專利名稱：一種用于桑黃菌液體培養(yǎng)的合成培養(yǎng)基及發(fā)酵生產(chǎn)桑黃多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于藥用真菌桑黃菌液體培養(yǎng)的全合成培養(yǎng) 基的以及采用所述培養(yǎng)基的桑黃菌發(fā)酵生產(chǎn)桑黃多糖的方法。
背景技術(shù)：
桑黃(We////7^ /gw/"n'^)又稱火木層孔菌，屬擔(dān)子菌綱，層孔菌屬，寄生于桑樹樹 木之上，是一種珍稀的食藥用真菌，桑黃主要活性成分為桑黃多糖，能提高機(jī)體免疫力， 具有顯著的抗腫瘤活性，極具開發(fā)價(jià)值。
由于桑黃菌生理生態(tài)的復(fù)雜性、特殊性，桑黃子實(shí)體數(shù)量稀少。采用液體深層培養(yǎng)技 術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)桑黃菌絲體以及其活性多糖物質(zhì)是滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需要的有效途徑。在現(xiàn)有 生產(chǎn)技術(shù)和文獻(xiàn)報(bào)道中，桑黃液體培養(yǎng)采用的發(fā)酵培養(yǎng)基主要采用天然農(nóng)副產(chǎn)品為碳氮源， 如土豆汁、糖蜜、黃豆餅粉、玉米槳等。由于復(fù)合碳氮源的成分復(fù)雜，批次之間存在成分 上的差異往往造成桑黃菌液體培養(yǎng)生產(chǎn)菌絲體產(chǎn)量和多糖分子量不穩(wěn)定，同時(shí)也給桑黃多 糖的下游提取分離帶來困難。
全合成培養(yǎng)基具有成分清楚、質(zhì)量穩(wěn)定、雜質(zhì)少等優(yōu)點(diǎn)，可以用于桑黃多糖合成的定 向調(diào)控和代謝流分析，以及大規(guī)模生產(chǎn)過程質(zhì)量控制的需要；同時(shí)有利于下游多糖分離提 取。目前，國(guó)內(nèi)外還沒有桑黃全合成培養(yǎng)基的文獻(xiàn)和專利報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供用于桑黃培養(yǎng)的合成培養(yǎng)基配方，以及利用此培養(yǎng)基生產(chǎn)桑黃 多糖的方法。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的具體技術(shù)解決方案如下
合成培養(yǎng)基中以葡萄糖為碳源，20種氨基酸為氮源，以及無機(jī)鹽和維生素組成，碳氮
比約按50: l設(shè)計(jì)，具體濃度如下(g/L):葡萄糖30-80 g，谷氨酸0.1-1.5 g，谷氨酰胺 0.1 1.5g，天冬氨酸0.1-1.5 g，天冬酰胺0.1-1.5 g谷氨酸0.01 0.1g，色氨酸0.01 0.1g， 纈氨酸0.01 0.1 g， 丙氨酸0.01 0.1g， 亮氨酸0.01 0.1g， 異亮氨酸0.01 0.1g，苯丙氨 酸0.001 0.1g，蛋氨酸0.01 0.1g，脯氨酸0.01 0.1g，甘氨酸0.01 0.1g，絲氨酸0.01~0.1
g，賴氨酸0.01 0.1g，半胱氨酸0.01~0.1g，酪氨酸0.01~0.1g，精氨酸0.01~0.1g，組氨 酸0.01 0.1g， MgSO40.5 2g， KH2PO40.5~2g， NaC10.3~l.5g， FeS04 0.01~0.15g， MnS04 7H2O0.01~0.07g， ZnS04.7H20 0.01~0.1g， CoCl2 0.0001 0.05g, CuSO40.0001 0.03g ， CaCl20.05~0.5g， VBi50 500ug， H20 l.OL。
培養(yǎng)基初始pH控制在5.5~7.5,滅菌溫度115~12rC，滅菌時(shí)間30min.
