěn)定遺傳的基因組編輯植株(shanetal.,2013；puchtaandfauser,2014；voytasandgao,2014；lietal.,2015；maetal.,2015；svitashevetal.,2015；endoetal.,2016；gaoetal.,2016；sunetal.,2016)。

盡管crispr/cas9作為一種新的靶向基因修飾技術(shù)，展現(xiàn)了廣闊的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景，并在農(nóng)作物改良中得到廣泛應(yīng)用，但目前主要局限于基因隨機(jī)突變和敲除。農(nóng)作物中含有大量農(nóng)藝性狀是由單堿基的突變導(dǎo)致，傳統(tǒng)crispr/cas9技術(shù)引入dsb后，與非同源末端連接的隨機(jī)過程相比，hdr總是以相當(dāng)?shù)偷念l率發(fā)生，只有少數(shù)報(bào)道表明crispr/cas9介導(dǎo)的hdr在作物中可行(lietal.,2015；svitashevetal.,2015；endoetal.,2016；shietal.,2016；sunetal.,2016)，使得大量農(nóng)藝性狀無法得到快速的改良。

nishidaetal.(2016)將dcas9或nicked-cas9(ncas9,d10a)與來自七鰓鰻(sealamprey)免疫系統(tǒng)的激活誘導(dǎo)性胞苷脫氨(activation-inducedcytidinedeaminase，aid)融合在一起。在正常情況下，這種aid酶在免疫球蛋白和抗體基因中產(chǎn)生突變從而讓免疫系統(tǒng)具有多樣性。aid作用在單鏈dna上，將胞嘧啶(c)替換為尿嘧啶(u)，隨后在一輪dna復(fù)制中，這種尿嘧啶(u)被轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶(t)。研究結(jié)果表明當(dāng)在向?qū)na(grna)的引導(dǎo)下，這種蛋白復(fù)合物靶向作用于can1基因，而且相對于非靶向的選擇性標(biāo)志物，can1基因發(fā)生突變的頻率增加了1000倍。利用全基因組測序，研究人員發(fā)現(xiàn)很少的脫靶突變，只比背景突變率略有增加。komoretal.(2016)將ncas9(d10a)與胞苷脫氨酶融合，在grna的指導(dǎo)下，ncas9(d10a)到達(dá)指定位點(diǎn)，可作為“單堿基編輯器”將在非目標(biāo)鏈的第4-8位目標(biāo)胞嘧啶定點(diǎn)替換。通過dna復(fù)制或修復(fù)后，尿嘧啶被轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，最終由c突變成t，或者g突變成a。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供如下(1)-(7)中任一種所述的應(yīng)用：

(1)crispr/cas9系統(tǒng)、脫氨酶和植物基因表達(dá)啟動子在定點(diǎn)編輯植物或農(nóng)作物基因中的應(yīng)用；

所述植物基因表達(dá)啟動子啟動crispr/cas9系統(tǒng)中cas9核酸酶和脫氨酶的表達(dá)；

(2)crispr/cas9系統(tǒng)和脫氨酶在定點(diǎn)編輯植物或農(nóng)作物基因中的應(yīng)用；

(3)由cas9核酸酶和脫氨酶組成的融合蛋白、待編輯基因的sgrna和植物基因表達(dá)啟動子在定點(diǎn)編輯植物或農(nóng)作物基因中的應(yīng)用；

所述植物基因表達(dá)啟動子驅(qū)動由所述cas9核酸酶和所述脫氨酶組成的融合蛋白基因的表達(dá)；

(4)crispr/cas9系統(tǒng)、脫氨酶、尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白和植物基因表達(dá)啟動子在定點(diǎn)編輯植物或農(nóng)作物基因中的應(yīng)用；

所述植物基因表達(dá)啟動子啟動crispr/cas9系統(tǒng)中cas9核酸酶、脫氨酶和尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白的表達(dá)；

(5)crispr/cas9系統(tǒng)、脫氨酶和尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白在定點(diǎn)編輯植物或農(nóng)作物基因中的應(yīng)用；

(6)由cas9核酸酶、脫氨酶和尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白組成的融合蛋白、待編輯基因的sgrna和植物基因表達(dá)啟動子在定點(diǎn)編輯植物或農(nóng)作物基因中的應(yīng)用；

所述植物基因表達(dá)啟動子驅(qū)動由所述cas9核酸酶、所述脫氨酶和所述尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白組成的融合蛋白的編碼基因的表達(dá)；

(7)由cas9核酸酶、脫氨酶、連接所述cas9核酸酶與所述脫氨酶的連接肽和尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白組成的融合蛋白、待編輯基因的sgrna和植物基因表達(dá)啟動子在定點(diǎn)編輯植物或農(nóng)作物基因中的應(yīng)用；

所述植物基因表達(dá)啟動子驅(qū)動由所述cas9核酸酶、所述脫氨酶、所述連接肽和所述尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白組成的融合蛋白的編碼基因的表達(dá)。

上述應(yīng)用中，所述脫氨酶為apobec1，其編碼基因序列為序列1第4838-5524位；

所述尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白為uracildnaglycosylaseinhibitor，其編碼基因序列為序列1第392-688位；

