用于識別超氧陰離子的熒光探針及其制備方法和應用、光纖探頭及其制備方法與流程

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本發(fā)明涉及一種用于識別超氧陰離子的熒光探針及其制備方法和應用、光纖探頭及其制備方法，屬于熒光探針技術領域。

背景技術：

超氧陰離子屬于氧自由基一種，生物體內(nèi)的氧自由基有其特定的生理功能，也有一定致病作用。很多疾病的病理生理過程均有超氧陰離子介導。腎臟是一個高血流量器官，在腎臟攝氧中只有25％氧為腎臟組織細胞生存所需要，其余氧主要供腎小管重吸收用，腎小管重吸收越多，耗氧約多。正常情況下，腎臟的抗氧化能力與不斷產(chǎn)生的氧自由基的氧化能力之間保持相對動態(tài)平衡。腎臟疾病患者機體清除自由基能力降低，如果氧自由基產(chǎn)生異常增多，導致腎臟組織損傷，腎臟細胞就會缺血缺氧。

超氧陰離子能引起蛋氨酸、組氨酸、半胱氨酸等蛋白質(zhì)結構和功能改變。帶單電子的氧自由基和生物膜上的多不飽和脂肪酸作用，使得多不飽和脂肪酸與蛋白質(zhì)之間比例失衡,細胞膜的液體性、通透性及流動性發(fā)生改變，因而造成多種細胞膜體系的損傷。溶酶體膜通透性升高，會導致溶酶體酶的外漏、加速細胞自身的溶解；線粒體膜能損傷腎小球系膜細胞、腎小管上皮和通透性與流動性發(fā)生改變可造成氧化磷酸化障礙。腎小球毛細血管基底膜和腎小管上皮細胞膜受損可致腎小球濾過性增大，出現(xiàn)蛋白尿、血尿；腎小管重吸收、運轉(zhuǎn)及分泌功能障礙，出現(xiàn)糖尿、多尿、尿崩、低鉀低鈉及代謝性酸中毒等。

希夫堿是指含有亞胺或甲亞胺特性基團(-rc＝n-)的一類化合物，其雜化軌道上的n原子具有孤對電子，易與有空軌道的金屬離子配位，故其是一類性能優(yōu)良的配體。甲亞胺特性基團(-rc＝n-)在超氧陰離子作用下，會發(fā)生氧化斷鍵，使化合物結構改變，造成熒光性能的變化。因此，使用此類化合物對超氧陰離子進行有效、快速、簡單易行的檢測，對于人類生活和自然環(huán)境都有著極其重大的意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于識別超氧陰離子的熒光探針，該探針具有針對超氧陰離子的熒光敏感性，可與超氧陰離子作用，并導致熒光淬滅，通過探測熒光即可快速識別超氧陰離子，檢測靈敏度高。

本發(fā)明還提供了一種上述用于識別超氧陰離子的熒光探針的制備方法及其應用、光纖探頭及其制備方法。

為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明的用于識別超氧陰離子的熒光探針所采用的技術方案是：

用于識別超氧陰離子的熒光探針，具有式ⅰ所示的結構：

式ⅰ中，ar與ar’為熒光基團。ar和ar’分別獨立地選自苯基、喹啉基、異喹啉基、稠環(huán)基、取代基取代的苯基或取代基取代的稠環(huán)基，取代基獨立地選自羥基或碳原子數(shù)為1～4的烷基，r1為碳原子數(shù)為1～4的烷基，r2為羥基或氫。

優(yōu)選的，所述稠環(huán)基選自萘基，蒽基，苝基或芘基。

優(yōu)選的，ar和ar’獨立地選自萘基、苯基、芘基或甲基取代的苯基。

優(yōu)選的，ar與ar’為熒光基團。

本發(fā)明的用于識別超氧陰離子的熒光探針的制備方法所采用的技術方案為：

上述用于識別超氧陰離子的熒光探針的制備方法，包括如下步驟：在酸性催化劑的催化作用下，將式ⅱ、式ⅲ所示的化合物在溶劑a中反應，即得；

式ⅱ中，ar為熒光基團。ar選自苯基、喹啉基、異喹啉基、稠環(huán)基、取代基取代的苯基或取代基取代的稠環(huán)基，取代基獨立地選自羥基或碳原子數(shù)為1～4的烷基。

