本發(fā)明涉及一種K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致弱株的構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于生物工程和動(dòng)物疫病防控領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

仔豬大腸桿菌病又稱(chēng)仔豬黃白痢，有數(shù)據(jù)表明，每年有約50％的仔豬死亡與產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(Enterotoxingenic Escherichia coli,ETEC)。仔豬黃痢一般發(fā)生于產(chǎn)后1周內(nèi)的仔豬，尤其在產(chǎn)后3-5日內(nèi)高發(fā)，患病仔豬表現(xiàn)為拉黃白色或黃色水樣糞便，不及時(shí)治療，死亡率高達(dá)70％以上，甚至100％；仔豬白痢多發(fā)于10-30日齡仔豬，病豬主要變現(xiàn)為拉白色或灰白色稀便，發(fā)病率可達(dá)65％左右。該病除了造成仔豬死亡外，還會(huì)影響仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育、降低飼料報(bào)酬，給養(yǎng)殖單位造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。其中表達(dá)K88菌毛(又稱(chēng)F4菌毛)的ETEC是引起該病的重要病原菌之一。根據(jù)K88菌毛的抗原性不同，可將其分為K88ab、K88ac和K88ad三個(gè)血清型抗原變種，而豬K88ac⁺ETEC血清型在我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)都是引起仔豬黃白痢的優(yōu)勢(shì)血清型。致病過(guò)程中，K88菌毛粘附到小腸壁上，使細(xì)菌得以定居繁殖，同時(shí)菌體分泌腸毒素，導(dǎo)致水和電解質(zhì)流向腸腔，造成機(jī)體腹瀉。

對(duì)仔豬黃白痢的防治方法主要為疫苗接種、生物學(xué)預(yù)防和藥物治療：1.疫苗接種：目前預(yù)防仔豬的黃白痢的疫苗主要有全菌滅活疫苗、粘附素(菌毛)疫苗、腸毒素疫苗以及基因工程疫苗等。這些疫苗能有效降低臨床發(fā)病率，但是由于全菌滅活疫苗的細(xì)胞壁中含有脂多糖(LPS)，可能會(huì)對(duì)接種動(dòng)物造成一定的副作用，如：輕微發(fā)熱、接種后母豬不食、接種部位有炎癥反應(yīng)等；此外，粘附素疫苗、腸毒素疫苗以及基因工程疫苗的制備過(guò)程復(fù)雜、價(jià)格偏高；2.生物學(xué)預(yù)防：方定一,董國(guó)雄(1978，1979)曾從仔豬腸道內(nèi)分離到一株大腸桿菌——NY-10，該細(xì)菌是一種非致病性大腸桿菌，能有效排斥腸道內(nèi)的致病性大腸桿菌，臨床試驗(yàn)表明，NY-10能在24小時(shí)內(nèi)完成腸道的定植，并占?jí)旱剐詢(xún)?yōu)勢(shì)，持續(xù)時(shí)間為7天，口服后能有效防止防治仔豬瀉痢的發(fā)生，提高仔豬的存活率(方定一,董國(guó)雄.用無(wú)病原性Ny—10株大腸桿菌生物學(xué)防制仔豬黃痢的研究.江蘇農(nóng)業(yè)科技,1978,5(13):55-58.方定一,董國(guó)雄.用口飼NY—10株埃希氏大腸桿菌預(yù)防仔豬黃痢的研究.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),1979,10(2):79-84.)，但該菌株研究背景不甚清楚，究竟是何種類(lèi)型的腸毒素、菌體內(nèi)有沒(méi)有抗生素抗性基因均不明確，且該菌無(wú)菌毛粘附性差，體內(nèi)定植時(shí)間不長(zhǎng)，現(xiàn)臨床幾乎不再使用；3.藥物治療：理論上講，抗生素是一種有效治療細(xì)菌性疾病的藥物，但由于臨床上抗生素的長(zhǎng)期亂用、濫用，以及飼料中將抗生素作為添加劑或保健藥物，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥性日趨嚴(yán)重，有研究顯示，仔豬黃白痢的大腸桿菌對(duì)四環(huán)素、氨芐青霉素、阿莫西林、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明、甲氧芐啶、頭孢拉定、環(huán)丙沙星等常用抗生素的耐藥性達(dá)86％以上，并且一株細(xì)菌有多重耐藥譜，這些現(xiàn)狀導(dǎo)致臨床抗生素治療效果不佳。

