專利名稱：一種腸道細菌培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)，特別涉及一種腸道細菌培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
在人體的腸道內(nèi)棲息著大約10"個約400 500種細菌，是人體細胞總數(shù)的 10 20倍。腸道內(nèi)的細菌對人體腸道的生長發(fā)育、免疫功能、消化吸收等功能 起著重要的作用。為了更好的研究腸道正常菌群的功能以及與機體的相互關(guān)系， 對腸道內(nèi)細菌的分離、鑒定和定量非常重要。到目前為止，人們對腸道正常菌 群的了解是通過對糞便標本選擇性培養(yǎng)計數(shù)菌落數(shù)而獲得的。隨著分子生物學(xué) 的發(fā)展以及分子生物學(xué)技術(shù)在微生態(tài)領(lǐng)域的應(yīng)用，人們對微生態(tài)學(xué)的研究取得 了突破性的進展，如Suau A等用針對16SrRNA的細菌域通用引物采用PCR法對 糞便標本的DNA進行特異性擴增，得到284個平均長度500bp的16SrDNA片段， 對這些片段進行測序和種系分析發(fā)現(xiàn)284個16SrDNA片段對應(yīng)于82個分子菌種 (1);變性梯度凝膠電泳(DGGE)是一個遺傳指紋技術(shù)，根據(jù)PCR擴增16SrDNA 片段的電泳，它能檢測微生物的多樣性。但這些技術(shù)有明顯的不足，它們僅僅 只提供樣本中的細菌種類和數(shù)量，而對于每一細菌的特性，如生化特性、代謝 特性、遺傳特性等則不能反映。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種腸道細菌培養(yǎng)方法， 取新鮮糞便放入加有玻璃珠的稀釋液A的試管中，在混勻器上混勻3分鐘以上， 按連續(xù)稀釋法，釋成10 —' 10 —8個稀釋度，將培養(yǎng)基平皿根據(jù)不同的涂布濃度 分區(qū)，取各相同量的以上稀釋后的混合液分別加到分區(qū)中，涂布均勻，平板于 恒溫箱37'C孵育培養(yǎng)。
所述的細菌為腸道需氧菌或腸道厭氧菌；腸道需氧菌為大腸埃希菌、腸球 菌或酵母菌，腸道厭氧菌為雙岐桿菌、乳桿菌、類桿菌或總厭氧菌。
所述的細菌為腸道需氧菌，所用平板置于有氧條件下，于恒溫箱37'C孵育培養(yǎng)22 24小時；腸道厭氧菌所用平板放入?yún)捬鹾谢蚴痔讌捬跸鋬?nèi)，于恒溫箱 37"C孵育培養(yǎng)72小時。
留取觀察對象新鮮糞便標本2 5g，于0. 5小時內(nèi)送檢，稱取0. 5克糞便 樣本放入加有玻璃珠的9mL稀釋液A的試管中，在混勻器上混勻至少3分鐘， 按連續(xù)稀釋法，釋成10 —' 10 —8個稀釋度，將培養(yǎng)基平皿根據(jù)不同的涂布濃度 分區(qū)，取各50uL的以上稀釋后的混合液分別加到分區(qū)中，涂布均勻，平板于 恒溫箱37"C孵育培養(yǎng)。
所述的細菌為大腸埃希菌，所用培養(yǎng)基為伊紅美蘭培養(yǎng)基。
一種所述培養(yǎng)基的制備方法，所述培養(yǎng)基為腸球菌培養(yǎng)基，取胰胨2g，酵 母粉O. 375g，葡萄糖O. 2g， Na2HP040 . 4g， NaH2PO40. 4g，瓊脂0. 4g，加水100mL， 用1MNaOH調(diào)pH值至7. 4， 121。C高壓15分鐘，冷卻至55°C，加入疊氮鈉40mg， 2, 3， 5 —氯化三苯基四氮唑10mg。
一種所述的培養(yǎng)基的制備方法，所述培養(yǎng)基為雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基，取 胰蛋白胨IO g，植質(zhì)蛋白胨5 g，酵母粉2.5 g，吐溫-80 1 mL，葡萄糖5 g， 鹽酸半胱氨酸0. 5 g， K2HP04 2 g， MgCl. 7H20 0 . 5 g， ZnS04. 7H20 0 . 25 g， CaCl2 0.15 g， FeCl3微量，瓊脂12 g，加入IL ddH20，調(diào)pH至6. 5， 121。C高壓15 分鐘。
