本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)領域，具體是一種人皮膚多能干細胞(skps)培養(yǎng)的改良方法。

背景技術：

皮膚多能干細胞(skin-derivedprecursors，skps)，它有類似胚胎神經(jīng)干細胞特性，能夠分化成各種神經(jīng)和中胚層細胞表現(xiàn)型，包括周圍神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞、平滑肌細胞、骨、軟骨和脂細胞等。

skps經(jīng)過連續(xù)長期傳代細胞培養(yǎng)仍具有高度增殖活性和多向分化潛能，提示其性能穩(wěn)定，可望成為細胞替代治療較為理想的種子細胞。另皮膚是人體最大的器官，而且也是機體內(nèi)自我更新和再生修復速度最快的組織之一，取材簡單方便，來源充足，對供者無明顯不利影響，便于自體移植治療且無倫理問題的限制。因此，這種skps越來越受到的科學家的關注，被認為有望在脊髓及神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療發(fā)面發(fā)揮重要作用。

但是采用現(xiàn)有目前的方法分離培養(yǎng)皮膚多能干細胞，由于其數(shù)量少，培養(yǎng)周期長，費用高，研究及應用受限，需要進行改進。如，jeffreyabiernaskie1等，isolationofskin-derivedprecursors(skps)anddifferentiationandenrichmentoftheirschwanncellprogeny，natureprotocolsvol.1，no.6，2006，2803公開了一種皮膚多能干細胞的培養(yǎng)方法，采用該文獻公開的方法培養(yǎng)，需要2-4周時間才能培養(yǎng)得到皮膚多能干細胞，且獲得細胞數(shù)量較少。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的、培養(yǎng)周期短的skps培養(yǎng)方法。

本發(fā)明皮膚多能干細胞的培養(yǎng)方法，步驟如下：

(1)取皮膚的真皮層組織，剪碎，膠原酶消化，解離，離心去上清，得細胞；

(2)取步驟(1)得到的細胞，采用貼壁培養(yǎng)基進行貼壁培養(yǎng)細胞，獲得成纖維細胞；

(3)取步驟(2)得到的成纖維細胞，懸浮培養(yǎng)基重懸，接種至poly-hema包被的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，即可。

步驟(1)中，所述取皮膚真皮層組織的方法是：取皮膚，消毒，沖洗，剔除皮下脂肪層，保留真皮及表皮層；剪成小塊，用0.25％胰酶在4℃冰箱中過夜；用等體積含10％胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)基終止消化，沖洗，表皮在沖洗的過程中被脫離、洗去，未分離的表皮使用鑷子分離去除，得真皮組織。

步驟(1)中，剪碎是剪為2-3mm²/片；

步驟(1)中，所述膠原酶消化采用的是濃度1mg/ml的膠原酶溶液，消化的條件是37℃孵箱中2-3h；所述膠原酶為i型膠原酶。

步驟(2)中，所述獲得成纖維細胞的方式是：

培養(yǎng)至細胞融合至80-90％時，胰酶消化，離心去上清，收集細胞，即為成纖維細胞；

或者是，培養(yǎng)至細胞融合至80-90％時，胰酶消化，離心去上清，收集細胞，傳代培養(yǎng)，傳代次數(shù)為2-10次，得細胞懸液，離心去上清，收集細胞，即可。

步驟(2)中，所述獲得成纖維細胞的方式是：取前述方法獲得的成纖維細胞，凍存，解凍，培養(yǎng)，即可；

所述凍存保存液是含有10％dmso和20％fbs的dmem溶液；

所述解凍是放入37℃水槽，使其在1分鐘內(nèi)全部融化；

所述培養(yǎng)的方式是：取出解凍之細胞懸浮液，加入9倍量的貼壁培養(yǎng)基進行貼壁培養(yǎng)，直至細胞融合至80-90％，胰酶消化。

所述貼壁培養(yǎng)基是添加有1％的青/鏈霉素雙抗和10％胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)基；培養(yǎng)的方法是：置于7℃，5％co2，95％o2條件下培養(yǎng)，每3天換液一次。