所述cas9核酸酶為ncas9(d10a)，其編碼基因序列為序列1第689-4789位；

所述連接肽的編碼基因序列為序列1第4790-4837位；

所述植物基因表達(dá)啟動子的核苷酸序列為序列1第5545-7535位；

所述融合蛋白的編碼基因序列為序列1第392-5524位；

所述待編輯基因?yàn)閛ssbeiib和ospds；

所述sgrna的核苷酸序列為序列1第7785-8268位或序列2第7785-8268位或序列3第7785-8268位。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種定點(diǎn)編輯植物或農(nóng)作物基因的方法。

本發(fā)明提供的方法為如下(1)或(2)：

(1)所述方法包括如下步驟：將cas9核酸酶編碼基因、脫氨酶編碼基因、待編輯基因的sgrna的編碼基因和植物基因啟動子導(dǎo)入出發(fā)植物，實(shí)現(xiàn)出發(fā)植物中靶基因的定點(diǎn)編輯；

(2)所述方法包括如下步驟：將cas9核酸酶編碼基因、脫氨酶編碼基因、連接所述cas9核酸酶與所述脫氨酶的連接肽的編碼基因、尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白的編碼基因、待編輯基因的sgrna的編碼基因和植物基因啟動子導(dǎo)入出發(fā)植物，實(shí)現(xiàn)出發(fā)植物中靶基因的定點(diǎn)編輯。

上述方法中，

(1)中，所述cas9核酸酶編碼基因、所述脫氨酶編碼基因、所述待編輯基因的sgrna的編碼基因和所述植物基因啟動子通過重組質(zhì)粒導(dǎo)入出發(fā)植物中；

所述重組質(zhì)粒包括由cas9核酸酶和脫氨酶組成融合蛋白的編碼基因、所述待編輯基因的sgrna的編碼基因和植物基因啟動子；

所述植物基因啟動子驅(qū)動由所述cas9核酸酶和所述脫氨酶組成的融合蛋白基因的表達(dá)；

(2)中，所述cas9核酸酶編碼基因、所述脫氨酶編碼基因、所述連接所述cas9核酸酶與所述脫氨酶的連接肽的編碼基因、所述尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白基因、所述待編輯基因的sgrna的編碼基因和所述植物基因啟動子通過重組質(zhì)粒導(dǎo)入出發(fā)植物中；

所述重組質(zhì)粒包括由cas9核酸酶、脫氨酶、連接所述cas9核酸酶與所述脫氨酶的連接肽和尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白組成的融合蛋白的編碼基因、所述待編輯基因的sgrna的編碼基因和植物基因啟動子；

所述植物基因啟動子驅(qū)動由所述cas9核酸酶、所述脫氨酶、所述連接所述cas9核酸酶與所述脫氨酶的連接肽和所述尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白組成的融合蛋白的編碼基因的表達(dá)。

上述方法中，所述脫氨酶為apobec1，其編碼基因序列為序列1第4838-5524位；

所述尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白為uracildnaglycosylaseinhibitor，其編碼基因序列為序列1第392-688位；

所述cas9核酸酶為ncas9(d10a)，其編碼基因序列為序列1第689-4789位；

所述連接肽的編碼基因序列為序列1第4790-4837位；

所述植物基因表達(dá)啟動子的核苷酸序列為序列1第5545-7535位；

所述融合蛋白的編碼基因序列為序列1第392-5524位；

所述待編輯基因?yàn)閛ssbeiib和ospds；

所述sgrna的核苷酸序列為序列1第7785-8268位或序列2第7785-8268位或序列3第7785-8268位。

上述方法中，所述重組質(zhì)粒的核苷酸序列為序列1、序列2或序列3。

上述方法中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物具體為水稻；所述水稻品種具體為kitaake(oryzasatival.subsp.japonica)。

上述重組質(zhì)粒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種定點(diǎn)編輯植物基因組的系統(tǒng)。

本發(fā)明提供的定點(diǎn)編輯植物基因組的系統(tǒng)包括上述重組質(zhì)粒。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供上述重組質(zhì)粒或上述系統(tǒng)的新用途。

本發(fā)明提供了上述重組質(zhì)?；蛏鲜鱿到y(tǒng)在定點(diǎn)編輯植物或農(nóng)作物基因中的應(yīng)用。

上述應(yīng)用或方法中，所述定點(diǎn)編輯為定點(diǎn)堿基替換。

上述應(yīng)用或方法中，所述crispr/cas9系統(tǒng)為crispr/ncas9系統(tǒng)，所述crispr/ncas9系統(tǒng)具體為crispr/ncas9(d10a)系統(tǒng)。

本發(fā)明提供了一種定點(diǎn)編輯植物基因組的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括be3植物表達(dá)載體，be3植物表達(dá)載體表達(dá)由ncas9(d10a)、脫氨酶(apobec1)和尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白(ugi)組成的融合蛋白，并以水稻ospds和ossbeiib為靶基因?qū)υ撓到y(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，在所選的3個(gè)靶點(diǎn)中，均獲得預(yù)期定點(diǎn)突變植株，既在靶點(diǎn)序列的4-8位置的c突變成t(或g突變成a)，在水稻中實(shí)現(xiàn)了堿基的精確的點(diǎn)突變，且效率最高達(dá)到20％左右，而且該方法操作簡單、可行，與構(gòu)建crispr/cas9并無明顯差別，為農(nóng)作物育種提供了一種可行的有效的堿基替換方法，在農(nóng)業(yè)育種方面具有強(qiáng)大的應(yīng)用潛力，為快速改良農(nóng)作物重要農(nóng)藝性狀提供了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為pcxun-be3載體框架圖。