一種所述的培養(yǎng)基的制備方法，所述培養(yǎng)基為乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基，取 MRS 62g，鹽酸半胱氨酸0. 5 g，亮綠0. 1 g，加入1L ddH20，用2. 5 M HCL調(diào) pH至5.0， 12rC高壓15分鐘，冷卻至55。C，萬古霉素濃度至20 mg/L，混勻 后倒平板。
一種所述的培養(yǎng)基的制備方法，所述培養(yǎng)基類桿菌選擇性培養(yǎng)基，在lOOmL EG培養(yǎng)基中，加入已用滅菌水溶解的?；前匪酧. lg、新霉素20mg、亮綠20mg， 再用10。/。NaOH調(diào)至澄清，12rC高壓15分鐘，冷卻至55。C，加入5 8%的羊血。
一種所述的培養(yǎng)基的制備方法，所述培養(yǎng)基為總厭氧菌選擇性培養(yǎng)基，牛 肉粉2.4g，胰胨10g，酵母粉5g，已用0.訓(xùn)CL溶解過的胱氨酸0. 2g，Na異4g， 葡萄糖1. 5g，鹽酸半胱氨酸0. 5 g，可溶性淀粉1. 5g，瓊脂12g，加入1000mL 水，用NaOH調(diào)pH至7.8， 121。C高壓15分鐘，冷卻至55。C，加入5 腦的羊 血。
本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明的方法較為直觀地反映標本中細菌的種類和數(shù)量，且對培養(yǎng)的細菌可以作進一步的研究和分析，生化特性、代謝特性、 遺傳特性等。目前，雖然分子生物學(xué)技術(shù)可以快速鑒定厭氧菌，但此類技術(shù)主
要依據(jù)細菌的RNA或DNA來鑒定，并不能區(qū)分活菌或死菌，也不能反映出細菌的 生理狀態(tài)。如在我們實驗室建立的雙歧桿菌凍干保存技術(shù)就要以厭氧菌培養(yǎng)技 術(shù)為基礎(chǔ)的，先用選擇性培養(yǎng)基將雙歧桿菌培養(yǎng)，分離出單個菌落后擴大培養(yǎng)， 再用凍干保存技術(shù)保存細菌。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖
與具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細描述
本技術(shù)采用連續(xù)稀釋法，即留取觀察對象新鮮糞便標本2 5g，于0.5小時 內(nèi)送檢。稱取0.5克糞便樣本放入加有玻璃珠的9mL稀釋A液的試管中，在混勻器 上混勻至少3分鐘，按連續(xù)稀釋法，釋成10 —1 10 —s個稀釋度。根據(jù)不同細菌的 正常菌數(shù)范圍，選擇不同的稀釋度進行培養(yǎng)。根據(jù)不同細菌的正常菌數(shù)范圍， 選擇不同的培養(yǎng)基進行分區(qū)培養(yǎng)。將培養(yǎng)基平皿根據(jù)不同的涂布濃度分區(qū)，取 各50uL的以上稀釋后的混合液分別加到分區(qū)中，涂布均勻；需氧平板置于有氧 條件下，于恒溫箱37。C孵育培養(yǎng)24小時后觀察結(jié)果。厭氧菌所用平板放入?yún)捬?盒內(nèi)，于恒溫箱37"孵育培養(yǎng)72小時后，計數(shù)培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)。用對數(shù) 值表示其優(yōu)勢菌數(shù)量(LogN /g濕便)。需氧菌包括腸道桿菌、腸球菌和酵母菌； 腸道厭氧菌包括雙岐桿菌、乳桿菌、類桿菌和總厭氧菌。 一、各細菌的培養(yǎng)基配方
1) 大腸埃希菌 用伊紅一美蘭培養(yǎng)基，市售成品商品。
2) 腸球菌培養(yǎng)基(即表1中的EC培養(yǎng)基)
在lOOmL中，胰胨2g，酵母粉0. 375g，葡萄糖0. 2g， Na2HP040. 4g， NaH2P040 . 4g， 瓊脂0.4g,加水100mL，用1M NaOH調(diào)pH值至7. 4， 121。C高壓15分鐘，冷 卻至55。C，加入疊氮鈉40mg， 2,3，5 —氯化三苯基四氮唑10mg。
3) 酵母菌培養(yǎng)基
用酵母菌成品培養(yǎng)基，可以選用沙堡氏培養(yǎng)基。