大腸桿菌感染仔豬時(shí)，通過(guò)菌毛的粘附作用，將細(xì)菌定植到小腸上皮細(xì)胞上，這是發(fā)生感染的第一步，研究表明，熱敏感型腸毒素(LT)對(duì)菌毛的粘附有輔助作用(E M Berberov,Y Zhou,D H Francis,et al.Relative importance of heat-labile enterotoxin in the causation of severe diarrheal disease in the gnotobiotic piglet model by a strain of enterotoxigenic Escherichia coli that produces multiple enterotoxins.Infect Immun.2004,72(7):3914-24.)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致弱菌株構(gòu)建方法及其應(yīng)用。使用該方法構(gòu)建的K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌直接致弱菌株粘附性強(qiáng)、體內(nèi)定植時(shí)間長(zhǎng)、接種后能防止野毒菌株的感染，可用于K88ac⁺ETEC引起的大腸桿菌病的生物預(yù)防。本發(fā)明的基本原理是：在熱敏感型腸毒素(LT)對(duì)菌毛的粘附有輔助作用、且菌毛粘附作用是大腸桿菌感染仔豬的第一步的理論基礎(chǔ)上，利用生物工程技術(shù)，在一株無(wú)抗生素抗性基因的K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌基礎(chǔ)上，對(duì)其LT I基因進(jìn)行點(diǎn)突變，使其毒力喪失，但保持其抗原性；再進(jìn)一部敲除了ST II毒力基因，形成新的K88ac⁺致弱株，以有效阻止K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的定居繁殖，防止大腸桿菌病的發(fā)生。

為了達(dá)到以上的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致弱株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

1)對(duì)K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌腸毒素基因進(jìn)行無(wú)痕點(diǎn)突變：可選用Red同源重組技術(shù)，將無(wú)抗生素抗性基因的K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的LT I基因上的TCT突變成AAA，使其對(duì)應(yīng)編碼的63號(hào)位的絲氨酸(S)突變成賴(lài)氨酸(K)，使得LT I的毒力喪失；

2)對(duì)K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌腸毒素基因的敲除：在步驟1)的基礎(chǔ)上，可選用Red同源重組技術(shù)，敲除K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的STⅡ基因，從而達(dá)到致弱K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的目的；更進(jìn)一步地，敲除K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的STⅡ基因時(shí)，替代一段大小為34bp的dif位點(diǎn)，作為以后辨別該致弱株的標(biāo)記。

可選地，上述構(gòu)建方法中所述的無(wú)抗生素抗性基因的K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌為表達(dá)K88ac菌毛，并產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌野生株K88ac⁺ETEC(YZ1205)。

可選地，上述K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致弱株的構(gòu)建方法，具體包括如下步驟：

第一步：利用Red同源重組無(wú)痕點(diǎn)突變技術(shù)，對(duì)K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌YZ1205腸毒素基因進(jìn)行無(wú)痕點(diǎn)突變，使其LT I基因上的TCT突變成AAA，使其對(duì)應(yīng)編碼的63號(hào)位的絲氨酸(S)突變成賴(lài)氨酸(K)，并得到重組菌K88ac⁺ETEC LT(S63K)；

可選地，此步可以分為以下幾個(gè)具體操作步驟：

(1)以質(zhì)粒pSG76-CS為模板，使用引物P1、P2和P3，利用重疊PCR方法擴(kuò)增DNA片段；其中，所述的引物P1具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述的引物P2具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述的引物P3具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

(2)以步驟(1)中所獲得的PCR產(chǎn)物為模板，使用分別具有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的引物P4和P5繼續(xù)擴(kuò)增后，提純回收；

(3)利用Red同源重組技術(shù)，使用步驟(2)中所得的DNA片段，對(duì)K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌YZ1205腸毒素基因進(jìn)行無(wú)痕點(diǎn)突變，使其LT I基因上的TCT突變成AAA，使其對(duì)應(yīng)編碼的63號(hào)位的絲氨酸(S)突變成賴(lài)氨酸(K)，并得到重組菌K88ac⁺ETEC LT(S63K)；

第二步：以K88ac⁺ETEC(YZ1205)為模板，以具有SEQ ID NO.6的引物P6和具有SEQ ID NO.7的引物P7，以及具有SEQ ID NO.8的引物P8和具有SEQ ID NO.9的引物P9，分別擴(kuò)增DNA片段后，提純回收；