圖2為轉(zhuǎn)基因植株的鑒定。注：a為載體t-dna結(jié)構(gòu)圖及引物所在位置。b，c和d分別為p2，s3和s5轉(zhuǎn)基因植株的cas9(d10a)，grna及hptii基因的檢測。

圖3為ossbeiib基因s5靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因植株及序列的鑒定。注：a為be3定點(diǎn)突變系統(tǒng)原理圖。b為ossbeiib基因結(jié)構(gòu)圖及s5靶點(diǎn)所在位置，pcr產(chǎn)物酶切鑒定圖?！?”表示pcr產(chǎn)物經(jīng)過酶切，“-”表示pcr產(chǎn)物沒經(jīng)過酶切。c為所有植株pcr產(chǎn)物的克隆測序結(jié)果。d為s5-17和s5-26兩個(gè)株系基因型測序峰圖。pam由藍(lán)色表示，預(yù)期突變成的堿基由紅色表示，非預(yù)期的突變堿基由綠色表示。

圖4為ossbeiib基因s3靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因植株及序列的鑒定。注：a為ossbeiib基因結(jié)構(gòu)圖及s3靶點(diǎn)所在位置，pcr產(chǎn)物電泳圖。b為所有植株pcr產(chǎn)物的克隆測序結(jié)果。c為s3-1和s3-18兩個(gè)株系基因型測序峰圖。pam由藍(lán)色表示，預(yù)期突變成的堿基由紅色表示，非預(yù)期的突變堿基由綠色表示。

圖5為ossbeiib基因p2靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因植株及序列的鑒定。注：a為ossbeiib基因結(jié)構(gòu)圖及p2靶點(diǎn)所在位置，pcr產(chǎn)物酶切鑒定圖?！?”表示pcr產(chǎn)物經(jīng)過酶切，“-”表示pcr產(chǎn)物沒經(jīng)過酶切。c為所有植株pcr產(chǎn)物的克隆測序結(jié)果。d為p2-21和p2-79兩個(gè)株系基因型測序峰圖。pam由藍(lán)色表示，預(yù)期突變成的堿基由紅色表示，非預(yù)期的突變堿基由綠色表示。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的用于水稻轉(zhuǎn)化的水稻材料為kitaake(oryzasatival.subsp.japonica)，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。

下述實(shí)施例中的pcmv-be3載體在文獻(xiàn)“komorac,kimyb,packerms,zurisja,liudr.2016.programmableeditingofatargetbaseingenomicdnawithoutdouble-strandeddnacleavage.nature.”中公開過，公眾可以從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得。

下述實(shí)施例中所用的內(nèi)切酶、試劑盒和pcr酶均購自試劑公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

下述實(shí)施例中的引物和dna合成及測序均在華大公司完成。

下述實(shí)施例中的aam培養(yǎng)基(ph5.2)是將mssalts&vitamins鹽、蔗糖、mes、葡萄糖、酪蛋白氨基酸、乙酰丁香酮和100ml10xaaaminoacids混勻得到的培養(yǎng)基，其中各溶質(zhì)在aam培養(yǎng)基中的濃度分別為4.3g/lmssalts&vitamins鹽、68.5g/l蔗糖、0.5g/lmes、36g/l葡萄糖、500mg/l酪蛋白氨基酸、40mg/l乙酰丁香酮。上述10xaaaminoacids溶液為將l-谷氨酰胺、l-天(門)冬氨酸、l-精氨酸、甘氨酸和水混勻得到的溶液，其中各溶質(zhì)在10xaaaminoacids溶液中的濃度為：8.76g/ll-谷氨酰胺、2.66g/ll-天(門)冬氨酸、1.74g/ll-精氨酸和75mg/l甘氨酸。

下述實(shí)施例中的r1培養(yǎng)基(ph5.8)是將ms&vitamins鹽、蔗糖、mes、酪蛋白氨基酸、l-脯氨酸、2，4-d、植物凝膠和水混勻得到的培養(yǎng)基，其中各溶質(zhì)在r1培養(yǎng)基中的濃度分別為：4.3g/lms&vitamins鹽、30g/l蔗糖、0.5g/lmes、300mg/l酪蛋白氨基酸、2.8g/ll-脯氨酸、2mg/l2，4-d、4g/l植物凝膠。

下述實(shí)施例中的r2培養(yǎng)基(ph5.2)是將ms&vitamins鹽、蔗糖、mes、酪蛋白氨基酸、2，4-d、植物凝膠、乙酰丁香酮和水混勻得到的培養(yǎng)基，其中各溶質(zhì)在r2培養(yǎng)基中的濃度分別為：4.3g/lms&vitamins鹽、30g/l蔗糖、0.5g/lmes、300mg/l酪蛋白氨基酸、2mg/l2，4-d、4g/l植物凝膠、20mg/ml乙酰丁香酮。

下述實(shí)施例中的r1篩選培養(yǎng)基(ph5.8)是將ms&vitamins鹽、蔗糖、mes、酪蛋白氨基酸、l-脯氨酸、2，4-d、植物凝膠和水混勻得到的培養(yǎng)基，其中各溶質(zhì)在r1篩選培養(yǎng)基中的濃度為：4.3g/lms&vitamins鹽、30g/l蔗糖、0.5g/lmes、300mg/l酪蛋白氨基酸、2.8g/ll-脯氨酸、2mg/l2，4-d、4g/l植物凝膠。

