本發(fā)明涉及一株6-芐氨基腺嘌呤單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株zxl-3及其應(yīng)用，屬于食品安全免疫檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
6-芐氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-ba）是一種人工合成的植物生長(zhǎng)激素，主要作為促長(zhǎng)劑和保鮮劑使用。它能夠促進(jìn)與調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及蔬菜、水果的保鮮和儲(chǔ)存。6-ba是第一個(gè)人工合成的細(xì)胞分裂素，主要成份是嘌呤類(lèi)生物堿和一些無(wú)機(jī)物，在細(xì)胞分裂素中具有較高活性。6-ba作為植物促長(zhǎng)劑和果蔬保鮮劑的主要成分，已在國(guó)內(nèi)外進(jìn)入應(yīng)用階段。作為植物促長(zhǎng)劑使用，可以提高種子發(fā)芽率，促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)，最終提高產(chǎn)率，常被用于促進(jìn)豆芽的生長(zhǎng)，提高煙葉的產(chǎn)量等。在作物生長(zhǎng)過(guò)程中，6-ba能夠起到將氨基酸生長(zhǎng)素、無(wú)機(jī)鹽等向植物的莖、根等部位輸運(yùn)的作用，改善其生長(zhǎng)。另外6-ba還能夠通過(guò)抑制植物內(nèi)的葉綠素、核酸、蛋白質(zhì)分解、抑制呼吸等方式對(duì)作物防衰保鮮，因此6-ba適用于各種綠葉蔬菜（如青椒、黃瓜、豆角等）貯藏前使用。
6-芐氨基腺嘌呤已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、果樹(shù)栽培和園藝等領(lǐng)域。因此6-ba在市售水果和蔬菜中一般都有一定的殘留，而人體攝入6-ba過(guò)多會(huì)刺激食道、胃黏膜，造成食道、胃黏膜損傷，出現(xiàn)惡心、嘔吐等現(xiàn)象。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)gb2760-1996將6-芐氨基腺嘌呤（6-ba）作為允許使用的食品添加劑，同時(shí)也規(guī)定了其最高允許使用限量（0.01g/kg）和最高允許殘留量（0.20mg/kg）。然而，目前一方面國(guó)內(nèi)外至今尚未建立6-芐氨基腺嘌呤進(jìn)出口產(chǎn)品質(zhì)量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及其測(cè)定方法，這給6-ba的生產(chǎn)使用和進(jìn)出口貿(mào)易以及食品衛(wèi)生監(jiān)督與監(jiān)測(cè)工作帶來(lái)很大的阻礙；另一方面食品中6-ba殘留量的檢測(cè)方法也沒(méi)有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。為了維護(hù)廣大消費(fèi)者的利益，有必要建立一種針對(duì)6-ba的高效、快速的檢測(cè)方法，而酶聯(lián)免疫法（elisa）前處理簡(jiǎn)單，成本低，可實(shí)現(xiàn)大量樣品的快速檢測(cè)，且檢測(cè)時(shí)對(duì)樣本的純度要求不高。因此，建立高效的免疫學(xué)檢測(cè)方法很有必要，而建立此方法的一個(gè)重要前提即需篩選出針對(duì)6-芐氨基腺嘌呤的高特異性單克隆抗體。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一株6-芐氨基腺嘌呤單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株zxl-3，由該細(xì)胞株制備的抗體對(duì)6-芐氨基腺嘌呤具有較好特異性和檢測(cè)靈敏度，可以用來(lái)建立6-芐氨基腺嘌呤的免疫學(xué)檢測(cè)方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案，一株6-芐氨基腺嘌呤單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株zxl-3，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，保藏編號(hào)為cgmccno.13084。
6-芐氨基腺嘌呤單克隆抗體，它由所述保藏編號(hào)為cgmccno.13084的6-芐氨基腺嘌呤單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株zxl-3分泌產(chǎn)生。
所述6-芐氨基腺嘌呤單克隆抗體的應(yīng)用，用于食品安全檢測(cè)中6-芐氨基腺嘌呤殘留的分析檢測(cè)。
本發(fā)明提供的6-芐氨基腺嘌呤單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株zxl-3的制備基本步驟為：
（1）半抗原的衍生：
原藥mol.wt：225.249
半抗原：用6-氯嘌呤和4-（氨甲基）苯甲酸取代得到：
（2）完全抗原6-ba-bsa的制備：稱(chēng)取2.5mg6-ba（6-ba與牛血清白蛋白（bsa）摩爾比為60︰1），3mgn-羥基琥珀酰亞胺（nhs），溶解于300μln,n-二甲基甲酰胺（dmf）中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)10min；再稱(chēng)取5.5mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)，用100μldmf充分溶解后，加入到6-ba溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6-8h（稱(chēng)為a液）。取10mgbsa，用2ml0.01m硼酸鹽緩沖溶液（bb，ph=8.6）溶解（稱(chēng)為b液），再逐滴將a液緩慢加入到b液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜；然后用0.01mpbs溶液透析，除去未反應(yīng)的小分子半抗原，得到完全抗原6-ba-bsa，并通過(guò)紫外吸收掃描方法進(jìn)行鑒定；