第三步：將第二步中所獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，分別用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、SmaⅠ和SmaⅠ、HindⅢ，按順序分別插入pUC18載體(大連寶生物公司)中相應(yīng)的酶切位點(diǎn)；再將供篩選用抗性基因DNA片段(優(yōu)選地，大腸桿菌基因刪除試劑盒中的dif-Gm-dif DNA片段)插入SmaⅠ酶切位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒；

第四步：以第三步中所構(gòu)建的重組質(zhì)粒為模板，使用分別具有SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列的引物P10和P11繼續(xù)擴(kuò)增后，提純回收；

第五步：利用Red同源重組技術(shù)，基于第一步中所得的重組菌K88ac⁺ETEC LT(S63K)，使用第四步中所純化的PCR產(chǎn)物，敲除K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的STⅡ基因，達(dá)到致弱K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的目的。在第三步使用的供篩選用抗性基因DNA片段為大腸桿菌基因刪除試劑盒中的dif-Gm-dif DNA片段的優(yōu)選情況下，可以將插入的慶大霉素抗性基因刪除，留下一段大小為34bp的dif位點(diǎn)，作為致弱株鑒定標(biāo)記。

本發(fā)明還提供了上述產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致弱株構(gòu)建方法在防止K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案達(dá)到了如下的有益效果：

1)本發(fā)明通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建致弱K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的方法，主要是采取了直接在無(wú)抗生素抗性基因的K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行LT I基因點(diǎn)突變以及STⅡ基因敲除方法，有別于常規(guī)的大腸桿菌內(nèi)轉(zhuǎn)化表達(dá)編碼特定菌毛的質(zhì)粒，避免在無(wú)抗生素存在時(shí)質(zhì)粒易于丟失情形發(fā)生；

2)根據(jù)本發(fā)明的方法制備而得的K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致弱株，LT I基因點(diǎn)突變后63位絲氨酸變?yōu)橘?lài)氨酸，STⅡ基因缺失，K88ac菌毛表達(dá)不受影響、粘附性強(qiáng)，但毒力大大降低，同時(shí)該菌株不帶有常見(jiàn)的抗生素抗性基因(這點(diǎn)在前期樣品采集時(shí)已驗(yàn)證，見(jiàn)具體實(shí)施例1)，使用時(shí)不影響抗生素對(duì)其他細(xì)菌性疾病的治療，且體內(nèi)定植時(shí)間長(zhǎng)；

3)本發(fā)明通過(guò)基因工程的方法構(gòu)建致弱K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，并在小鼠體內(nèi)進(jìn)行了驗(yàn)證，能夠有效防止野毒株的感染，突破常規(guī)的疫苗接種預(yù)防、抗生素治療等大腸桿菌病防控方法；

3)本發(fā)明提供的致弱K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌來(lái)源于感染的仔豬，因此也可為仔豬K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染的預(yù)防提供一種有效生物預(yù)防方法。中國(guó)豬飼養(yǎng)量巨大，發(fā)生黃痢的仔豬數(shù)量眾多，利用基因工程方法構(gòu)建的K88ac+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致弱株能有效預(yù)防K88ac+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌引起的仔豬黃痢，這對(duì)于減少抗生素的使用有重要的意義，有很好的應(yīng)用前景，可帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益。

附圖說(shuō)明

圖1是LT(S63K)基因點(diǎn)突變測(cè)序結(jié)果。

圖2是STⅡ基因敲除測(cè)序分析結(jié)果。

圖3是兔體腸毒素檢測(cè)結(jié)果。

圖4是K88ac⁺ETEC(YZ1205)和K88ac+ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ生長(zhǎng)特性比較。

圖5是間接免疫熒光(IFA)結(jié)果；其中，1.K88ac+ETEC(YZ1205)，2.K88ac+ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ，3.DH5α。

圖6是小鼠回腸粘附試驗(yàn)結(jié)果；其中，1.DH5α，2.K88ac+ETEC(YZ1205)，3.K88ac+ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ，4.PBS。

圖7是PCR結(jié)果；其中，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，1-23：攻毒第1-23d PCR檢測(cè)結(jié)果，24：第24d PCR檢測(cè)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的介紹。

