亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體及其應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及一種亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體，所述亞全能干細(xì)胞呈Flk1陽(yáng)性，在體外具有誘導(dǎo)分化成三胚層來(lái)源的組織細(xì)胞的能力，所述外來(lái)體特異性表達(dá)下述microRNA：hsa-miR-3191-5p、hsa-miR-4711-3p和hsa-miR-1273a，優(yōu)選地，其還特異性表達(dá)下述microRNA：hsa-miR-3142、hsa-miR-4456和hsa-miR-4714-5p。本發(fā)明的外來(lái)體具有多種生理活性，具有廣泛的用途。
【專利說(shuō)明】亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞是一種具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞。根據(jù)這一定義，在個(gè)體發(fā)育的不同階段以及成體的不同組織中均存在著干細(xì)胞。根據(jù)分化潛能的不同，干細(xì)胞可分為全能干細(xì)胞(totipotent stem cell)、三胚層多潛能干細(xì)胞(pluripotent stem cell)、單胚層多能干細(xì)胞(multipotent stem cell)和單能干細(xì)胞(unipotent stem cell)。本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中也有亞全能干細(xì)胞的概念，認(rèn)為在胚胎發(fā)育過(guò)程中會(huì)有亞全能干細(xì)胞存留在人體多種組織中，其分化潛能僅次于全能干細(xì)胞，是一種原始干細(xì)胞亞群，處于干細(xì)胞等級(jí)結(jié)構(gòu)的最上層。通過(guò)一系列的探索，人們已經(jīng)從骨髓和脂肪組織中獲得了亞全能干細(xì)胞，并對(duì)它的表型和生物學(xué)功能進(jìn)行了鑒定。亞全能干細(xì)胞的特征在于其具有上皮樣形態(tài)、Flkl+表型、無(wú)成瘤性且單克隆來(lái)源的該細(xì)胞在體外具有誘導(dǎo)分化成三胚層來(lái)源的組織細(xì)胞的能力。
[0003]Exosomes (外來(lái)體)是一類起源于內(nèi)吞體系統(tǒng)并被排出細(xì)胞外、直徑在40~IOOnm之間的雙層膜性囊泡(I)。外來(lái)體可以由多種細(xì)胞包括樹突狀細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等分泌(2，3)。外來(lái)體含有大量與其來(lái)源和功能密切相關(guān)的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)成分，作為細(xì)胞間傳遞信息的重要載體，參與多種病理生理過(guò)程，但大多數(shù)研究集中在免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞釋放的外來(lái)體。近年來(lái),干細(xì)胞中的外來(lái)體也逐漸引起了人們的關(guān)注。
[0004]本發(fā)明擬研究上述亞全能干細(xì)胞中是否也有外來(lái)體的產(chǎn)生及如果有外來(lái)體產(chǎn)生，其特殊的性質(zhì)及用途。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005]因此本發(fā)明的技術(shù)目的在于探究亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體及其性質(zhì)和用途。
[0006]因此，本發(fā)明的第一方面涉及一種亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體，所述亞全能干細(xì)胞呈Flkl陽(yáng)性，在體外具有誘導(dǎo)分化成三胚層來(lái)源的組織細(xì)胞的能力。
[0007]優(yōu)選地，所述外來(lái)體特異性表達(dá)下述microRNA:hsa-miR-3191_5p、hsa-miR-471 l-3p和hsa_miR-1273a,優(yōu)選地，其還特異性表達(dá)下述microRNA:hsa-miR-3142、hsa-miR-4456 和 hsa-miR-4714_5p。
[0008]優(yōu)選地，所述亞全能干細(xì)胞的獲取步驟如下:
[0009]A)常規(guī)方法分離aMSC或bMSC或其他組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，
[0010]B)以I個(gè)細(xì)胞/孔的密度將aMSC或bMSC或其他組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞接種于96孔板中，待長(zhǎng)出單克隆后，將這些單克隆進(jìn)一步擴(kuò)增，
[0011]C)將單克隆進(jìn)一步擴(kuò)增后的細(xì)胞作為種子細(xì)胞，4_6h細(xì)胞完全貼壁后加入I號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)I天后，更換2號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4天，獲得亞全能干細(xì)胞，即Flkl陽(yáng)性的MSC，所述I號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含l-100ng/ml活化素A+l_500ng/ml Wnt3a+0.1-20%FBS+HG_DMEM，優(yōu)選地，5_50ng/ml 活化素 A，更優(yōu)選地，10_30ng/ml 活化素 A ;優(yōu)選地，50-300ng/ml Wnt3a,更優(yōu)選地，100-300ng/ml Wnt3a ；優(yōu)選地，2-10%FBS,更優(yōu)選地，5-8%FBS,所述2號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含l-100ng/ml活化素A+1-500 