（3）小鼠的免疫：將6-ba-bsa完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，對(duì)balb/c小鼠進(jìn)行頸背部皮下多點(diǎn)注射免疫（沖刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐劑，劑量為100μg/只；多次加強(qiáng)免疫用不完全弗氏佐劑且劑量減半即為50μg/只；沖刺免疫不用佐劑，直接用生理鹽水稀釋后腹腔注射，劑量再減半即為25μg/只。首次免疫與第二次加強(qiáng)免疫之間間隔一個(gè)月，多次加強(qiáng)免疫之間間隔21天，沖刺免疫與最后一次加強(qiáng)免疫之間間隔18-21天。通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法（ic-elisa）觀測(cè)小鼠免疫效果即檢測(cè)小鼠血清的效價(jià)和抑制；
（4）細(xì)胞融合與細(xì)胞株建立：通過(guò)聚乙二醇（peg4000）法將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，采用選擇性培養(yǎng)基（hat培養(yǎng)基）篩選出雜交瘤細(xì)胞，并用ht培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。融合一周后利用ic-elisa法檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞孔，并進(jìn)一步利用ic-elisa法測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞孔的抑制效果，通過(guò)有限稀釋法對(duì)抑制較好的陽(yáng)性細(xì)胞孔進(jìn)行亞克隆，一周后再次檢測(cè)、挑孔、亞克隆。按上述方法進(jìn)行三次亞克隆后獲得6-ba的高分泌特異抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株zxl-3；
（5）雜交瘤細(xì)胞株性質(zhì)的鑒定：通過(guò)ic-elisa測(cè)定靈敏度和特異性。
6-ba-bsa完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化完全，通過(guò)頸背部皮下多點(diǎn)注射免疫balb/c小鼠。首次免疫（100μg/只）用完全弗氏佐劑，多次加強(qiáng)免疫（50μg/只）用不完全弗氏佐劑，最后一次沖刺免疫用6-ba-bsa完全抗原（25μg/只，不含佐劑）進(jìn)行小鼠腹腔注射。取特異性高，ic50低的小鼠脾細(xì)胞，通過(guò)peg方法與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)過(guò)ic-elisa法篩選細(xì)胞和三次亞克隆，得到一株高分泌特異抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供的細(xì)胞株zxl-3分泌的單克隆抗體，對(duì)6-ba具有較好的特異性和檢測(cè)靈敏度（ic50值為2.5ng/ml），可實(shí)現(xiàn)對(duì)水果、蔬菜6-ba殘留量的檢測(cè)，為食品中6-ba殘留的免疫檢測(cè)提供了原料，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
生物材料樣品保藏：一株6-ba單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株zxl-3，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)cgmcc，地址為：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2016年10月31日，保藏編號(hào)為cgmccno.13084。
附圖說(shuō)明
圖1是zxl-3單克隆抗體的抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明下面的實(shí)施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進(jìn)一步說(shuō)明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
本發(fā)明通過(guò)將6-芐氨基腺嘌呤完全抗原免疫小鼠，通過(guò)細(xì)胞融合，hat選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過(guò)ic-elisa篩選細(xì)胞上清，最終得到了針對(duì)6-芐氨基腺嘌呤具有高分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
實(shí)施例1雜交瘤細(xì)胞株zxl-3的制備
（1）半抗原的衍生：用6-氯嘌呤和4-（氨甲基）苯甲酸取代得到含活潑基團(tuán)（-cooh）的半抗原。
（2）完全抗原的合成：稱(chēng)取2.5mg6-ba（6-ba與牛血清白蛋白（bsa）摩爾比為60︰1），3mgn-羥基琥珀酰亞胺（nhs），溶解于300μln,n-二甲基甲酰胺（dmf）中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)10min；再稱(chēng)取5.5mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edc），用100μldmf充分溶解后，加入到6-ba溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)6-8h（稱(chēng)為a液）。取10mgbsa，用2ml0.01m硼酸鹽緩沖溶液（bb，ph=8.6）溶解（稱(chēng)為b液），再逐滴將a液緩慢加入到b液中，室溫反應(yīng)過(guò)夜；然后用0.01mpbs溶液透析，除去未反應(yīng)的小分子半抗原，得到完全抗原6-ba-bsa，并通過(guò)紫外吸收掃描方法進(jìn)行鑒定；
（3）動(dòng)物免疫：將6-ba-bsa完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，對(duì)balb/c小鼠進(jìn)行頸背部皮下多點(diǎn)注射免疫（沖刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐劑，劑量為100μg/只；多次加強(qiáng)免疫用不完全弗氏佐劑且劑量減半即為50μg/只；沖刺免疫不用佐劑，直接用生理鹽水稀釋后腹腔注射，劑量再減半即為25μg/只。首次免疫與第二次加強(qiáng)免疫之間間隔一個(gè)月，多次加強(qiáng)免疫之間間隔21天，沖刺免疫與最后一次加強(qiáng)免疫之間間隔18-21天。通過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法（ic-elisa）觀測(cè)小鼠免疫效果即檢測(cè)小鼠血清的效價(jià)和抑制；