下述實(shí)施例中的r4分化培養(yǎng)基(ph5.8)是將ms&vitamins鹽、蔗糖、mes、酪蛋白氨基酸、山梨醇、激動素、naa、植物凝膠和水混勻得到的培養(yǎng)基，其中各溶質(zhì)在r4分化培養(yǎng)基中的濃度分別為：4.3g/lms&vitamins鹽、30g/l蔗糖、0.5g/lmes、2g/l酪蛋白氨基酸、30g/l山梨醇、2mg/l激動素、1mg/lnaa、4g/l植物凝膠。

下述實(shí)施例中的r5培養(yǎng)基(ph5.8)是將ms&vitamins鹽、蔗糖、mes、植物凝膠和水混勻得到的培養(yǎng)基，其中各溶質(zhì)在r5培養(yǎng)基中的濃度分別為：2.15g/lms&vitamins鹽、15g/l蔗糖、0.5g/lmes、2g/l植物凝膠。

下述實(shí)施例中所用的引物如表1所示：

表1、引物序列

下述實(shí)施例中靶點(diǎn)位置及序列如表2所示。

表2、靶點(diǎn)位置及序列

注：pam位點(diǎn)由波浪線表示，脫氨酶靶點(diǎn)由加粗黑體表示，g#和c#，#代表堿基所在位置，遠(yuǎn)離pam位點(diǎn)的起始位點(diǎn)為第一個(gè)堿基。酶切位點(diǎn)由下劃線表示。

實(shí)施例1、一種crispr/ncas9介導(dǎo)的定點(diǎn)堿基替換在植物中的應(yīng)用

一、表達(dá)載體的構(gòu)建

1、pcxun-be3載體的構(gòu)建

(1)用限制性內(nèi)切酶bamhi酶切pcxun-cas9載體，得到線性化的載體；

(2)以be-f/r為引物，pcmv-be3載體為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物，該pcr產(chǎn)物的5’和3’最末端的序列分別和線性化載體兩末端序列完全一致；

(3)采用全式金公司的peasy-uniseamlesscloningandassemblykit將步驟(1)獲得的線性化的載體、步驟(2)獲得的pcr產(chǎn)物通過同源重組進(jìn)行連接，獲得載體pcxun-be3(圖1)，從圖中可以看出：pcxun-be3載體包括表達(dá)盒甲，該表達(dá)盒甲依次包括玉米u(yù)biquitin啟動子、脫氨酶(apobec1)的編碼基因、連接ncas9(d10a)核酸酶和脫氨酶的連接肽(xtenlinker)、ncas9(d10a)核酸酶的編碼基因、植物表達(dá)啟動子ubi、尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白(ugi)的編碼基因。

2、利用重疊pcr方法構(gòu)建p2、s3及s5的grna表達(dá)盒pcxun-be3-p2、pcxun-be3-s3和pcxun-be3-s5載體

(1)s5的grna表達(dá)盒pcxun-be3-s5的構(gòu)建

a、用限制性內(nèi)切酶pmei酶切pcxun-be3載體，得到線性化的載體；

b、以posu3-sgrna質(zhì)粒為模板，分別利用引物s5-f/hrpme-u3r和hrpme-u3f/s5-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物1:1混合后做為模板，用引物hrpme-u3f/hrpme-u3r進(jìn)行擴(kuò)增，回收pcr產(chǎn)物；

c、采用全式金公司的peasy-uniseamlesscloningandassemblykit將步驟a獲得的線性化的載體、步驟b獲得的pcr產(chǎn)物通過同源重組進(jìn)行連接，鑒定陽性克隆并測序驗(yàn)證，得到s5的grna表達(dá)盒pcxun-be3-s5。

經(jīng)過測序驗(yàn)證：s5的grna表達(dá)盒pcxun-be3-s5的核苷酸序列為序列1，其中序列1的第392-5524位為由ncas9(d10a)核酸酶、脫氨酶(apobec1)、連接ncas9(d10a)核酸酶和脫氨酶的連接肽(xtenlinker)、尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白(ugi)組成的融合蛋白be3的編碼基因序列、第5545-7535位為植物基因表達(dá)啟動子ubi的核苷酸序列，第7785-8268位為sgrna序列。

(2)s3的grna表達(dá)盒pcxun-be3-s3的構(gòu)建

a、用限制性內(nèi)切酶pmei酶切pcxun-be3載體，得到線性化的載體；

b、以posu3-sgrna質(zhì)粒為模板，分別利用引物s3-f/hrpme-u3r和hrpme-u3f/s3-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物1:1混合后做為模板，用引物hrpme-u3f/hrpme-u3r進(jìn)行擴(kuò)增，回收pcr產(chǎn)物；

c、采用全式金公司的peasy-uniseamlesscloningandassemblykit將步驟a獲得的線性化的載體、步驟b獲得的pcr產(chǎn)物通過同源重組進(jìn)行連接，鑒定陽性克隆并測序驗(yàn)證，得到s3的grna表達(dá)盒pcxun-be3-s3。

經(jīng)過測序驗(yàn)證：s3的grna表達(dá)盒pcxun-be3-s3的核苷酸序列為序列2，其中序列2的第392-5524位為由ncas9(d10a)核酸酶、脫氨酶(apobec1)、連接ncas9(d10a)核酸酶和脫氨酶的連接肽(xtenlinker)、尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白(ugi)組成的融合蛋白be3的編碼基因序列、第5545-7535位為植物基因表達(dá)啟動子ubi的核苷酸序列，第7785-8268位為sgrna序列。