μ MRA+0.1-50%FBS+HG-DMEM, 5-50ng/ml 活化素 A，更優(yōu)選地，10-30ng/ml 活化素 A ;優(yōu)選地，20-400 μ M RA，更優(yōu)選地，50-200 μ M RA，將獲得的具有上皮樣形態(tài)的亞全能干細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光染色檢測(cè)和Western Blot檢測(cè)，其中所述免疫細(xì)胞熒光染色檢測(cè)的指標(biāo)包括 Foxa2、Soxl7、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Soxl、Pax6,所述 Western Blot 檢測(cè)的指標(biāo)包括Foxa2、Soxl7、T、Gsc、Epcam、Vimatin,檢測(cè)獲得的干細(xì)胞是否具有三胚層分化潛能重要基因表型標(biāo)志，即限定性的內(nèi)胚層:Foxa2、Soxl7 ;中內(nèi)胚層:Gsc、T、Eomes ;中胚層:Kdr、Tbx6 ;外胚層:S0Xl、PaX6，并且具有較高的誘導(dǎo)效率，F(xiàn)OXa2、SOX17陽(yáng)性的限定性內(nèi)胚層細(xì)胞效率達(dá)到90%以上。
[0012]優(yōu)選地，所述外來(lái)體通過(guò)如下步驟獲得:
[0013]A)收集亞全能干細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)的上清液，
[0014]B)用差速離心法提取外來(lái)體，細(xì)胞培養(yǎng)上清液1，OOOXg，離心10min ;取上清，10，OOOXg離心10min ;取上清液，將30%蔗糖/重水墊、上清液及PBS依次放入離心管中，100，000 X g，離心Ih ;取混有外來(lái)體的蔗糖/重水墊，用PBS懸浮，加入到IOOkD超濾離心管中，重復(fù)3次，濃縮液即為P-外來(lái)體，
[0015]C)用0.22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌，放入_80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0016]優(yōu)選地，所述亞全能干細(xì)胞的來(lái)源為脂肪組織或骨髓組織。
[0017]本發(fā)明的第二 方面涉及一種含有上述第一方面所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體的組合物。
[0018]本發(fā)明的第三方面涉及一種制備上述第一方面所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體的方法，其包括下述步驟:
[0019]A)常規(guī)方法分離aMSC或bMSC或其他組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，
[0020]B)以I個(gè)細(xì)胞/孔的密度將aMSC或bMSC或其他組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞接種于96孔板中，待長(zhǎng)出單克隆后，將這些單克隆進(jìn)一步擴(kuò)增，
[0021]C)將單克隆進(jìn)一步擴(kuò)增后的細(xì)胞作為種子細(xì)胞，4_6h細(xì)胞完全貼壁后加入I號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)I天后，更換2號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4天，獲得亞全能干細(xì)胞，即Flkl陽(yáng)性的MSC，所述I號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含l-100ng/ml活化素A+l_500ng/ml Wnt3a+0.1-20%FBS+HG_DMEM，優(yōu)選地，5_50ng/ml 活化素 A，更優(yōu)選地，10_30ng/ml 活化素 A ;優(yōu)選地，50-300ng/ml Wnt3a,更優(yōu)選地，100-300ng/ml Wnt3a ；優(yōu)選地，2-10%FBS,更優(yōu)選地，5-8%FBS,所述2號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含l-100ng/ml活化素A+1-500 μ MRA+0.1-50%FBS+HG-DMEM, 5-50ng/ml 活化素 A，更優(yōu)選地，10-30ng/ml 活化素 A ;優(yōu)選地，20-400 μ M RA，更優(yōu)選地，50-200 μ M RA，將獲得的具有上皮樣形態(tài)的亞全能干細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光染色檢測(cè)和Western Blot檢測(cè)，其中所述免疫細(xì)胞熒光染色檢測(cè)的指標(biāo)包括 Foxa2、Soxl7、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Soxl、Pax6,所述 Western Blot 檢測(cè)的指標(biāo)包括Foxa2、Soxl7、T、Gsc 、Epcam、Vimatin,檢測(cè)獲得的干細(xì)胞是否具有三胚層分化潛能重要基因表型標(biāo)志，即限定性的內(nèi)胚層:Foxa2、Soxl7 ;中內(nèi)胚層:Gsc、T、Eomes ;中胚層:Kdr、Tbx6 ;外胚層:S0Xl、PaX6，并且具有較高的誘導(dǎo)效率，F(xiàn)OXa2、SOX17陽(yáng)性的限定性內(nèi)胚層細(xì)胞效率達(dá)到90%以上，
[0022]D)收集亞全能干細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)的上清液，
[0023]E)用差速離心法提取外來(lái)體，細(xì)胞培養(yǎng)上清液1，000Xg，離心10min ;取上清，10，OOOXg離心10min ;取上清液，將30%蔗糖/重水墊、上清液及PBS依次放入離心管中，100，000 X g，離心Ih ;取混有外來(lái)體的蔗糖/重水墊，用PBS懸浮，加入到IOOkD超濾離心管中，重復(fù)3次，濃縮液即為P-外來(lái)體，