式ⅲ中，ar’為熒光基團。ar’選自苯基、喹啉基、異喹啉基、稠環(huán)基、取代基取代的苯基或取代基取代的稠環(huán)基，取代基獨立地選自羥基或碳原子數(shù)為1～4的烷基，r1為碳原子數(shù)為1～4的烷基，r2為羥基或氫。

所述酸性催化劑選自甲酸、乙酸、硫酸、鹽酸、sio2-al2o3、b2o3-al2o3中的一種或多種。

所述溶劑a選自苯、甲苯、乙醇、丙醇、乙醚、四氫呋喃、氯仿中的一種或多種。

所述反應的方程式如下：

所述酸性催化劑與式ⅱ化合物的摩爾比為1:1～100。

所述式ⅱ、式ⅲ化合物的摩爾比為1:0.3～2.7。

所述溶劑a的加入量為：每克式ⅱ化合物對應加入5～100ml溶劑a。

所述反應的溫度為55～85℃，時間4～15h。

反應完畢后，先蒸發(fā)溶劑，然后濃縮溶液，采用冰水混合物冷卻后，收集沉淀，純化，即得。純化可采用重結晶或?qū)游龇蛛x的方法。重結晶所用溶劑可與溶劑a相同，如采用氯仿、甲醇、乙醇等。

本發(fā)明的修飾纖維探頭所采用的技術方案為：采用上述用于識別超氧陰離子的熒光探針修飾的光纖探頭。

上述光纖探頭的制備方法，包括如下步驟：

1)將錐形化的光纖進行表面羥基化處理，得到羥基化錐形光纖；

2)將步驟1)所得的羥基化錐形光纖、3-氨基丙基三乙氧基硅烷加入醇類化合物中浸泡，然后在反應體系中加入氨水繼續(xù)進行浸泡，干燥，得預處理光纖；

3)將上述熒光探針、縮合劑和步驟2)所得的預處理光纖加入溶劑b中反應，即得。

所采用的光纖為石英材質(zhì)。

步驟1)中，所述錐形化的光纖可以采用包括如下步驟的方法制備：將光纖先用濃硫酸浸泡1～2h，然后將光纖插入氫氟酸和氟化銨的混合溶液中浸泡，即得。所述混合溶液是將質(zhì)量分數(shù)為30～50％的氫氟酸和質(zhì)量分數(shù)為15～30％的氯化銨溶液按照體積比為75～85:15～25進行混合得到的。

可以采用依次在piranha溶液、氫氟酸、piranha溶液中浸泡的方法將錐形化的光纖進行表面羥基化處理。所述piranha溶液是將h2o2溶液和濃硫酸混合得到的。優(yōu)選的，h2o2溶液的質(zhì)量分數(shù)為30％。濃硫酸的質(zhì)量分數(shù)為98.3％。h2o2溶液和濃硫酸的體積比為3:7。

將錐形化的光纖進行表面羥基化處理時，采用的氫氟酸的質(zhì)量分數(shù)為30～50％。對錐形化的光纖進行表面羥基化處理后，依次采用水和乙醇進行清洗。

步驟2)中，所述醇類化合物為甲醇、乙醇、丙醇或丁醇。

步驟2)中，在醇類化合物中浸泡的時間為10～30min，在反應體系中加入氨水后浸泡的時間為1h～3h。氨水中nh3的質(zhì)量分數(shù)為25％～28％。氨水可以提供堿性條件促進水解。加入的氨水和醇類化合物的體積比為1～3:7～9。

步驟3)中，所述溶劑b選自甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、丙酮、水中的一種或多種。

步驟3)中，所述縮合劑選自edc(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽)+nhs(n-羥基硫代琥珀酰亞胺)；或者dcc(二環(huán)己基碳二亞胺)中的一種或多種。