(3)p2的grna表達(dá)盒pcxun-be3-p2的構(gòu)建

a、用限制性內(nèi)切酶pmei酶切pcxun-be3載體，得到線性化的載體；

b、以posu3-sgrna質(zhì)粒為模板，分別利用引物p2-f/hrpme-u3r和hrpme-u3f/p2-r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物1:1混合后做為模板，用引物hrpme-u3f/hrpme-u3r進(jìn)行擴(kuò)增，回收pcr產(chǎn)物；

c、采用全式金公司的peasy-uniseamlesscloningandassemblykit將步驟a獲得的線性化的載體、步驟b獲得的pcr產(chǎn)物通過同源重組進(jìn)行連接，鑒定陽性克隆并測序驗(yàn)證，得到p2的grna表達(dá)盒pcxun-be3-p2。

經(jīng)過測序驗(yàn)證：p2的grna表達(dá)盒pcxun-be3-p2的核苷酸序列為序列3，其中序列3的第392-5524位為由ncas9(d10a)核酸酶、脫氨酶(apobec1)、連接ncas9(d10a)核酸酶和脫氨酶的連接肽(xtenlinker)、尿嘧啶dna糖基化酶抑制蛋白(ugi)組成的融合蛋白be3的編碼基因序列、第5545-7535位為植物基因表達(dá)啟動子ubi的核苷酸序列，第7785-8268位為sgrna序列。

二、重組菌的構(gòu)建

分別將步驟一獲得的重組質(zhì)粒pcxun-be3-s5、pcxun-be3-s3和pcxun-be3-p2導(dǎo)入農(nóng)桿菌eha105，分別得到重組農(nóng)桿菌pcxun-be3-s5/eha105、pcxun-be3-s3/eha105和pcxun-be3-p2/eha105。

三、轉(zhuǎn)基因水稻的獲得

1、分別將重組農(nóng)桿菌pcxun-be3-s5/eha105、pcxun-be3-s3/eha105及pcxun-be3-p2/eha105在lb培養(yǎng)基上培養(yǎng)兩天后，收集農(nóng)桿菌，并用aam培養(yǎng)基重懸，od600調(diào)到0.3-0.5，分別得到od600為0.3-0.5的菌液。

2、選取飽滿的kitaake水稻種子，剝?nèi)シN皮，滅菌洗滌后，均勻的點(diǎn)入r1培養(yǎng)基中，28℃持續(xù)光照2-3周誘導(dǎo)愈傷組織的形成。將形成的愈傷組織轉(zhuǎn)移到新的r1培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-5天，然后分別轉(zhuǎn)移到上述od600為0.3-0.5的菌液中侵染5分鐘，侵染后用濾紙吸干表面菌液并轉(zhuǎn)移到r2培養(yǎng)基上在25℃下培養(yǎng)三天，再轉(zhuǎn)移至含有濃度為50mg/l潮霉素的r1篩選培養(yǎng)基上，在28℃條件下持續(xù)光照2周后轉(zhuǎn)移至新的含有濃度為50mg/l潮霉素的r1篩選培養(yǎng)基，在28℃條件下持續(xù)光照2周。選取生長良好呈嫩黃色的陽性愈傷組織，用無菌鑷子移至含有濃度為50mg/l潮霉素的r4分化培養(yǎng)基中，在28℃條件下持續(xù)光照培養(yǎng)。待分化出來的幼苗長至2-5mm時(shí)，將幼苗轉(zhuǎn)入不含激素和抗生素的r5培養(yǎng)基中，在28℃條件下持續(xù)光照培養(yǎng)2-3周，之后移入土中置于溫室中生長(培養(yǎng)條件為：溫度28-30℃，光照為16h光照/8h黑暗)，分別得到t0代轉(zhuǎn)p2水稻植株、t0代轉(zhuǎn)s3水稻植株和t0代轉(zhuǎn)s5水稻植株。

3、轉(zhuǎn)基因水稻植株的鑒定

根據(jù)載體序列分別設(shè)計(jì)檢測be3，grna和hptii基因引物be3-f/r，u3-f/r和hptii-f/r(表2)，對獲得的所有t0代轉(zhuǎn)s5水稻植株、t0代轉(zhuǎn)s3水稻植株和t0代轉(zhuǎn)p2水稻植株進(jìn)行pcr鑒定并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

轉(zhuǎn)基因水稻植株的pcr鑒定結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明：共獲得52顆陽性t0代轉(zhuǎn)s5水稻植株、38顆陽性t0代轉(zhuǎn)s3水稻植株及88顆陽性t0代轉(zhuǎn)p2水稻植株。

四、定點(diǎn)編輯的檢測

1、定點(diǎn)編輯ossbeiib的s5靶點(diǎn)的基因型鑒定

利用引物s5testf/r對步驟三獲得的52顆陽性t0代轉(zhuǎn)s5水稻植株的基因組dna進(jìn)行擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物，用bstni酶切pcr產(chǎn)物，如果轉(zhuǎn)s5水稻植株中的靶點(diǎn)序列發(fā)生所期待的突變，則該轉(zhuǎn)s5水稻植株對應(yīng)的pcr產(chǎn)物將無法被相對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶bstni酶切。

酶切鑒定結(jié)果表明：52顆陽性t0代轉(zhuǎn)s5水稻植株中共有23顆陽性t0代轉(zhuǎn)s5水稻植株的pcr產(chǎn)物完全不能或者部分不能被bstni切開，說明在該酶切位點(diǎn)處發(fā)生突變，將上述23顆植株記作定點(diǎn)突變的植株，并對其進(jìn)行測序。