生物材料來(lái)源：

K88ac⁺ETEC(YZ1205)：本實(shí)驗(yàn)分離保存；

大腸桿菌(E.coli)DH5α感受態(tài)細(xì)胞：購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司(Cat No，9057)；

pUC18載體：購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司(Cat No，3218)；

質(zhì)粒pSG76-CS、pSTKST：由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院張立軍教授惠贈(zèng)[胡逢雪,丁銳,崔震海,于金龍,劉麗霏,敖永華,張立軍.大腸桿菌基因無(wú)痕敲除技術(shù)及策略[J],生物技術(shù)通訊,2013,4(24):552-556]。

大腸桿菌基因刪除試劑盒：購(gòu)于江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；

抗K88ac菌毛單克隆抗體：由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院微生物教研室制備并保存；

Goat Anti-Mouse IgG H&L(Alexa488)：購(gòu)于Abcam公司(Cat No，ab150113)；

8w齡的Balb/c小鼠購(gòu)于揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

實(shí)施例1

本實(shí)施例1中，采用發(fā)生黃痢仔豬小腸道內(nèi)分離的一株大腸桿菌，構(gòu)建K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致弱株。具體包括以下步驟：

1.K88ac⁺ETEC分離：

用麥康凱培養(yǎng)基從江蘇某豬場(chǎng)初次發(fā)生仔豬黃痢5日齡豬小腸道內(nèi)分離的一株大腸桿菌。經(jīng)檢測(cè)，該大腸桿菌能表達(dá)K88ac菌毛，具有LT I和STⅡ腸毒素基因，未檢測(cè)到常見(jiàn)的毒力島基因，不能在含有氨芐青霉素、四環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素、鏈霉素、頭孢噻嗪、諾氟沙星、紅霉素、強(qiáng)力霉素等抗生素的瓊脂平板上生長(zhǎng)。命名為K88ac⁺ETEC(YZ1205)。

2.K88ac+產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致弱株的構(gòu)建：

(1)LT基因點(diǎn)突變：

根據(jù)GenBank發(fā)表的pUMNK88Ent序列(Access NO.CP002732.1)，設(shè)計(jì)合成下列引物P1-P5。所述的引物P1-P5的核苷酸序列如下：

P1:5’-gaggaacacaaaccggctttgtcagatatgatgacggatatgtttccactaaacttagtttgagaagtgctcac-3’(SEQ ID NO.1)；

P2:5’-cgagctcggtacccggggatccgctagggataacagggtaatgtcctgctaagtgagcacttctcaaactaagTTTag-3’(SEQ ID NO.2)；

P3:5’–gaatatcctgataatatagactgtcctgctaagtgagcacttctcaaactaagattaccctgttatccctatagcggccgcaaaaattaaaaatgaag-3’(SEQ ID NO.3)；

P4：5'-gaggaacacaaaccggctttg-3’(SEQ ID NO.4)；

P5：5'-gaatatcctgataatatagactg-3’(SEQ ID NO.5)。

以質(zhì)粒pSG76-CS為模板，利用重疊PCR方法擴(kuò)增DNA片段。其中，在引物P1、P2和P3的作用下擴(kuò)增發(fā)生點(diǎn)突變的部分LT I基因以及插入其內(nèi)部、來(lái)源于質(zhì)粒pSG76-CS的I-Sec1位點(diǎn)之間的DNA序列，該擴(kuò)增片段帶有同源左右臂，用于后面的Red重組。

重疊PCR方法中，PCR反應(yīng)體系為：質(zhì)粒pSG76-CS(50ng/μL)1μL、引物P1、P2和P3(25μM)各1μL、dNTP(10mM/each，大連寶生物公司)2μL、5x buffer 10μL、PrimSTAR HS DNA聚合酶(大連寶生物公司)0.5μL，去離子水補(bǔ)至50μL。PCR程序?yàn)椋?8℃變性10sec后，68℃退火、延伸2min，共進(jìn)行30循環(huán)，溫度降至16℃。擴(kuò)增后，1％瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物。

隨后，以上述PCR產(chǎn)物為模板，再用引物P4、P5擴(kuò)增完整的上述基因。PCR反應(yīng)體系為：PCR產(chǎn)物(5ng/μL)1μL、引物P4和P5(25μM)各1μL、dNTP(10mM/each，大連寶生物公司)2μL、5x buffer 10μL、PrimSTAR HS DNA聚合酶(大連寶生物公司)0.5μL，去離子水補(bǔ)至50μL。PCR程序?yàn)椋?8℃變性10sec后，54℃退火5sec；72℃延伸2min，共進(jìn)行30循環(huán)，溫度降至16℃。擴(kuò)增后，1％瓊脂糖凝膠電泳，回收大小約1390bp大小的DNA片段。