步驟3)中，所述反應的溫度為室溫，時間為8～16h。

本發(fā)明的技術方案還在于：上述熒光探針在識別或檢測超氧陰離子方面的應用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明中熒光探針具有針對超氧陰離子的熒光敏感性，可與超氧陰離子反應，并導致熒光淬滅，通過探測熒光即可快速識別超氧陰離子，檢測靈敏度較高，適用于超氧陰離子的便捷檢測。同時，該熒光探針也可用于制備超氧陰離子探測用熒光傳感器。

本發(fā)明中用于識別超氧陰離子的熒光探針和光纖探頭，能快速識別溶液中的超氧陰離子，靈敏度較高，適于超氧陰離子的便捷檢測。

本發(fā)明中熒光探針及光纖探頭的制備工藝簡單，操作簡便，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)及應用。

附圖說明

圖1為是實施例1中的熒光探針的紅外光譜圖；

圖2為實施例1中熒光探針對不同濃度超氧陰離子自由基(從上至下，超氧陰離子自由基的濃度分別為：0μmol/l，2μmol/l，4μmol/l，6μmol/l，8μmol/l，10μmol/l，15μmol/l，20μmol/l，25μmol/l)的熒光光譜識別圖；

圖3為實施例1中的光纖探頭的紫外照射成像圖。

具體實施方式

以下結合具體實施方式對本發(fā)明的技術方案作進一步的說明。

各實施例中采用的氫氟酸和氟化銨混合溶液是將質(zhì)量分數(shù)為40％的氫氟酸和質(zhì)量分數(shù)為25％的氟化銨溶液按照體積為8：2進行混合得到的；在將錐形化的光纖進行羥基化的過程中采用的氫氟酸的質(zhì)量分數(shù)為40％；piranha溶液是將質(zhì)量分數(shù)為30％的h2o2溶液和質(zhì)量分數(shù)為98.3％的濃硫酸按照體積比為3:7進行混合得到的；所采用的氨水中nh3的質(zhì)量分數(shù)為25％；所采用的光纖的材質(zhì)為石英。

實施例1

本實施例的用于識別超氧陰離子的熒光探針，其結構式為：

上述熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

取0.5g對氨基苯甲酸溶于15ml無水乙醇，用滴液漏斗滴加到含0.65g香草醛的25ml無水乙醇中，再加入0.5ml冰乙酸作為催化劑，60℃回流攪拌12h，蒸出大部分溶劑有黃色固體析出，采用冰水混合物冷卻后進行抽濾，然后用無水乙醇洗滌，再用無水乙醇重結晶，即得；反應方程式如下：

本實施例的光纖探頭采用上述用于識別超氧陰離子熒光探針制備得到，制備方法包括如下步驟：

1)將光纖先用濃硫酸浸泡1h，然后垂直插入氫氟酸和氟化銨混合溶液中浸泡，得到錐形化的光纖；

2)將錐形化的光纖依次在piranha溶液、氫氟酸溶液、piranha溶液中浸泡，然后依次用水和乙醇進行清洗，得到羥基化錐形光纖；

3)將所得的羥基化錐形光纖、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(apteos)加入乙醇溶液中浸泡20min，然后在反應體系中加入氨水(氨水和乙醇的體積比為2：8)，再浸泡1.5h，取出光纖，在烘箱內(nèi)干燥，得到預處理光纖；

4)將上述熒光探針、預處理光纖、edc+nhs加入甲醇中，在室溫反應8h，即得。

本實施例的熒光探針在識別或檢測超氧陰離子方面的應用。

將本實施例的熒光探針進行紅外光譜測試，測試所得的紅外光譜圖見圖1。由圖1可知，～1628cm^-1附近的紅外振動峰表明熒光探針分子結構中存在席夫堿結構。

采用熒光法對本實施例的熒光探針的熒光光譜進行檢測：將本實施例的熒光探針配制成10μmol/l的溶液，然后加入鄰苯三酚產(chǎn)生超氧陰離子，當溶液中超氧陰離子自由基的濃度(單位：μmol/l)不同時，熒光探針對超氧陰離子自由基的熒光光譜識別如圖2所示。從圖2中可以看出，隨著超氧陰離子濃度的增加，溶液的熒光強度顯著增強。