4) 雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基(即表1中的TPY培養(yǎng)基)
在1000mL中，胰蛋白胨10 g，植質(zhì)蛋白胨5 g，酵母粉2. 5 g，吐溫-80 1 mL，葡萄糖5 g，鹽酸半胱氨酸0. 5 g， K2HP04 2 g， MgCl. 7H20 0. 5 g， ZnS04. 7H200.25 g， CaCl2 0.15 g， FeCl3微量，瓊脂12 g，加入1L ddH20，調(diào)pH至6. 5， 121。C高壓15分鐘。
5) 乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基(即表1中的LBS培養(yǎng)基)
在1000mL中，MRS(BR0TH) 62g，鹽酸半胱氨酸0.5 g，亮綠0. 1 g，上加 入IL ddH20,用2.5 MHCL調(diào)pH至5.0， 121。C高壓15分鐘，冷卻至55。C， 萬古霉素濃度至20 mg/L，混勻后倒平板。
6) 總厭氧菌非選擇性培養(yǎng)基(即表1中的EG培養(yǎng)基)
在1000mL中，牛肉粉2. 4g，胰胨10g，酵母粉5g，胱氨酸0. 2g(先用0. 1MHCL 溶解)，Na2HP044g，葡萄糖L5g，鹽酸半胱氨酸0.5 g，可溶性淀粉1. 5g，瓊 脂12g，加入1000mL水，用NaOH調(diào)pH至7, 8， 121。C高壓15分鐘，冷卻至 55°C，加入5 8%的羊血。
7) 類桿菌選擇性培養(yǎng)基(即表1中的NBGT培養(yǎng)基) 在EG培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上(每100mL)，加入?；前匪酧. lg，新霉素20mg，亮
綠20mg， 10y。NaOH適量(在EC加血之前，先用滅菌水溶解?；前匪帷⒘辆G和新 霉素，此時液體為混濁，用NaOH調(diào)至澄清)，121。C高壓15分鐘，冷卻至55 。C，加入5 8%的羊血。
8) 稀釋液A
在誦mL中，加入KH2P044.5g， Na2HP046g，鹽酸半胱氨酸0. 5 g，吐溫-80 0.5 g，瓊脂lg，加入1000mL水，將混合液煮沸，按每支試管9mL分裝(每8 支試管中，有一支加入IO粒左右的琉璃珠)，在分裝后，用氮氣將試管的空氣 部分替換，加上塞子，12rC高壓15分鐘。
二、各細菌的菌落形態(tài)及細菌鏡下形態(tài)如下表l。
細菌名生長的涂布濃度菌落形態(tài)耐氧革蘭染色及形態(tài)
稱培養(yǎng)基(注3)試驗
腸桿菌伊紅_101、10_菌落邊緣整齊，表ND(注1)G —呈直粗桿菌、短
科細菌美蘭培3、 10- 5面有光澤、濕潤、到中等長度、端呈
養(yǎng)基10-7光滑、呈灰色圓形
腸球菌EC培IO1、10_菌落呈圓形、NDG +呈球形，單個或
屬細菌養(yǎng)基3、 10- 5隆起、中心顯紅色，排列成對，短鏈10-fi直徑l 2mm
酵母菌沙堡氏10-110 —菌落呈奶油色、光NDG +著色不均，圓形
培養(yǎng)基3 i n10 -6-5滑，直徑2 3mm或卵圓形
雙歧桿TPY培丄U 10-110 —菌落呈圓形、光滑、p (注2)G'菌體著色不均
菌屬細養(yǎng)基310_ 5不透明、直徑在勻，形態(tài)具多形性，
菌100. 5 1. 5隱呈直、彎、分叉、
棒狀或V、 Y字排
歹lj，無鞭毛、芽胞、
莢膜
乳酸桿LBS培10-110 —菌落呈圓形、凸起、PG +菌體呈桿狀，無
菌屬細養(yǎng)基310-5表面較為粗糙、不鞭毛、芽胞、莢膜
菌10-7透明、顏色較藍，
直徑在0. 5 1. 5mm
類桿菌NBGT10-110 —形成圓形、微凸、PG —菌體中等大小
屬細菌培養(yǎng)基10-5、光滑、邊緣整齊、0. 5 lum，染色不
10-8半透明、灰白色，均，兩端較為濃染，
不溶血中部則較淺
總厭氧EG 培10- 110 —多種形態(tài)P多種形態(tài)
菌養(yǎng)基310-。、
10-8
注l:由于是需氧菌培養(yǎng)，所以無需做耐氧試驗
注2: P表示耐氧試驗陽性，即細菌未見有生長
注3:由于不同的標本中細菌的含量有很大的差別，因此要求每一種培養(yǎng)基中有 不同的且成系列的涂布濃度，以便計數(shù)得到更為可靠的數(shù)據(jù)。 三、具體實例