胰酶消化是加入0.1％胰酶消化2min，消化的溫度37℃；采用10％fbs的dmem培養(yǎng)基終止消化。

步驟(3)中，所述懸浮培養(yǎng)基是dmem高糖培養(yǎng)基+f12營養(yǎng)添加物(3:1)+40ng/mlfgf2+20ng/mlegf+2％b27+1％雙抗；

步驟(3)中，每3-4天加一次液，每次加1-2mldmem/f12培養(yǎng)基及所有生長因子添加物，保持培養(yǎng)基中含有40ng/mlbfgf、20ng/mlegf及2％b27。

本發(fā)明還提供了前述方法制備得到的皮膚多能干細胞。

本發(fā)明還提供了前述皮膚多能干細胞在制備預防光老化的藥物、化妝品或者日化用品中的用途。

本方法先擴增真皮中成纖維細胞(fibroblasts，fbs)的數(shù)量，再轉(zhuǎn)化培養(yǎng)skps，獲得的細胞與傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的skps有相同形態(tài)，表達相同的蛋白標記，且具有多向分化能力，提高了細胞的獲得量，縮短了培養(yǎng)周期，降低了費用，有利于skps研究的進一步展開，應用前景廣闊。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1本方法培養(yǎng)的fbs細胞

圖2本方法培養(yǎng)的skps細胞

圖3現(xiàn)有方法培養(yǎng)的skps細胞

圖4本方法培養(yǎng)的skps表達傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的skps相關標記物

圖5skps成骨誘導分化

圖6skps成脂誘導分化

圖7傳統(tǒng)方法培養(yǎng)的skps相關標記物

圖8本發(fā)明方法與傳統(tǒng)方法不同時間培養(yǎng)的skps的比較

圖9本方法skps長期保存

圖10不同組別裸鼠皮膚外觀及、vc98局部成像、he及masson染色

具體實施方式

主要儀器及試劑：

實施例1本發(fā)明皮膚多能干細胞的培養(yǎng)方法

1皮膚真皮貼壁細胞培養(yǎng)及擴增，即fbs的培養(yǎng)和擴增

1.1取新鮮人包皮標本，75％酒精消毒，用pbs沖洗3次后剔除皮下脂肪層，保留真皮及表皮層。

1.2將皮膚剪成5×5mm²/片，用0.25％胰酶在4℃冰箱中過夜。

1.3用等體積含10％胎牛血清(fbs)的dmem培養(yǎng)基終止消化，用pbs沖洗兩遍。表皮在沖洗的過程中被脫離、洗去，未分離的表皮使用鑷子手工分離去除。

1.4將真皮組織剪為2-3mm²/片，加入1mg/ml的i型膠原酶，置于37℃孵箱中2-3h，致組織幾乎完全消化，加入5倍體積的dmem高糖培養(yǎng)基終止消化。

1.5用1000μl槍頭反復吹打，機械解離細胞。收集上清液，用40μm的濾網(wǎng)濾過。濾過液以2000rpm的速度離心8分鐘。

1.6棄上清，用貼壁培養(yǎng)基(dmem高糖培養(yǎng)基+10％胎牛血清+1％雙抗)重懸細胞，按50000個/ml的密度接種細胞于培養(yǎng)板上，置于孵育箱中(37℃，5％co2，95％o2)。

1.724-48小時觀察細胞是否貼壁，每3天換液，培養(yǎng)1周左右至細胞融合至80-90％。

1.8棄培養(yǎng)基，用pbs清洗兩遍，加入0.1％胰酶消化2min(37℃)，后用等體積含10％fbs的dmem培養(yǎng)基終止消化，收集細胞懸液，以2000rpm的速度離心8分鐘，收集沉淀(此處得到的細胞為成纖維細胞[fbs細胞]，其形態(tài)如圖1所示)；可傳代培養(yǎng)，按50000個/ml的密度接種傳代，約2-3天細胞融合再傳代，可至少傳致第10代，傳代后得到的細胞懸液，以2000rpm的速度離心8分鐘，收集沉淀(得到的細胞為成纖維細胞)。