測序結(jié)果如圖3所示。根據(jù)測序結(jié)果可以將23顆定點(diǎn)突變的植株分成如下三類：第一類共有10顆植株，為第五位和第六位堿基由g突變成a(g5突變成a5和g6突變成a6)，其中，3顆植株為純合類型(兩條同源染色體的第五位和第六位堿基均由g突變成a，s5-17、s5-36、和s5-46)、6顆為雜合類型(s5-1、s5-8、s5-21、s5-33、s5-42和s5-43)，1顆為雙等位突變類型(s5-34)，第一類(期待突變類型)占所有突變類型的43％(10/23)，相對于所有轉(zhuǎn)基因植株而言，效率達(dá)到20％(10/52)；第二類共有8顆植株，為同時(shí)包含第五位和/或第六位堿基由g突變成a及g突變成c或者t，其中，一顆為純合類型(s5-26)，另外7顆為雜合類型(s5-10、s5-25、s5-44、s5-45、s5-48、s5-50和s5-52)；第三類共有5顆植株，這一類型突變均為非期待類型，主要是位點(diǎn)的插入和缺失，3顆為雙等位突變(s5-18、s5-31和s4-47)，2顆為雜合類型(s5-16和s5-23)。在s5靶點(diǎn)內(nèi)同樣含有其他的g，但都沒有發(fā)生相應(yīng)的突變。

2、定點(diǎn)編輯ossbeiib的s3靶點(diǎn)的基因型鑒定

利用引物s3testf/r對步驟三獲得的38顆陽性t0代轉(zhuǎn)s3水稻植株的基因組dna進(jìn)行擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物，并對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物直接測序。

測序結(jié)果如圖4所示。測序結(jié)果表明，38顆陽性t0代轉(zhuǎn)s3水稻植株中共有11顆定點(diǎn)突變的植株，根據(jù)測序結(jié)果可以將11顆定點(diǎn)突變的植株分成如下三類：第一類共包含4顆植株，為只含有所期待的突變類型(c突變成t)，分別為s3-1，s3-4，s3-26和s3-29，其中，s3-1，s3-4和s3-29為純合植株，s3-26為雜合型植株，雜合型植株s3-26的一條同源染色體上的三個(gè)靶位點(diǎn)均發(fā)生突變(第一，第二和第七位堿基均由c突變?yōu)閠)，另外一條同源染色體的三個(gè)靶位點(diǎn)均為野生型；第二類只有一顆植株，為s3-6，s3-6的一條同源染色體的第七位堿基由c突變?yōu)閠，另外一條同源染色體的第七位堿基由c突變?yōu)間；第三類共有6顆植株，均為非期待的類型，其中，4顆為純合類型，為第七位堿基均由c突變?yōu)間，另外2顆植株為一條鏈在第一位堿基和第七位堿基均由c突變成g，另外一條鏈僅第七位堿基由c突變成g。

3、定點(diǎn)編輯ospds的p2靶點(diǎn)的基因型鑒定

利用引物p2testf/r對獲得88顆陽性t0代轉(zhuǎn)p2水稻植株的基因組dna進(jìn)行擴(kuò)增，得到pcr產(chǎn)物，用ecori酶切pcr產(chǎn)物，如果轉(zhuǎn)p2水稻植株中的靶點(diǎn)序列發(fā)生所期待的突變，則該轉(zhuǎn)p2水稻植株對應(yīng)的pcr產(chǎn)物將無法被相對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶bstni酶切。

利用ecori酶切t0代轉(zhuǎn)p2水稻植株的pcr產(chǎn)物，結(jié)果表明有2顆t0代轉(zhuǎn)p2水稻植株(p2-21和p2-79)的pcr產(chǎn)物為部分切開，說明在該酶切位點(diǎn)處發(fā)生突變，將上述2顆植株記作定點(diǎn)突變的植株，并對其進(jìn)行測序。

測序結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，p2-21和p2-79均為雜合類型，p2-21的一條同源染色體在靶點(diǎn)序列的第八位和第十位堿基均由g突變成a，另外一條同源染色體為野生型。p2-79的一條同源染色體在靶點(diǎn)序列的第八位堿基由g突變成c，第十位堿基沒有發(fā)生變化，另外一條同源染色體為野生型。

序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所

<120>一種crispr/ncas9介導(dǎo)的定點(diǎn)堿基替換在植物中的應(yīng)用

<160>3

<210>1

<211>16981bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gaattcgagctcggtacccctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggt60

aacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcccgatcta120

gtaacatagatgacaccgcgcgcgataatttatcctagtttgcgcgctatattttgtttt180

ctatcgcgtattaaatgtataattgcgggactctaatcataaaaacccatctcataaata240

acgtcatgcattacatgttaattattacatgcttaacgtaattcaacagaaattatatga300

taatcatcgcaagaccggcaacaggattcaatcttaagaaactttattgccaaatgtttg360

aacgatcggggaaattcggatccccaatactttagactttcctcttcttcttgggagaac420

caccagagagcatcttaatcttgttctcaccgttgctatcctgtatgaccagagcccaag480

gcttgtattcaggggcgtcgctagtcagaagcatgacattctcgtcggtgctctcgtcgt540

aggcggtgtgcacgagtatatcgctttccggcttgttcccaatgacttcttccacctcct600

ctgggagcatgaggatggattcctggataaccagttgcttaccggtctccttttcaataa660

tatctgacagattagtagaaccaccagagtcacccccaagctgtgacaaatctatccgag720

tttcatataatcccgtgatggattggtgaatcagtgtcgcgtctagcacctccttggtag780

aagtgtatcgtttgcgatctatcgttgtgtcaaaatacttgaatgcggctggagcgccga840

ggttggtaagagtaaacaaatggataatattttccgcctgctcacgtatgggtttatccc900

tgtgcttgttgtatgcgcttaatactttgtccagattggcatcagctaggatgactctct960

tactgaattccgaaatttgctctatgatttcgtcgagataatgtttgtgctgctcaacaa1020

aaagttgcttctgttcgttatcttcaggtgaacctttcaacttctcgtaatgggacgcta1080

aatacaggaaattcacgtatttagacggtagtgcgagttcgttccccttttgaagctctc1140

cggcgctagccaacatccgttttcggccattttctaactcaaacagactatactttggta1200

gtttaattatgagatccttttttacttccttgtaacctttcgcctcaaggaagtcgatgg1260

ggttcttttcaaaagacgagcgctccataatcgttatccccaataattctttgactgact1320

tcagtttcttggattttcccttctcaacttttgccactactaggacagaataggcaactg1380

tagggctatcgaagccaccgtactttttcgggtcccagtcctttttacgagcgatgagct1440

tatcactattcctttttggaagaatcgattcctttgaaaaccctccggtctgcacctcag1500

ttttctttactatgttgacttggggcatggacaaaacttttctcaccgtcgcgaagtccc1560

ggcccttatcccatacgatttcacctgtctccccattggtttcaattaaaggtcgtttgc1620

gtatctctccgtttgccagagtgatttccgtcttaaagaaattcataatgttagaataaa1680

agaagtatttggctgtagccttgcctatctcctgttcgcttttcgcgatcatcttacgga1740

cgtcataaactttgtaatcaccatacacaaactcactttctagcttcgggtatttcttaa1800

tgagtgcggtccctacgacggcattaagataagcgtcgtgcgcatggtggtagttattta1860

tctccctaactttatagaattgaaaatcctttctgaagtccgacaccaattttgacttta1920

aagtgattactttgacttcccgaatcagcttatcgttctcgtcgtatttcgtattcattc1980

gggaatctagtatctgtgcaacatgctttgtgatttggcgggtttccacgagctgacgtt2040

taataaatccggccttgtcaagttcagacaagccacccctctcagctttagttaagttat2100

cgaactttctttgcgttatcagtttcgcatttaggagctgccgccaatagttcttcattt2160

tctttacgacttcctcgcttggaacattgtcacttttccctcggttcttatccgagcgtg2220

taagcactttattgtcgattgaatcgtccttcaaaaaggattggggtacaatgtgatcga2280

cgtcgtaatcagataaacggtttatgtccagttcctgatcaacatacatgtcccttccat2340

tttgtaggtaatagaggtaaagtttctcgttctgcaattgggtattttccacaggatgct2400

cctttaagatctggctgcccagttctttaataccctcttctattctcttcatccgctctc2460

gactgtttttttgccccttctgagtcgtttgattttcgcgtgccatctcgattacaatgt2520

tttccggtttgtgacgtcccatgaccttaactagctcatccactactttgactgtctgga2580

gtatgccctttttgatggctggcgaaccagcaagattcgcaatatgttcgtgcaatgagt2640

ccccttgtccggaaacctgtgccttttgtatatcctctttgaaggttaaagagtcatcat2700

ggatcagctgcataaagttcctattggcgaagccgtcgctctttagaaaatcgagaatag2760

ttttaccactttgcttgtctcttatcccgttgataagtttccgcgacaatcgtccccagc2820

ccgtatagcgacgcctctttaactgtttcataaccttatcgtcgaacaggtgagcgtatg2880

tttttagtctttcctcaatcatttcccgatcttcaaagagggtaagagtcaacactatat2940

cttctaagatatcttcattctcttcgttatccaggaagtccttatctttaattatcttta3000

ggaggtcatgatacgtaccaagtgacgcattaaatcgatcttctaccccggagatctcga3060

cagaatcgaagcattcaattttcttaaagtagtcctctttcaattgcttaactgtcactt3120

tgcggttggtcttgaataacagatctactattgctttcttctgttctccgcttagaaagg3180

cgggtttacgcatgccctcagtgacatacttaactttcgtgagttcattgtacactgtga3240

aatactcgtaaagtaaactgtgcttaggcaatactttttcgttcggtaaattcttgtcaa3300

agttggtcatcctctcgatgaacgattgagctgacgcacctttatcgacaacttcctcaa3360

aattccatggagtaatcgtttcttcggactttcttgtcatccatgcgaaccgagagttcc3420

ctcgggccaggggtcccacatagtaaggtatgcgaaaggttaggattttctcaatctttt3480

cacgattgtctttgaggaacggataaaaatcctcctgccttctaagtatagcatgcaatt3540

cgcctaagtggatttgatgtggaatgctaccgttgtcgaaagtccgctgctttcgcagta3600

gatcttcgcgattgagttttacaagcaactcttccgtcccatccatcttctctaatatgg3660

gtttgataaacttgtagaattcctcttgactcgctccgccgtcaatataacctgcgtacc3720

cgtttttcgactgatcaaagaatatttccttatatttctcaggcagttgctgacggacta3780