腸道細菌培養(yǎng)方法留取觀察對象新鮮糞便標本2 5g，于0.5小時內(nèi)送
檢。稱取0. 5克糞便樣本放入加有玻璃珠的9mL稀釋A液的試管中(記作10 —"， 在混勻器上混勻至少3分鐘，用滅菌的移液管取lmL上已混勻液加到另一未加 玻璃珠的9mL稀釋A液的試管中(記作10 —2)，在混勻器上混勻，用此法連續(xù)稀 釋至濃度為IO 8。將各培養(yǎng)基平皿作四區(qū)標志，按上表中的涂布濃度，取各50yL的稀釋后的混合液分別加到四區(qū)中，用涂布棒將混合液在各自的區(qū)內(nèi)涂布 均勻。
把伊紅一美藍平皿、EC平皿和酵母菌平皿于恒溫箱37。C孵育培養(yǎng)24小時 后觀察結(jié)果。計數(shù)時，挑取典型細菌菌落，作下菌落形態(tài)的文字描述記錄，同 時將細菌作革蘭染色并鏡檢，觀察和記錄革蘭染色結(jié)果，結(jié)合上兩步驟，記錄 各種培養(yǎng)基中細菌的數(shù)量，如在濃度為10 —7的區(qū)域內(nèi)計數(shù)所得57個菌落即記作 57X107。
將TPY、 LBS、 NBGT和EG平皿放入?yún)捬鹾袃?nèi)，于恒溫箱37'C孵育培養(yǎng)72 小時后觀察結(jié)果。計數(shù)時，挑取典型細菌菌落，作下菌落形態(tài)的文字描述記錄， 同時將細菌作革蘭染色并鏡檢，觀察和記錄革蘭染色結(jié)果。同時對所選菌落作 耐氧試驗(即將細菌用接種針挑取后劃到血平皿上，于恒溫箱37。C孵育培養(yǎng)24 小時后觀察結(jié)果，如有菌生長則為耐氧試驗陰性，反之則陽性)，結(jié)合上三步驟， 記錄各種培養(yǎng)基中細菌的數(shù)量，如在濃度為10 —7的區(qū)域內(nèi)計數(shù)所得57個菌落即 記作57X10:
菌數(shù)量(LogM/g濕便)，M二20XNX107m (CFU/g)
N為最小稀釋濃度的菌落數(shù)
n為最小稀釋濃度指數(shù)的絕對值
m為標本稱重的質(zhì)量
例如上在濃度為10 —7的區(qū)域內(nèi)計數(shù)所得57個菌落即記作57X10 — 7，原標 本的稱量為0. 5g， M=20X 57X1070. 5 (CFU/g) =22. 8X 109，那么該細菌在 標本中的菌數(shù)量(LogM/g濕便)為Log (22.8X 109) /g，即10. 358。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的具體實施例子。顯然， 本發(fā)明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從 本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范 圍。
權(quán)利要求
1、一種腸道細菌培養(yǎng)方法，其特征在于取新鮮糞便放入加有玻璃珠的稀釋液A的試管中，在混勻器上混勻3分鐘以上，按連續(xù)稀釋法，釋成10-1～10-8個稀釋度，將培養(yǎng)基平皿根據(jù)不同的涂布濃度分區(qū)，取各相同量的以上稀釋后的混合液分別加到分區(qū)中，涂布均勻，平板于恒溫箱37℃孵育培養(yǎng)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道細菌培養(yǎng)方法，其特征在于所述的細菌為腸 道需氧菌或腸道厭氧菌；腸道需氧菌為大腸埃希菌、腸球菌或酵母菌，腸道厭氧 菌為雙岐桿菌、乳桿菌、類桿菌或總厭氧菌。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腸道細菌培養(yǎng)方法，其特征在于所述的細菌 為腸道需氧菌，所用平板置于有氧條件下，于恒溫箱37'C孵育培養(yǎng)22 24小時； 腸道厭氧菌所用平板放入?yún)捬鹾谢蚴痔讌捬跸鋬?nèi)，于恒溫箱37"C孵育培養(yǎng)72小 時。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸道細菌培養(yǎng)方法，其特征在于留取觀察對象新鮮糞便標本2 5g，于0. 5小時內(nèi)送檢，稱取0. 5克糞便樣本放入加有玻璃珠的 9mL稀釋液A的試管中，在混勻器上混勻至少3分鐘，按連續(xù)稀釋法，釋成10 —' 10 —8個稀釋度，將培養(yǎng)基平皿根據(jù)不同的涂布濃度分區(qū)，取各50yL的以上稀釋 后的混合液分別加到分區(qū)中，涂布均勻，平板于恒溫箱37'C孵育培養(yǎng)。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的腸道細菌培養(yǎng)方法，其特征在于所述的細菌 為大腸埃希菌，所用培養(yǎng)基為伊紅美蘭培養(yǎng)基。
