本發(fā)明屬于獸用菌苗領(lǐng)域領(lǐng)域，涉及一種培養(yǎng)基及應(yīng)用該培養(yǎng)基所進(jìn)行的預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

禽大腸桿菌?。╝viancolibacillosis，ac）是由禽致病性大腸桿菌（avianpathogenicescherichiacoli，apec）引起雞、火雞及其他禽類局部或全身性腸外感染的總稱，臨床上以大腸桿菌性臍炎、蜂窩織炎、輸卵管炎、腹膜炎和腫頭綜合征及敗血癥（心包炎、肝周炎、氣囊炎）等較為常見。已有預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗制備方法中的配方局限于實驗室搖瓶常用的lb培養(yǎng)基、酵母粉、蛋白胨、無機鹽等常規(guī)發(fā)酵培養(yǎng)基，單批發(fā)酵菌苗活菌數(shù)僅達(dá)4.0×109cfu/ml，且蛋白表達(dá)量低≤0.12mg/ml，制備量少，每毫升僅供50羽使用，無法滿足放大規(guī)模量化生產(chǎn)和市場需求。因此，迫切需要發(fā)展一種性能穩(wěn)定的，能提高菌苗活菌數(shù)且蛋白表達(dá)高的生產(chǎn)方法。

目前，國內(nèi)外對禽類大腸桿菌疫苗所用基因工程菌的構(gòu)建、基因的表達(dá)等進(jìn)行了相應(yīng)的研究，但最終表達(dá)的活菌數(shù)和蛋白表達(dá)量相對較低，效果較差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的發(fā)明目的，旨在提供一種培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中的物料配伍合理，原料價格低廉，該培養(yǎng)基應(yīng)用于預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗生產(chǎn)中，可以得到較高的菌苗活菌數(shù)和菌苗蛋白表達(dá)量；

本發(fā)明的另外一個目的，是提供了應(yīng)用上述培養(yǎng)基進(jìn)行的預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗的生產(chǎn)方法，該方法簡單，易于控制，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

一種培養(yǎng)基，其特征在于按照重量份數(shù)計，它包括如下組分：

磷酸氫二鉀0.5-1.5份，磷酸二氫鉀0.1-0.5份，硫酸銨0.2-0.5份，氯化鈣0.0005-0.001份，硫酸鎂0.1-0.6份，蛋白胨1-2.5份，酵母粉0.5-2份，葡萄糖1-2.5份，氯化鈉0.2-0.5份，硫酸亞鐵0.001-0.005份，硫酸鋅0.005-0.01份，水100份。

作為上述培養(yǎng)基的限定，它還包括1-2重量份數(shù)的氨基酸粉。

本發(fā)明還提供了一種預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗的生產(chǎn)方法，它按照如下的步驟順序依次進(jìn)行：

(1)制備含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌種，冷凍保存；

(2)采用本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基，對菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；

(3)使用機械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐誘導(dǎo)表達(dá)apectsh蛋白。

作為本發(fā)明生產(chǎn)方法的限定：

所述擴(kuò)大培養(yǎng)分為三級，具體的步驟如下：

(1)一級擴(kuò)大培養(yǎng)：將菌液加入培養(yǎng)基中,于220rpm、37℃下振蕩培養(yǎng)4-8h;

(2)二級擴(kuò)大培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(1)處理后的菌液加入到培養(yǎng)基中，于220rpm、37℃下振蕩培養(yǎng)4-8h;

(3)三級擴(kuò)大培養(yǎng)：將經(jīng)步驟(2)處理后的菌液加入到培養(yǎng)基中，于發(fā)酵罐中培養(yǎng)，在培養(yǎng)的過程中保持?jǐn)嚢杷俣?00-700rpm，最大通氣比1vvm，37℃培養(yǎng)5～10h；26℃繼續(xù)培養(yǎng)8h，降溫至26℃時加入終濃度為10g/l的乳糖；

所述步驟(3)三級擴(kuò)大培養(yǎng)的具體步驟如下：

使用機械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐，攪拌速度500-700rpm，最大通氣比1vvm，37℃培養(yǎng)5～10h；26℃繼續(xù)培養(yǎng)8h，降溫至26℃時加入終濃度為10g/l的乳糖。

本發(fā)明預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗的生產(chǎn)方法還有一種限定，所述大腸桿菌指含有重組質(zhì)粒peasy-e1的bl21工程菌。

由于采用了上述的技術(shù)方案，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，所取得的技術(shù)進(jìn)步在于：