對本實施例的光纖探頭進行超氧陰離子顯微熒光成像測試，測試結果見圖3。在接觸超氧陰離子之前呈現(xiàn)出明亮的綠色熒光，接觸后，熒光消失。

實施例2

本實施例的用于識別超氧陰離子的熒光探針，其結構式為：

上述熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

取0.5g8-氨基-3-喹啉羧酸溶于15ml甲苯，用滴液漏斗滴加到含0.17g8-羥基-4-甲氧基-2-萘甲醛的20ml甲苯中，再加入0.5ml冰乙酸作為催化劑，85℃回流攪拌15h，蒸出大部分溶劑有黃色固體析出，采用冰水混合物冷卻后進行抽濾，然后用少量無水乙醇洗滌，再用無水乙醇重結晶，即得；反應方程式如下：

本實施例的光纖探頭采用上述用于識別超氧陰離子熒光探針制備得到，制備方法包括如下步驟：

1)將光纖先用濃硫酸浸泡2h，然后垂直插入氫氟酸和氟化銨混合溶液中浸泡，得到錐形化的光纖；

2)將錐形化的光纖依次在piranha溶液、氫氟酸溶液、piranha溶液中浸泡，然后依次用水和乙醇進行清洗，得到羥基化錐形光纖；

3)將所得的羥基化錐形光纖、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(apteos)加入乙醇溶液中浸泡10min，然后在反應體系中加入氨水(氨水和乙醇的體積比為2：8)，再浸泡1h，取出光纖，在烘箱內(nèi)干燥，得到預處理光纖；

4)將上述熒光探針、預處理光纖、dcc加入甲醇中，在室溫反應12h，即得。

本實施例的熒光探針在識別或檢測超氧陰離子方面的應用。

實施例3

本實施例的用于識別超氧陰離子的熒光探針，其結構式為：

上述熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

取2.5g10-羥基-8-甲氧基蒽-2-甲醛溶于20ml苯，用滴液漏斗滴加到含3.1g9-氨基苝-3甲酸的150ml苯中，再加入0.5ml冰乙酸作為催化劑，85℃回流攪拌4h，蒸出大部分溶劑有固體析出，采用冰水混合物冷卻后進行抽濾，然后用少量無水乙醇洗滌，再用無水甲醇重結晶，即得；反應方程式如下：

本實施例的光纖探頭采用上述用于識別超氧陰離子熒光探針制備得到，制備方法包括如下步驟：

1)將光纖先用濃硫酸浸泡1.5h，然后垂直插入氫氟酸和氟化銨混合溶液中浸泡，得到錐形化的光纖；

2)將錐形化的光纖依次在piranha溶液、氫氟酸溶液、piranha溶液中浸泡，然后依次用水和乙醇進行清洗，得到羥基化錐形光纖；

3)將所得的羥基化錐形光纖、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(apteos)加入乙醇溶液中浸泡30min，然后在反應體系中加入氨水(氨水和乙醇的體積比為2：8)，再浸泡2.5h，取出光纖，在烘箱內(nèi)干燥，得到預處理光纖；

4)將上述熒光探針、預處理光纖、dcc加入甲醇中，在室溫反應12h，即得。

本實施例的熒光探針在識別或檢測超氧陰離子方面的應用。

實施例4

本實施例的用于識別超氧陰離子的熒光探針，其結構式為：

上述熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

取2.6g6-氨基2-芘甲酸溶于15ml無水乙醇，用滴液漏斗滴加到含1.7g4-甲基-3甲氧基-5-羥基苯甲醛的100ml無水乙醇中，再加入0.2gb2o3-al2o3作為催化劑，75℃回流攪拌12h，蒸出大部分溶劑有固體析出，采用冰水混合物冷卻后進行抽濾，然后用少量無水乙醇洗滌，再用無水乙醇重結晶，即得；反應方程式如下：