6、 一種權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為腸球 菌培養(yǎng)基，取胰胨2g，酵母粉0.375g，葡萄糖0.2g， Na2HP040.4g， NaH2P040.4g， 瓊脂O. 4g，加水100mL，用1M NaOH調(diào)pH值至7. 4， 121。C高壓15分鐘，冷卻至 55°C，加入疊氮鈉40mg， 2，3，5 —氯化三苯基四氮唑10mg。
7、 一種權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為雙 歧桿菌選擇性培養(yǎng)基，取胰蛋白胨10 g，植質(zhì)蛋白胨5 g,酵母粉2.5 g，吐溫 -80 1 mL，葡萄糖5 g，鹽酸半胱氨酸 . 5 g， K2HP04 2 g， MgCl. 7H20 0. 5 g， ZnS04. 7H20 0.25 g， CaCl2 0.15 g， FeCl3微量，瓊脂12 g，加入1L ddH20，調(diào)pH至6. 5， 121。C高壓15分鐘。
8、 一種權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為乳 酸桿菌選擇性培養(yǎng)基，取MRS 62g，鹽酸半胱氨酸0. 5 g，亮綠0. 1 g，加入1L ddH20，用2. 5 M HCL調(diào)pH至5. 0, 121。C高壓15分鐘，冷卻至55'C，萬古霉素濃度至 20 mg/L，混勻后倒平板。
9、 一種權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)基類桿 菌選擇性培養(yǎng)基，在100mL EG培養(yǎng)基中，加入已用滅菌水溶解的牛磺胺酸O. lg、 新霉素20mg、亮綠20mg，再用10%NaOH調(diào)至澄清，121。C高壓15分鐘，冷卻至 55°C，加入5 8。/。的羊血。
10、 一種權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為 總厭氧菌選擇性培養(yǎng)基，牛肉粉2.4g，胰胨10g，酵母粉5g，已用0. 1M HCL溶 解過的胱氨酸0.2g， Na2HP044g，葡萄糖1. 5g，鹽酸半胱氨酸0. 5 g，可溶性淀粉 L5g，瓊脂12g，加入1000mL水，用NaOH調(diào)pH至7. 8， 121。C高壓15分鐘，冷 卻至55。C，加入5 8%的羊血。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種腸道細菌培養(yǎng)方法，取新鮮糞便放入加有玻璃珠的稀釋液A的試管中，在混勻器上混勻3分鐘以上，按連續(xù)稀釋法，釋成10^-1～10^-8個稀釋度，將培養(yǎng)基平皿根據(jù)不同的涂布濃度分區(qū)，取各相同量的以上稀釋后的混合液分別加到分區(qū)中，涂布均勻，平板于恒溫箱37℃孵育培養(yǎng)。本發(fā)明的有益之處在于本發(fā)明的方法較為直觀地反映標本中細菌的種類和數(shù)量，且對培養(yǎng)的細菌可以作進一步的研究和分析，生化特性、代謝特性、遺傳特性等。
文檔編號C12Q1/10GK101440395SQ20081016305
公開日2009年5月27日 申請日期2008年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日
發(fā)明者吳仲文, 健 左, 徐凱進, 李蘭娟, 王建國, 肖黨生, 瑜 陳, 陳云波, 陳春雷 申請人:浙江大學(xué)