2貼壁細胞轉(zhuǎn)為懸浮生長細胞，即fbs轉(zhuǎn)化為skps

將步驟1得到的成纖維細胞的細胞沉淀以懸浮培養(yǎng)基(dmem高糖培養(yǎng)基+f12營養(yǎng)添加物(3:1)+40ng/mlfgf2+20ng/mlegf+2％b27+1％p/s)重懸，按20000-40000個/ml的密度接種細胞于poly-hema包被的培養(yǎng)瓶中，每3-4天加一次液，每次加1-2mldmem/f12培養(yǎng)基及所有生長因子添加物，保持培養(yǎng)基中含有40ng/mlbfgf、20ng/mlegf及2％b27。

連續(xù)培養(yǎng)1-2周。收集得到皮膚多能干細胞(skps細胞)，其鏡下形態(tài)如圖2所示。

實施例2本發(fā)明長期保存

本發(fā)明實施例1步驟1中得到的成纖維細胞fbs可以凍存起來，在實際需要的時候解凍，再轉(zhuǎn)化為皮膚多能干細胞(skps細胞)，凍存以及解凍的方法如下：

1將擴增的皮膚貼壁細胞離心后，收集細胞沉淀，加入凍存保存液(10％dmso+20％fbs+70％dmem)中，混合均勻，然后進行凍存。

2取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，以70％酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內(nèi)。

3取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有貼壁培養(yǎng)基之培養(yǎng)皿內(nèi)(稀釋比例為1：9)，混合均勻，放入co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3天換液，直至細胞融合至80-90％。后用pbs清洗兩遍，加入0.1％胰酶消化2min(37℃)，后用等體積含10％fbs的dmem培養(yǎng)基終止消化，收集細胞懸液，以2000rpm的速度離心8分鐘，收集繼一代細胞沉淀(得到的細胞為成纖維細胞)。

4將繼一代的細胞沉淀以懸浮培養(yǎng)基(dmem/f12培養(yǎng)基(3:1)，含40ng/mlbfgf、20ng/mlegf及2％b27。)重懸，按20000-40000/ml的密度接種細胞于poly-hema包被的培養(yǎng)瓶中，每3-4天加一次液，每次加1-2mldmem/f12培養(yǎng)基及所有生長因子添加物，保持培養(yǎng)基中含有40ng/mlbfgf、20ng/mlegf及2％b27。

5連續(xù)培養(yǎng)1周，收集skps細胞。

以下用實驗例的方式來說明本發(fā)明的有益效果：

實驗例1本發(fā)明方法與現(xiàn)有方法的比較

1、實驗方法

(1)本發(fā)明方法：按照本發(fā)明實施例1的方法得到的培養(yǎng)多能干細胞，培養(yǎng)時間為1周。

(2)現(xiàn)有方法：按照jeffreyabiernaskie1等，isolationofskin-derivedprecursors(skps)anddifferentiationandenrichmentoftheirschwanncellprogeny，natureprotocolsvol.1，no.6，2006，2803公開的方法培養(yǎng)多能干細胞(將從真皮中分離的原代細胞直接于懸浮培養(yǎng)基中培養(yǎng))，培養(yǎng)時間2-4周。

2、檢測方法

取兩種方法培養(yǎng)得到的細胞分別細胞觀察，并進行成脂成骨結(jié)果檢測。

取本發(fā)明方法培養(yǎng)的皮膚多能干細胞，與現(xiàn)有方法培養(yǎng)的細胞進行比較檢測，包括使用coultercounter粒子計數(shù)器計數(shù)獲得的細胞數(shù)、倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)。

3、檢測結(jié)果

結(jié)果如圖2～圖8所示：

首先，本發(fā)明方法培養(yǎng)得到的多能干細胞skps的形狀圖如圖2所示，現(xiàn)有方法得到的多能干細胞skps的形狀圖如圖3所示，比較可以看出，二者無差異。

第二，本發(fā)明培養(yǎng)的skps也可以分化成脂成骨(圖4、5)，本發(fā)明配方的skps也具有各種干細胞特異性標志物(圖6)，與現(xiàn)有方法培養(yǎng)的skps基本一致(圖7)。