將大腸桿菌基因刪除試劑盒中的質(zhì)粒pKD46轉(zhuǎn)化K88ac⁺ETEC，并將攜帶質(zhì)粒的K88ac⁺ETEC(YZ1205)用0.4％L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后，制備成電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，取5μL P3、P4擴(kuò)增產(chǎn)物(約500μg)加入制備的80μL感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后冰上靜置1min，轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的1mm電擊杯中進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化條件為1800V，250Ω，25μF，1mm，電擊后迅速加入800μL SOB培養(yǎng)基混勻，將電擊杯中菌液轉(zhuǎn)移到1.5m L EP管中，37℃180rpm振蕩培養(yǎng)2-3h，涂布于含25mg/mL氯霉素(Cm)的LB平板上，30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18h后，挑取長(zhǎng)出的菌落用引物P4、P5進(jìn)行PCR鑒定。鑒定為陽(yáng)性的重組菌接種至含Cm的LB固體培養(yǎng)基中42℃繼續(xù)培養(yǎng)18h，將長(zhǎng)出的菌落轉(zhuǎn)接種于含0.1mg/mL氨芐青霉素(Amp)的LB平板和不含任何抗生素的LB的平板，37℃培養(yǎng)18h后，Amp平板上未長(zhǎng)出菌落而LB平板上長(zhǎng)出菌落，表明pKD46質(zhì)粒丟失成功。

將上述丟失pKD46質(zhì)粒的重組菌制備成感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pSTKST，并在含50mg/mL卡那霉素(Kan)的LB平板培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接種長(zhǎng)出的菌落至含Kan的LB的液體培養(yǎng)基中，30℃，180rpm振蕩培養(yǎng)3-5h后，向培養(yǎng)基中加入氯四環(huán)素(CTc)使其終濃度為30μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24-36h，誘導(dǎo)I-Sec1酶表達(dá)，切開(kāi)突變基因組兩端的I-Sec1識(shí)別位點(diǎn)，再通過(guò)大腸桿菌自身的修復(fù)機(jī)制，發(fā)生二次重組；將誘導(dǎo)后的菌液稀釋后，吸取50μL涂布于含Kan的LB平板上，30℃培養(yǎng)24h后，長(zhǎng)出的單菌落，用引物P4、P5進(jìn)行PCR鑒定，并將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pMD18T載體(大連寶生物公司)，進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明(圖1)，第63位絲氨酸(TCT)變?yōu)橘?lài)氨酸(AAA)，所獲得的細(xì)菌命名為K88ac⁺ETEC LT(S63K)。將上述制備的重組菌接種LB固體培養(yǎng)基，42℃繼續(xù)培養(yǎng)18h，將長(zhǎng)出的菌落轉(zhuǎn)接種于含Kan的LB平板和不含任何抗生素的LB的平板，37℃培養(yǎng)18h后，Kan平板上未長(zhǎng)出菌落而LB平板上長(zhǎng)出菌落，表明pSTKST質(zhì)粒丟失成功。

(2)STⅡ基因敲除：

根據(jù)GenBank發(fā)表的pUMNK88Ent序列(Access NO.CP002732.1)，設(shè)計(jì)合成下列引物：其中引物P6、P7用于擴(kuò)增同源左臂；引物P8、P9用于擴(kuò)增同源右臂；引物P10、P11用于擴(kuò)增來(lái)自于構(gòu)建的重組載體中的同源左臂、dif-Gm-dif片段、同源右臂DNA片段；引物P12、P13用于鑒定大腸桿菌中STⅡ基因是否被敲除。所述的引物P6-P13的核苷酸序列如下：

P6:5’-ctgaattccgctgcattattgattttaggac-3’(SEQ ID NO.6)；

P7：5’-cgcccgggcacctcaaccttattgctataag-3’(SEQ ID NO.7)；

P8：5’-cgcccgggtatatttatcaatagcattcagcacc-3’(SEQ ID NO.8)；

P9：5’-gcgaagcttccggatgatctctaaatatgaat-3’(SEQ ID NO.9)；

P10：5’-catataaaagcccactgg-3’(SEQ ID NO.10)；

P11：5’-ctttttatgaaaaattatttttg-3’(SEQ ID NO.11)；

P12：5’-attgttgacatgaacagc-3’(SEQ ID NO.12)；

P13：5’-gcgatctccttcgttagg-3’(SEQ ID NO.13)。

將K88ac⁺ETEC(YZ1205)接種LB液體培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，取1μL菌液作為模板，以引物P6、P7和P8、P9分別擴(kuò)增大小為378bp和356bp的DNA片段。