利用此合成培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)桑黃菌絲體和桑黃多糖的發(fā)酵工藝接種量5~15%， 培養(yǎng)溫度24 28。C，往復(fù)式搖床轉(zhuǎn)數(shù)160 220rpm。
本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)采用全合成培養(yǎng)基培養(yǎng)過程桑黃菌絲生長(zhǎng)迅速，桑黃菌絲體產(chǎn) 量最高可達(dá)20g/L,是目前深層培養(yǎng)桑黃菌絲體產(chǎn)量最高的報(bào)道；同時(shí)培養(yǎng)基中不引入農(nóng)副
產(chǎn)品為碳氮源，桑黃多糖中不夾帶培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)、培養(yǎng)基成分等物質(zhì)，發(fā)酵生產(chǎn)的桑黃
胞外多糖純度高、質(zhì)量穩(wěn)定，桑黃多糖產(chǎn)量最高為0.198g/L。本發(fā)明具有成分清晰、質(zhì)量 穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可用于桑黃菌液體大規(guī)模培養(yǎng)和多糖合成代謝調(diào)控規(guī)律研究。
具體實(shí)施方法
本實(shí)施例使用的菌種是購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)桑黃菌種 (火木層孔菌，編號(hào)5.95)，
實(shí)施例1:
配制本發(fā)明中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基1L，其各組分的濃度(g/L)為葡萄糖50g，谷氨 酸0.8g，谷氨酰胺0.8g，天冬氨酸0.8g，天冬酰胺0.8 g谷氨酸0.04 g，色氨酸0.04 g,纈氨酸0.04g，丙氨酸0.04g，亮氨酸0.04g，異亮氨酸0.04g，苯丙氨酸0.04g，蛋氨 酸0.04g，脯氨酸0.04g，甘氨酸0.04g，絲氨酸0.04g，賴氨酸0.04g，半胱氨酸0.04g， 酪氨酸0.04g，精氨酸0.04g，組氨酸0.04g， MgSO41.0g， KH2PO41.0g， NaCl 0.85 g， FeS04 0.05 g， MnS04 7H20 0.0383 g， ZnS04 7H20 0.0383g， CoCl2 0.0043 g， CuSO40.0096 g， CaCl20.25 g， VB^00ug， H20 l.OL調(diào)節(jié)pH到6.0， 將培養(yǎng)基分裝到 250mL的三角瓶中，裝液量為50mL，滅菌溫度115。C，時(shí)間30min。
桑黃菌絲培養(yǎng)接種10% (V/V)桑黃種子液，培養(yǎng)溫度25-C，轉(zhuǎn)速180rpm/min,每 24h取樣，3500rpm離心10min。用蒸餾水洗滌菌絲體3次，烘干至恒重，稱重264小時(shí)菌 體干重達(dá)到17.67g/l。上清液濃縮，按體積比1: 4的比例加入酒精，4'C冰箱過夜，離心 沉淀，用l: 4的酒精清洗3次，溶于水用苯酚硫酸法測(cè)多糖含量，264小時(shí)測(cè)定多糖含量
為0.198g/L 實(shí)施例2:
配制本發(fā)明中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基1L，其各組分的濃度(g/L)為葡萄糖70g,谷氨酸 0.5 g,谷氨酰胺0.5 g,天冬氨酸0.5 g，天冬酰胺0.5 g,谷氨酸0.04 g,色氨酸0.04 g,纈氨 酸0.04 g，丙氨酸0.04g,亮氨酸0.04g，異亮氨酸0.04g，苯丙氨酸0.04g,蛋氨酸0.04g,脯 氨酸0.04g,甘氨酸0.04g,絲氨酸0.04g,賴氨酸0.04g,半胱氨酸0.04g,酪氨酸0.04g,精 氨酸0.04 g,組氨酸0.04 g, MgS04 1.0 g, KH2PO41.0 g, NaCl 0.85 g, FeS04 0.05 g, MnS04 7H20 0.0383 g, ZnS04 7H20 0.0383g, CoCl2 0.0043 g, CuSO40.0096 g， CaCl2 0.25 g， VBi200ug,H2(D l.OL調(diào)節(jié)pH到6.0，將培養(yǎng)基分裝到250mL的三角瓶中，裝液量為50mL， 滅菌溫度115'C，時(shí)間30min。
桑黃菌絲培養(yǎng)接種10% (V/V)桑黃種子液，培養(yǎng)溫度25°C，轉(zhuǎn)速180rpm/min,每 24h取樣，3500rpm離心10min。用蒸餾水洗滌菌絲體3次，烘干至恒重，192小時(shí)菌體干 重達(dá)到19.2g/1。上清液濃縮，按體積比l: 4的比例加入酒精，4"C冰箱過夜，離心沉淀， 用1:4的酒精清洗3次，溶于水用苯酚硫酸法測(cè)多糖含量，192小時(shí)測(cè)定多糖含量為0.08g/l。
實(shí)施例3:
配制本發(fā)明中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基lL，其各組分的濃度(g/L)為葡萄糖50g，谷氨酸0.8 g,谷氨酰胺0.8 g,天冬氨酸0.8 g,天冬酰胺0.8 g,谷氨酸0.04 g,色氨酸0.04 g,纈氨酸 0.04 g，丙氨酸0.04g，亮氨酸0.04g，異亮氨酸0.04g，苯丙氨酸0.04g,蛋氨酸0.04g，脯氨酸 0.04 g,甘氨酸0.04g,絲氨酸0.04g,賴氨酸0.04g,半胱氨酸0.04g,酪氨酸0.04g,精氨酸 0.04 g,組氨酸0.04 g， MgS04 1.0 g, KH2PO41.0 g, NaCl 0.85 g, FeS04 0.05 g， MnS04 7H20 0.0383 g, ZnS04 7H20 0.0383g， CoCl2 0.0043 g, CuSO40.0096 g， CaCl20.25 g, VB,200ug, H20 l.OL調(diào)節(jié)pH到6.0，將培養(yǎng)基分裝到250mL的三角瓶中，裝液量為50mL，滅菌溫度115 °C，時(shí)間30min。
桑黃菌絲培養(yǎng)接種10% (V/V)桑黃種子液，培養(yǎng)溫度25°C，轉(zhuǎn)速180rpm/min，每 24h取樣，3500rpm離心10min。用蒸餾水洗滌菌絲體3次，烘干至恒重，240小時(shí)菌體干 重達(dá)到20.63 g/l。上清液濃縮，按體積比l: 4的比例加入酒精，4'C冰箱過夜，離心沉淀， 用1: 4的酒精清洗3次，溶于水用苯酚硫酸法測(cè)多糖含量，240小時(shí)測(cè)定多糖含量為 0.141g/l。
權(quán)利要求
1.一種用于桑黃菌液體培養(yǎng)的合成培養(yǎng)基，所述合成培養(yǎng)基中以葡萄糖為碳源，20種氨基酸為氮源，以及無機(jī)鹽和維生素組成，碳氮比按50∶1設(shè)計(jì)，具體濃度g/L如下葡萄糖30～80g，谷氨酸0.1～1.5g，谷氨酰胺0.1～1.5g，天冬氨酸0.1～1.5g，天冬酰胺0.1～1.5g谷氨酸0.01～0.1g，色氨酸0.01～0.1g，纈氨酸0.01～0.1g，丙氨酸0.01～0.1g，亮氨酸0.01～0.1g，異亮氨酸0.01～0.1g，苯丙氨酸0.001～0.1g，蛋氨酸0.01～0.1g，脯氨酸0.01～0.1g，甘氨酸0.01～0.1g，絲氨酸0.01～0.1g，賴氨酸0.01～0.1g，半胱氨酸0.01～0.1g，酪氨酸0.01～0.1g，精氨酸0.01～0.1g，組氨酸0.01～0.1g，MgSO40.5～2g，KH2PO40.5～2g，NaCl0.3～1.5g，F(xiàn)eSO40.01～0.15g，MnSO4 7H2O0.01～0.07g，ZnSO4.7H2O 0.01～0.1g，CoCl20.0001～0.05g，CuSO40.0001～0.03g，CaCl20.05～0.5g，VB150～500ug，H2O 1.0L；培養(yǎng)基初始pH控制在5.5～7.5，滅菌溫度115～121℃，滅菌時(shí)間30min。
2、 利用權(quán)利要求1所述的合成培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)桑黃菌絲體和桑黃多糖的發(fā)酵工 藝，過程如下接種桑黃種子液，接種量V/V5 15y。，培養(yǎng)溫度24 28'C，往復(fù)式搖床轉(zhuǎn) 數(shù)160 220rpm，間隔24h取樣，3500rpm離心10min;用蒸餾水洗滌離心沉淀3次，獲的菌絲體；上清液濃縮至原體積的三分之一后，按體積比l: 4的比例加入酒精，4'C冰箱過 夜，離心沉淀，用體積比l: 4的酒精清洗沉淀3次后，溶于水用苯酚硫酸法測(cè)多糖含量。
全文摘要
本發(fā)明提出一種用于桑黃菌液體培養(yǎng)的合成培養(yǎng)基，所述合成培養(yǎng)基中以葡萄糖為碳源，20種氨基酸為氮源，以及無機(jī)鹽和維生素組成，碳氮比按50∶1設(shè)計(jì)，具體濃度g/L如下葡萄糖30～80g，谷氨酸0.1～1.5g，谷氨酰胺0.1～1.5g，天冬氨酸0.1～1.5g，天冬酰胺0.1～1.5g，谷氨酸0.01～0.1g，色氨酸0.01～0.1g，纈氨酸0.01～0.1g，丙氨酸0.01～0.1g等。本全合成培養(yǎng)基培養(yǎng)過程桑黃菌絲生長(zhǎng)迅速，桑黃菌絲體產(chǎn)量最高可達(dá)20g/L，同時(shí)不引入農(nóng)副產(chǎn)品為碳氮源，不夾帶培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)、培養(yǎng)基成分等物質(zhì)，發(fā)酵生產(chǎn)的桑黃胞外多糖純度高、質(zhì)量穩(wěn)定，桑黃多糖產(chǎn)量最高為0.198g/L。本發(fā)明具有成分清晰、質(zhì)量穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，可用于桑黃菌液體大規(guī)模培養(yǎng)和多糖合成代謝調(diào)控規(guī)律研究。
文檔編號(hào)C12P1/02GK101348803SQ20081007022
公開日2009年1月21日 申請(qǐng)日期2008年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月3日
發(fā)明者敏 孫, 祥 鄒, 霞 郭 申請(qǐng)人:西南大學(xué)