gggccttgagaagtgtcaagtcttggtgatgttcatcgtaccttttgatcattgaagcgg3840

ataacggcgccttggtaatctcagtattaactctcagtatgtcagataggaggattgcat3900

cgctaaggtttttggcagccaaaaataagtccgcatactgatctccaatttgtgccagta3960

gattgtcgagatcgtcatcgtacgtgtccttactaagctgcaatttggcatcttcagcta4020

agtcgaagttcgacttaaaatttggtgtcaggcctagtgagagcgctataaggttaccga4080

acaacccatttttcttctctccgggtaattgtgcgatcaggttttctagccgtcgggatt4140

tagagaggcgggcgctaagaatagccttcgcatccacgccacttgcatttatagggttct4200

cttcaaacaactgattataggtttgtactaactggatgaacagtttgtcgacatccgagt4260

tgtccggatttagatcaccctcaatgagaaagtgcccacggaactttatcatatgggcaa4320

gagccaagtagattaacctcaggtccgctttatcagttgagtcaactagcttttttctga4380

ggtgataaatcgttgggtacttttcatgatatgccacctcatctactatgtttccaaaga4440

tggggtgccgttcatgtttcttgtcctcttcgacaaggaaggactcttccaaacggtgaa4500

agaaagaatcgtcaactttggccatctcattgctaaaaatttcttgtaagtaacatattc4560

ggttcttgcgacgtgtataccttctccgagcggttcgtttcaggcgagtcgcctctgccg4620

tttcgccactatcgaataggagggcaccgataagattctttttaatcgaatgacggtctg4680

tgttccccaacaccttaaatttctttgaaggtactttgtattcatcggttatgacagccc4740

atccaacggaattagtgccgatggctaaaccaatagaatactttttatcactttcgggtg4800

tggcggactctgaggtcccgggagtctcgctgccgcttttcaacccggtggcccagagaa4860

tgtgtgggggcagtcgctggtaatgacaagactgaagagcgatggtaaagaatgtcagct4920

gtggctgcttccttctcagaatgttgagacaaggaggcaggcccagtatgatgcagtaca4980

gttcaagaacgtacagtcgtacccacagatggggatacctaggccagtgggcttcattac5040

tcgggctataattcacaaagtttctccagcagtatcctgactcctgctcagtcataattt5100

ggatagtcacacctgaagagatcaaatcccgcaggccttgtcgattgcgggggtcagcgt5160

ggtggtacagccttgcgatgtaaataaacagagtgacgtggggataccttgacaggaatt5220

cagtgatggccctactacattcgccgcatgggctccagctgagaaaccaggtaatgctgc5280

accttgtgttcggacagaaatatctttctgtcgtgaacttctcgatgaagttgacttcga5340

cgtgcttgttagtgttctgtgatgtatgtcgccaaatggagtgccggcccccccaattaa5400

tttcgtaaagcaggcaggtctccttgcggagctctctcggatcgaagaatacctcaaact5460

catggggctcgatccgccgtctcaatgtggggtccacagccactgggccagtctctgagc5520

tcatagtattggggatcccccgggctgcagaagtaacaccaaacaacagggtgagcatcg5580

acaaaagaaacagtaccaagcaaataaatagcgtatgaaggcagggctaaaaaaatccac5640

atatagctgctgcatatgccatcatccaagtatatcaagatcaaaataattataaaacat5700

acttgtttattataatagataggtactcaaggttagagcatatgaatagatgctgcatat5760

gccatcatgtatatgcatcagtaaaacccacatcaacatgtatacctatcctagatcgat5820

atttccatccatcttaaactcgtaactatgaagatgtatgacacacacatacagttccaa5880

aattaataaatacaccaggtagtttgaaacagtattctactccgatctagaacgaatgaa5940

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catcagtaaaacccgcatcaacatgtatacctatcctagatcgatatttccatccatcat6060

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atatattgaaataaaggaaaagggcaaaccaaaccctatgcaacgaaacaaaaaaaatca6300

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gcagcacggatctaacacaaacacggatctaacacaaacatgaacagaagtagaactacc6480

gggccctaaccatggaccggaacgccgatctagagaaggtagagagggggggggggggag6540

gacgagcggcgtaccttgaagcggaggtgccgacgggtggatttgggggagatctggttg6600

tgtgtgtgtgcgctccgaacaacacgaggttggggaaagagggtgtggagggggtgtcta6660

tttattacggcgggcgaggaagggaaagcgaaggagcggtgggaaaggaatcccccgtag6720

ctgccgtgccgtgagaggaggaggaggccgcctgccgtgccggctcacgtctgccgctcc6780

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gctgctggttcgctggttggtgtccgttagactcgtcgacggcgtttaacaggctggcat6960

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gtgacaaaaaaaatatgtggtaattttttataacttagacatgcaatgctcattatctct7500

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gcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgccct7680

tcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgctagagcagcttgagcttggatcagatt7740

gtcgtttcccgccttcagttttgcatgcctgcaggtcgacgattaaggaatctttaaaca7800

tacgaacagatcacttaaagttcttctgaagcaacttaaagttatcaggcatgcatggat7860

cttggaggaatcagatgtgcagtcagggaccatagcacaagacaggcgtcttctactggt7920

gctaccagcaaatgctggaagccgggaacactgggtacgttggaaaccacgtgatgtgaa7980

gaagtaagataaactgtaggagaaaagcatttcgtagtgggccatgaagcctttcaggac8040

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tggcaggcacctggacacgagacgcgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggc8220

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