其中，PCR反應(yīng)體系為：菌液1μL、引物(25μM)各1μL、dNTP(10mM/each，大連寶生物公司)2μL、5x buffer 10μL、PrimSTAR HS DNA聚合酶(大連寶生物公司)0.5μL，去離子水補(bǔ)至50μL。PCR程序?yàn)椋?8℃變性10sec后，68℃退火、延伸1min，共進(jìn)行30循環(huán)，溫度降至16℃。

擴(kuò)增后，1％瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物，并分別用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、SmaⅠ和SmaⅠ、HindⅢ，按順序分別插入pUC18載體(大連寶生物公司)中相應(yīng)的酶切位點(diǎn)；構(gòu)建的重組質(zhì)粒用SmaⅠ酶切后，與大腸桿菌基因刪除試劑盒中的dif-Gm-dif片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，構(gòu)建重組質(zhì)粒。以引物P10、P11擴(kuò)增大小為1300bp的DNA片段。

其中，反應(yīng)體系為：菌液1μL、引物(25μM)各1μL、dNTP(10mM/each，大連寶生物公司)2μL、5x buffer 10μL、PrimSTAR HS DNA聚合酶(大連寶生物公司)0.5μL，去離子水補(bǔ)至50μL。PCR程序?yàn)椋?8℃變性10sec后，68℃退火、延伸2min，共進(jìn)行30循環(huán)，溫度降至16℃，1％瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產(chǎn)物。

將大腸桿菌基因刪除試劑盒中的質(zhì)粒pKD46轉(zhuǎn)化K88ac⁺ETEC LT(S63K)，L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后，制備成電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，將上述P10、P11引物擴(kuò)增的DNA片段電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)化條件同上。轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌培養(yǎng)2h，涂布含59.3mg/mL慶大霉素(Gm)和0.1mg/mL Amp的LB固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)18h，長(zhǎng)出的菌落用引物P12、P13進(jìn)行PCR鑒定，陽(yáng)性菌落能擴(kuò)增出大小約1834bp大小的DNA片段，陰性菌落擴(kuò)增出的DNA片段大小為1.34bp。將鑒定出的陽(yáng)性菌在LB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)36h后，分別接種含Gm和Amp的LB固體培養(yǎng)基和無(wú)抗生素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，篩選只能在無(wú)抗生素LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的重組菌，此時(shí)的細(xì)菌利用自身Xer酶切除了Gm抗性基因，并用引物P12、P13進(jìn)行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定(圖2)，結(jié)果編碼STⅡ的核苷酸被成功敲除，替代了兩個(gè)SmaI限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)(379-384,419-424)和一個(gè)dif位點(diǎn)(385-418)；再用前面的方法，提高培養(yǎng)溫度，丟失質(zhì)粒pKD46。構(gòu)建的細(xì)菌命名為K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ。

實(shí)施例2

本實(shí)施例2中，對(duì)實(shí)施例1中構(gòu)建的K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致弱株的生物學(xué)特性進(jìn)行了檢測(cè)，具體如下：

1)腸毒素檢測(cè)

配制改良的產(chǎn)毒培養(yǎng)基CAYE培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g、酵母3g、氯化鈉1.25g、磷酸氫二鉀5.7g、微量鹽混合溶液0.5mL(5.0％硫酸鎂、0.5％氯化錳、0.5％三氯化鐵溶于0.001M硫酸溶液中)依次溶于滅菌蒸餾水中，使總量成500mL。用10M氫氧化鈉調(diào)pH到8.5，121℃高壓滅菌15min，放4℃冰箱備用，使用前以無(wú)菌方法加入葡糖至0.25％。

分別將K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ和DH5α接種于改良的CAYE液體培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，第二天1:100轉(zhuǎn)接種50mL改良的CAYE培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)72h，加多粘菌素B 66μl(40000單位/ml)，37℃作用0.5h，4000-5000rpm 4℃離心30min，取上清，用0.45μm的濾膜過(guò)濾除菌。