本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基，物料配伍合理，原料價格低廉，該培養(yǎng)基應(yīng)用于預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗生產(chǎn)中，可以得到較高的菌苗活菌數(shù)和菌苗蛋白表達(dá)量，所得菌苗活菌數(shù)≥1.0×10¹⁰cfu/ml；所得菌苗蛋白表達(dá)量≥0.3mg/ml，每毫升可供200羽使用；

應(yīng)用上述培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗的生產(chǎn)方法，過程簡單，易于控制，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明適用于進(jìn)行預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗的生產(chǎn)。

本發(fā)明下面將結(jié)合具體實施例作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

附圖說明

圖1為預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗的生產(chǎn)方法的流程圖；

圖2為apectsh蛋白表達(dá)sds-page電泳圖；

圖中：m-mark，1-使用1#培養(yǎng)基有apectsh蛋白表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)液，2-使用2#培養(yǎng)基有apectsh蛋白表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)液，3-使用3#培養(yǎng)基有apectsh蛋白表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)液，4-使用4#培養(yǎng)基有apectsh蛋白表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)液，5-使用5#培養(yǎng)基有apectsh蛋白表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)液，6-陰性對照（使用常規(guī)lb培養(yǎng)基沒有apectsh蛋白表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)液）。

具體實施方式

下述實施例中所用的試劑及方法，如無特殊說明均為常規(guī)的試劑和常用的方法。

實施例1-5培養(yǎng)基

實施例1-5分別為一種培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基為液態(tài)，配置相應(yīng)培養(yǎng)基所用的原料如下表所示：

表1培養(yǎng)基配料表

。

實施例6一種預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗的生產(chǎn)方法

本實施例為一種預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗的生產(chǎn)方法，整個生產(chǎn)的流程圖如圖1所示，它按照如下的步驟順序依次進(jìn)行：

(61)制備含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌菌種（含有重組質(zhì)粒peasy-e1的bl21工程菌），冷凍保存；

對冷凍保存的菌種進(jìn)行如下處理：

(6a)菌種4℃解凍，在加有終濃度為100μg/mlamp的lb培養(yǎng)基中，220rpm、37℃培養(yǎng)過夜復(fù)蘇菌種，然后涂布于lb固體培養(yǎng)基上培育單菌落；

(6b)挑取單菌落于2mllb培養(yǎng)基中，220rpm、37℃培養(yǎng)7h；然后轉(zhuǎn)至100mllb培養(yǎng)基中，220rpm、37℃培養(yǎng)7h；

其中：

lb液體培養(yǎng)基配置：氯化鈉1g，蛋白胨1g，酵母0.5g，將各種試劑稱好后放入250ml三角瓶中，加入100ml純化水，使其溶解，在高壓滅菌鍋內(nèi)121℃、20min滅菌，即得。

lb固體培養(yǎng)基用于菌種復(fù)蘇后劃平板培養(yǎng)單克隆菌落用,lb固體培養(yǎng)基配置如下：

氯化鈉1g，蛋白胨1g，酵母0.5g，瓊脂0.8g，水100g;

將各種試劑稱好后放入250ml三角瓶中，加入100ml純化水，使其溶解，在高壓滅菌鍋內(nèi)121℃、20min滅菌；

(62)采用實施例1所提供的培養(yǎng)基，對菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；

擴(kuò)大培養(yǎng)為三級培養(yǎng)，具體如下：

(6a)一級擴(kuò)大培養(yǎng)：將菌液加入培養(yǎng)基中,于220rpm、37℃下振蕩培養(yǎng)6h，得菌液r;

(6b)二級擴(kuò)大培養(yǎng)：將菌液r加入到培養(yǎng)基中，于220rpm、37℃下振蕩培養(yǎng)7h,得菌液s;

(6c)三級擴(kuò)大培養(yǎng)：將菌液s加入到培養(yǎng)基中，于發(fā)酵罐中培養(yǎng)，在培養(yǎng)的過程中保持?jǐn)嚢杷俣?00rpm、最大通氣比1vvm，37℃培養(yǎng)5h；26℃繼續(xù)培養(yǎng)8h，降溫至26℃時，加入終濃度為10g/l的乳糖；

(63)使用機械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐誘導(dǎo)表達(dá)apectsh蛋白；

使用機械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐，攪拌速度500rpm，最大通氣比1vvm，37℃培養(yǎng)10h；26℃繼續(xù)培養(yǎng)8h，降溫至26℃時，加入終濃度為10g/l的乳糖。

本實施例所提供的預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗的生產(chǎn)方法，過程簡單，易于控制，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