第三，如圖8所示，現(xiàn)有方法培養(yǎng)方法1周無法得到成熟的skps，本發(fā)明方法培養(yǎng)1周與現(xiàn)有方法培養(yǎng)2周的效果相同?，F(xiàn)有方法培養(yǎng)4周skps出現(xiàn)貼壁等分化現(xiàn)象，而本發(fā)明方法培養(yǎng)未出現(xiàn)貼壁現(xiàn)象。

實驗結(jié)果說明，本發(fā)明方法可以培養(yǎng)得到性質(zhì)優(yōu)良的多能干細胞skps，而且培養(yǎng)時間短。

實驗例2本發(fā)明凍存的效果

1、實驗方法

取本發(fā)明實施例1方法種培養(yǎng)的第一代fbs(p1)及其轉(zhuǎn)化成的skps，以及本發(fā)明實施例2方法培養(yǎng)的第八代凍存后解凍的fbs(p8)及其轉(zhuǎn)化成的skps。檢測生存狀態(tài)，包括使用coultercounter粒子計數(shù)器計數(shù)獲得的細胞數(shù)、倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)。

2、實驗結(jié)果

如圖9所示?，F(xiàn)有方法培養(yǎng)的第一代fbs(p1)及其轉(zhuǎn)化成的skps(圖9上排)，現(xiàn)有方法培養(yǎng)的第八代凍存后解凍的fbs(p8)及其轉(zhuǎn)化成的skps，生存狀態(tài)基本一致。

實驗例3本發(fā)明皮膚多能干細胞對光老化的預防作用

1、實驗方法

(1)本發(fā)明方法：本發(fā)明方法培養(yǎng)的skps對光老化有預防作用。

1小鼠分組：將18只balb/c裸鼠隨機分為3組，即空白對照組、照射組、10skps組。1組不做任何處理，2組僅照射紫外光，3組于照射前及之后每隔兩周臀部分別注射skps。

2uvb照射：用紫外線光療儀先后對裸鼠背部皮膚進行照射，光源距離背部皮膚垂直距離30cm，每周照射5次，共8周，10j/cm2/1h。

3skps注射：將實施例2所培養(yǎng)的皮膚多能干細胞懸液于3組裸鼠臀部皮膚注射，注射細胞數(shù)為1*106/ml，細胞懸液體積為200ul。同時，空白對照組和照射組未進行細胞注射處理。

4活性皮膚表面分析系統(tǒng)評價:在實驗終點時，采集小鼠皮膚背側(cè)影像行活性皮膚表面分析系統(tǒng)評價sels皺紋參數(shù)中的平滑度參數(shù)sesm，ser，sew，sesc。

5組織病理切片：在實驗終點時，頸椎脫臼法處死動物，將取下的皮膚組織切成小塊，標本大小約為4mm×4mm×2mm，立即投入4％多聚甲醛中固定24小時以上，做成石蠟切片，同時行he染色、masson染色。

2、檢測

在實驗終點時行，對小鼠背部皮膚行活性皮膚表面分析系統(tǒng)評價；取小鼠背部皮膚做成石蠟切片，同時行he染色測量表皮厚度、masson染色測真皮厚度和膠原含量百分比。

如圖10所示，不同組別裸鼠皮膚外觀及、vc98局部成像、he及masson染色(a.uv-，b.uv+，c.hanks+uv，d.10⁴skps+uv，e.10⁵skps+uv)，成功構(gòu)建光老化小鼠模型，將不同濃度skps注入光老化小鼠背部皮膚，以未注射小鼠及hanks液作為陰性對照，臨床可見紫外線輻射后，注射高濃度skps的皮膚明顯更光滑(圖10第1、2、3排)，he染色可見真皮層明顯增厚，masson染色可見膠原纖維增多(圖10第4、5、6排)。

綜上，采用本發(fā)明方法可以有效培養(yǎng)得到皮膚多能干細胞，細胞培養(yǎng)周期短，而且細胞取材方便，可長期保存，成本低廉。此外，本發(fā)明培養(yǎng)的皮膚多能干細胞對光老化有預防作用，前景良好。