（4）細(xì)胞融合：在沖刺免疫三天后，按照常規(guī)peg（聚乙二醇，分子量為4000）方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟如下：
a、小鼠摘眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5min左右，無(wú)菌操作取出小鼠的脾臟，用注射器膠頭適度研磨并通過(guò)200目細(xì)胞篩網(wǎng)得到脾細(xì)胞懸液，收集，離心（1200rpm，8min），用rpmi-1640培養(yǎng)基洗滌脾細(xì)胞三次，最后一次離心后，將脾細(xì)胞稀釋到一定體積，計(jì)數(shù)，備用；
b、收集sp2/0細(xì)胞：融合前7-10天，將sp2/0瘤細(xì)胞用含10%fbs（胎牛血清）rpmi-1640培養(yǎng)基在5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合前要求sp2/0瘤細(xì)胞數(shù)量達(dá)到（1-4）×107，保證融合前sp2/0瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。融合時(shí)，收集瘤細(xì)胞，懸浮于rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；
c、融合過(guò)程7min：第1min，將1ml的peg4000由慢到快滴加到細(xì)胞中；第2min，靜置；第3min和第4min，在1min內(nèi)滴加1mlrpmi-1640培養(yǎng)基；第5min和第6min，在1min內(nèi)滴加2mlrpmi-1640培養(yǎng)基；第7min，每10s滴加1ml的rpmi-1640培養(yǎng)基。然后37℃溫浴5min。離心（800rpm，10min），棄上清，細(xì)胞輕輕敲散，并向其內(nèi)加入含20%胎牛血清、2%50×hat的rpmi-1640選擇性培養(yǎng)基（hat培養(yǎng)基），按照200μl/孔加到96孔細(xì)胞板，置于37℃、5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
（5）細(xì)胞篩選與細(xì)胞株建立：在細(xì)胞融合后的第3天用hat培養(yǎng)基對(duì)融合細(xì)胞進(jìn)行半換液；第5天用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640過(guò)渡培養(yǎng)液（ht培養(yǎng)基）進(jìn)行全換液；第7天取細(xì)胞上清進(jìn)行篩選。篩選分兩步：第一步先用ic-elisa法篩選出陽(yáng)性細(xì)胞孔，第二步選用6-芐氨基腺嘌呤為標(biāo)準(zhǔn)品，用ic-elisa法對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行抑制效果測(cè)定。選擇對(duì)6-芐氨基腺嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品有較好抑制的細(xì)胞孔，采用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，七天后用同樣的方法進(jìn)行檢測(cè)。按上述方法進(jìn)行三次亞克隆，最終獲得6-芐氨基腺嘌呤單克隆抗體細(xì)胞株zxl-3。
（6）單克隆抗體的制備與鑒定：取8-10周齡balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射無(wú)菌石蠟油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×1066-芐氨基腺嘌呤雜交瘤細(xì)胞，從第七天開(kāi)始收集腹水，將腹水通過(guò)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行抗體純化。在偏酸條件下，正辛酸可以沉淀腹水中除igg免疫球蛋白外的其他雜蛋白，然后離心，棄沉淀；再用等量飽和度的硫酸銨溶液沉淀igg型的單克隆抗體，離心，棄上清，用0.01mpbs溶液（ph7.4）溶解后，透析脫鹽，最終得到純化后的單克隆抗體置于-20℃保存。
6.1包被：將包被原6-ba-ova用0.05mph9.6碳酸鹽緩沖液從1μg/ml開(kāi)始3倍比稀釋?zhuān)?00μl/孔，37℃反應(yīng)2h；
6.2洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，并用洗滌液洗滌3次，每次3min；
6.3封閉：拍干后，加入200μl/孔封閉液，37℃反應(yīng)2h。洗滌后烘干備用；
6.4加樣：將抗血清從1︰1000開(kāi)始倍比稀釋?zhuān)⒓尤氲礁飨♂尪鹊陌豢字校?00μl/孔，37℃反應(yīng)30min；充分洗滌后，加入1︰3000稀釋的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反應(yīng)30min；
6.5顯色：將酶標(biāo)板取出，充分洗滌后，每孔加入100μl的tmb顯色液，37℃避光反應(yīng)15min；
6.6終止和測(cè)定：每孔加入50μl終止液以終止反應(yīng)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的od450值。
用ic-elisa測(cè)定單克隆抗體6-芐氨基腺嘌呤的ic50為：2.5ng/ml，說(shuō)明對(duì)6-芐氨基腺嘌呤有很好的靈敏度，可用于6-芐氨基腺嘌呤免疫分析檢測(cè)。
溶液的配置：
碳酸鹽緩沖液（cbs）：稱(chēng)取na2co31.59g，nahco32.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800ml混勻，調(diào)ph值至9.6，加雙蒸水定容至1000ml，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>
磷酸鹽緩沖液（pbs）：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml純水中，用naoh或hcl調(diào)ph到7.2～7.4，定容至1000ml；
pbst：含0.05%吐溫20的pbs；
tmb顯色液：a液：na2hpo4.12h2o18.43g，檸檬酸9.33g，純水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中。a、b液按體積比5︰1混合即為tmb顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。