將2-3kg的健康家兔，手術(shù)前饑餓48h，麻醉后以無(wú)菌術(shù)切開(kāi)腹壁，自回盲口開(kāi)始，沿向心方向用4號(hào)手術(shù)縫線結(jié)扎回腸，注射段約5cm，間隔段約1cm，共4段。第一段注射除菌的CAYE培養(yǎng)基，第二段注射無(wú)菌DH5α培養(yǎng)上清，第三段注射無(wú)菌K88ac⁺ETEC(YZ1205)培養(yǎng)上清，第四段注射無(wú)菌K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ培養(yǎng)上清，每段注射1mL。注射完畢后縫合切口，禁食，術(shù)后6h給予少量飲水。12h后取出結(jié)扎腸斷，測(cè)定各腸段的積液體積和腸段的長(zhǎng)度。計(jì)算液體積與腸段長(zhǎng)度比值，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)一次，取平均值。結(jié)果注射K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ、DH5α無(wú)菌培養(yǎng)上清以及CAYE培養(yǎng)基的腸段積液體積與腸段長(zhǎng)度比值均小于等于0.9，而注射K88ac⁺ETEC(YZ1205)無(wú)菌培養(yǎng)上清的腸段積液體積與腸段長(zhǎng)度比值為1.27(圖3)，這表明K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ的腸毒素基因突變和敲除后確實(shí)不能造成大量水和電解質(zhì)流入腸腔而導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。

2)生長(zhǎng)特性比較

將K88ac⁺ETEC(YZ1205)和K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ分別劃線于麥康凱培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12h。挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃，220rpm搖床中培養(yǎng)12h。取24支盛有LB培養(yǎng)基的試管，野生株與減毒株各12管。分別標(biāo)注培養(yǎng)時(shí)間為0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、24h，用移液槍按1:100比例轉(zhuǎn)接種到標(biāo)記好的試管中，測(cè)定OD600，調(diào)整各管細(xì)菌濃度，保每管OD值均相同，37℃220rpm培養(yǎng)。分別在0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、24h，取出菌液，以未接種的LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照，OD600測(cè)定比濁度，并進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終繪制出生長(zhǎng)曲線。由圖4可知，細(xì)菌培養(yǎng)前10h，K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ生長(zhǎng)略慢于野生的K88ac⁺ETEC(YZ1205)，生長(zhǎng)至10h時(shí)，兩者繁殖的細(xì)菌總數(shù)基本相等，10h后由于菌液的濃度過(guò)高，超出分光光度計(jì)測(cè)定范圍，而無(wú)法進(jìn)行測(cè)定，表明腸毒素基因的突變、敲除對(duì)細(xì)菌最終繁殖數(shù)量影響不大。

3)小鼠小腸黏附試驗(yàn)

在LB平板上復(fù)蘇K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ和DH5α，挑取單個(gè)菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中，37℃220rpm過(guò)夜培養(yǎng)，離心收集菌體，用無(wú)菌的37℃0.01moL/L PBS(pH7.6)洗滌3遍后，用抗K88ac菌毛的單克隆抗體進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)菌毛是否表達(dá)，結(jié)果顯示(圖5)，K88ac ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ菌能正常表達(dá)具有粘附作用的K88ac菌毛。調(diào)整細(xì)菌濃度至OD600＝1.0備用。

將8w齡大小的清潔級(jí)Balb/c小鼠頸椎脫臼處死后，采集小鼠的回腸，切割成大小3mm長(zhǎng)的腸段，剪開(kāi)腸管，無(wú)菌的37℃0.01moL/L PBS(pH7.6)中洗滌3遍，浸泡到上述1mL菌液及無(wú)菌的0.01moL/L PBS(pH7.6)中，37℃孵育1h后，刮取回腸粘膜，涂布載玻片，美蘭染色后顯微鏡下觀察細(xì)菌，結(jié)果(圖6)K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ菌液浸泡的腸粘膜刮取液中可觀察到菌體，而DH5α菌液和PBS液浸泡的腸粘膜刮取液中無(wú)可見(jiàn)的菌體，表明在菌毛的作用下，大腸桿菌能粘附到小鼠的回腸粘膜表面，同時(shí)也證明Balb/c小鼠是一種良好的K88ac菌毛粘附實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

4)減毒株對(duì)小鼠免疫保護(hù)作用及在小鼠體內(nèi)定植時(shí)間

為了避免過(guò)多的小鼠腸道內(nèi)雜菌干擾，在進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前用抗生素清理腸道內(nèi)的其他雜菌，而K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ都不帶有抗性基因，在實(shí)驗(yàn)前，在上述兩種細(xì)菌中轉(zhuǎn)化了帶氨芐青霉素抗性基因的pUC18質(zhì)粒。