實施例7-10預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗的生產(chǎn)方法

本實施例7-10分別提供了一種預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗的生產(chǎn)方法，它們與實施例6相似，不同之處在于：

首先，生產(chǎn)過程中相關(guān)的技術(shù)參數(shù)不同；

另外，實施例7－10所用的培養(yǎng)基依次為實施例2、3、4、5所提供的培養(yǎng)基。其中，技術(shù)參數(shù)具體數(shù)值見下表：

表2生產(chǎn)過程參數(shù)表

實施例7-10提供的預(yù)防禽類大腸桿菌病的廣譜菌苗的生產(chǎn)方法，過程簡單，易于控制，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

實施例11結(jié)果試驗

對實施例6-10所得產(chǎn)物進(jìn)行檢驗，所得菌苗活菌數(shù)≥1.0×10¹⁰cfu/ml；所得菌苗蛋白表達(dá)量≥0.3mg/ml，每毫升可供200羽使用。

實施例12對比試驗

為了對本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基的效果進(jìn)行驗證，本實施例提供了5種培養(yǎng)基，其中：1#培養(yǎng)基為實施例1所提供的培養(yǎng)基，2#－5#培養(yǎng)基與1#培養(yǎng)基配料相似，不同之處僅在于：

2#培養(yǎng)基中不含有氨基酸粉、硫酸亞鐵和硫酸鋅；

3#培養(yǎng)基不含有氨基酸粉和硫酸鋅；

4#培養(yǎng)基不含有氨基酸粉；

5#培養(yǎng)基不含有硫酸亞鐵；

6#培養(yǎng)基使用常規(guī)lb培養(yǎng)基，作為陰性對照。

上述培養(yǎng)基配置后，高壓蒸汽滅菌15min。

按照實施例6所提供的方法進(jìn)行廣譜菌苗的生產(chǎn)，下罐時，對各種培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌苗活菌數(shù)、蛋白表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果如下：

1#培養(yǎng)基所得菌苗活菌數(shù)1.3×10¹⁰cfu/ml，蛋白表達(dá)量為0.5mg/ml，每毫升可供250羽使用；

2#培養(yǎng)基所得菌苗活菌數(shù)為4.2×10⁹cfu/ml，蛋白表達(dá)量為0.08mg/ml，蛋白表達(dá)sds-page對比見附圖2，每毫升僅供50羽使用，生產(chǎn)水平遠(yuǎn)低于本發(fā)明所提供的培養(yǎng)基的生產(chǎn)水平；

3#培養(yǎng)基所得菌苗活菌數(shù)為3.5×10⁹cfu/ml，蛋白表達(dá)量0.1mg/ml，蛋白表達(dá)sds-page對比見附圖2；

4#培養(yǎng)基所得菌苗活菌數(shù)為3.2×10⁹cfu/ml，蛋白表達(dá)量為0.12mg/ml，蛋白表達(dá)sds-page對比見附圖2；

5#對照組培養(yǎng)基所得菌苗活菌數(shù)為3.2×10⁹cfu/ml，蛋白表達(dá)量為0.11mg/ml，蛋白表達(dá)sds-page對比見附圖2；

綜上所述，3#、4#、5#對照組培養(yǎng)基中僅添加硫酸亞鐵、硫酸鋅、氨基酸粉中的一種或兩種成分，發(fā)酵培養(yǎng)所得菌苗的活菌數(shù)和蛋白表達(dá)量均顯著低于三種成分全部添加的培養(yǎng)基（本發(fā)明實施例1所提供的培養(yǎng)基）。

實施例13對比試驗

本實施例是采用與實施例12相同的手段，分別用實施例2－5所提供的培養(yǎng)基替代了實施例12中的1#培養(yǎng)基，相應(yīng)地，2#－5#培養(yǎng)基也作了同等調(diào)整。本實施例的對比結(jié)果證明：3#、4#、5#對照組培養(yǎng)基中僅添加硫酸亞鐵、硫酸鋅、氨基酸粉中的一種或兩種成分，發(fā)酵培養(yǎng)所得菌苗的活菌數(shù)和蛋白表達(dá)量均顯著低于三種成分全部添加的培養(yǎng)基（本發(fā)明實施例2、3、4、5所提供的培養(yǎng)基）。

實施例1-10，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明所作的其它形式的限定，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述技術(shù)內(nèi)容作為啟示加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但凡是未脫離本發(fā)明權(quán)利要求的技術(shù)實質(zhì)，對以上實施例所作出的簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)的范圍。