在含Amp的LB平板上復(fù)蘇K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ，挑取單個(gè)細(xì)菌接種于含Amp的TSB液體培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)至OD600為2.0，用無(wú)菌的0.01moL/L PBS(pH7.6)洗滌3遍，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，調(diào)整細(xì)菌濃度至10⁹cfu/400μL，用于小鼠灌胃接種。

飼喂8w齡的Balb/c小鼠含氨芐青霉素(5g/L)的無(wú)菌水，水里添加同時(shí)6.7％的果糖，以促進(jìn)飲水，清除腸道內(nèi)的其他菌群；48h后，灌胃前12h，小鼠禁食；灌胃前4h，將飲水換為無(wú)果糖但添加抗生素的無(wú)菌水；灌胃前3h，給小鼠腹腔注射西咪替丁(50mg/kg)，以減少胃酸分泌。將小鼠分成4組，第一組5只，第二組5只，第三組35只，第四組5只；第一、二、四組每只小鼠分別灌胃400μL攜帶pUC18質(zhì)粒的K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ菌液，以及無(wú)菌的0.01moL/L PBS(pH7.6)；第三組每只小鼠灌胃400μL，在接種K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ后24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h，任取5只再次灌胃400μL攜帶pUC18質(zhì)粒的K88ac⁺ETEC(YZ1205)。接種后觀察和記錄各組小鼠的發(fā)病、死亡情況，對(duì)死亡的小鼠進(jìn)行解剖觀察腸道的病變；同時(shí)每天收集第二組小鼠的糞便，兩倍體積的無(wú)菌0.01moL/L PBS(pH7.6)溶解后，轉(zhuǎn)接種含Amp的TSB液體培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，用針對(duì)LT I的具有如下核苷酸序列的特異引物PCR檢測(cè)K88ac+ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ在腸道內(nèi)的定植時(shí)間：

P14：5’TAGAGACCGGTATTACAGAAATCTGA3’(SEQ ID NO.14)；

P15：5’TCATCCCGAATTCTGTTATATATGTC3’(SEQ ID NO.15)；

其反應(yīng)體系為：菌液1μL、引物P14、P15各1μL、dNTP(10mM/each，大連寶生物公司)2μL、10x buffer 5μL、rTaq DNA聚合酶(大連寶生物公司)0.5μL，去離子水補(bǔ)至50μL。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min后，94℃變性30sec、54℃退火30sec、72℃延伸1min，共進(jìn)行30循環(huán)，72℃再充分延伸10min，溫度降至16℃，1％瓊脂糖凝膠電泳。

結(jié)果第二組以及空白對(duì)照第四組所有小鼠精神狀態(tài)良好，無(wú)任何臨床癥狀；第一組接種4h后，小鼠出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，不愿走動(dòng)，禁食進(jìn)水較少，蜷縮成一團(tuán)，被毛豎立，出現(xiàn)顫抖等臨床癥狀，部分小鼠尿色變深、腹瀉，12-24h內(nèi)死亡4只，最終存活1只，剖檢死亡小鼠，可見(jiàn)腸道鼓氣、有較多積液，腸系膜水腫，腹腔內(nèi)有漿液性滲出；第三組分別在不同時(shí)間段攻毒，144h后攻毒以及之前不同時(shí)間段攻毒的小鼠精神狀態(tài)良好，無(wú)任何臨床癥狀，168h后攻毒的5只小鼠，其中4只精神狀態(tài)良好，無(wú)任何臨床癥狀，1只8h后出現(xiàn)精神萎靡，被毛豎立，蜷縮成一團(tuán)癥狀，但第二天又恢復(fù)正常。這表明減毒的K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ可在24h內(nèi)完成對(duì)小腸的占位，并在隨后的6-7天內(nèi)起著良好的生物屏障作用，能有效阻止K88ac⁺ETEC(YZ1205)的粘附，由K88ac⁺ETEC引起的仔豬黃痢一般高發(fā)生時(shí)間為出生后的3-5天，ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ可以預(yù)防該階段K88ac⁺ETEC引起的仔豬黃痢。PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，減毒的K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ在小鼠體內(nèi)定植的時(shí)間能維持23d(圖7)。這表明構(gòu)建的K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌能有效防止K88ac⁺產(chǎn)腸毒素大腸桿菌野毒株的感染。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)、說(shuō)明書(shū)及其等效物界定。