[0024]F)用0.22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌，放入_80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0025]本發(fā)明的第四方面涉及一種根據(jù)上述第一方面所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體在制備促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移和短期歸巢能力的藥物中的用途。
[0026]本發(fā)明的第五方面涉及一種根據(jù)上述第一方面所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體在制備促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中NO釋放的藥物中的用途。
[0027]本發(fā)明的第六方面涉及一種根據(jù)上述第一方面所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體在制備抑制T細(xì)胞的增殖、下調(diào)ThO向Th2的分化的藥物中的用途。
[0028]本發(fā)明的第七方面涉及一種根據(jù)上述第一方面所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體在制備抑制腎臟來(lái)源細(xì)胞凋亡的藥物中的用途。
[0029]本發(fā)明的第八方面涉及一種根據(jù)上述第一方面所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體在制備抑制肝星狀細(xì)胞的藥物中的用途。
[0030]本發(fā)明的第九方面涉及一種根據(jù)上述第一方面所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體在制備減少谷氨酸誘導(dǎo)的`神經(jīng)細(xì)胞凋亡的藥物中的用途。
[0031]換言之，本發(fā)明利用亞全能干細(xì)胞分離出一種新的外來(lái)體，并將其命名為P-外來(lái)體，它可以參與多種生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)，包括促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞等。這種P-外來(lái)體中含有多種重要的microRNA，可以通過(guò)在亞全能干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)相應(yīng)的microRNA來(lái)提高P-外來(lái)體中該種特定microRNA的表達(dá)量，將這種特異表達(dá)某種microRNA的P-外來(lái)體作為載體來(lái)應(yīng)用。
[0032]本發(fā)明所用的亞全能干細(xì)胞的生物學(xué)特征為具有上皮樣形態(tài)和三胚層分化，包括成脂、成骨、造血、胰腺和神經(jīng)分化的能力。
[0033]本發(fā)明的P-外來(lái)體的功能詳述如下:
[0034]I)能促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移和短期歸巢能力
[0035]間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有廣泛應(yīng)用潛能的成體干細(xì)胞。P-外來(lái)體可以促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移和短期歸巢能力。P-外來(lái)體短時(shí)間(24-48hr)內(nèi)刺激間充質(zhì)干細(xì)胞后，間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)(圖2)，把P-外來(lái)體刺激后的間充質(zhì)干細(xì)胞移植到經(jīng)亞致死量照射的N0D/SCID小鼠體內(nèi)，發(fā)生骨髓歸巢的細(xì)胞數(shù)目是未經(jīng)處理的對(duì)照組的1.6倍。由于間充質(zhì)干細(xì)胞要在病變部位才能發(fā)揮作用，因此首先要能到達(dá)病變部位，因此其遷移和歸巢能力至關(guān)重要。P-外來(lái)體能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移和短期歸巢能力，因此可以與間充質(zhì)干細(xì)胞共同使用，增加間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效果。
[0036]2)參與調(diào)節(jié)免疫
[0037]P-外來(lái)體可以抑制T細(xì)胞的增殖，下調(diào)ThO向Th2的分化，從而使Thl細(xì)胞的比例上調(diào)，進(jìn)而扭轉(zhuǎn)了 Thl細(xì)胞和Th2細(xì)胞的比例失衡而達(dá)到新的平衡點(diǎn)，因此對(duì)于移植物抗宿主病具有治療作用。[0038]3)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中NO的釋放
[0039]P-外來(lái)體可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中NO的釋放，而NO在維持血管張力的恒定和調(diào)節(jié)血壓的穩(wěn)定性中起著重要作用。
[0040]4)抑制腎臟來(lái)源細(xì)胞的凋亡
[0041]P-外來(lái)體可以抑制HK2腎小管上皮細(xì)胞或HEK294T人胚胎腎臟細(xì)胞凋亡，從而可以在一些腎損傷性疾病中起保護(hù)作用(圖3)
[0042]5)抑制肝星狀細(xì)胞增殖
[0043]P-外來(lái)體可以抑制肝星狀細(xì)胞增殖(圖4)。肝星狀細(xì)胞是肝臟的一種非實(shí)質(zhì)細(xì)胞。它們?cè)诶w維化進(jìn)程中起了重要的作用，它們導(dǎo)致了以I型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積(4，5)。因此P-外來(lái)體可以用于肝纖維化的治療中。
[0044]6)神經(jīng)保護(hù)作用
[0045]P-外來(lái)體能夠明顯減少谷氨酸損傷后神經(jīng)細(xì)胞PC12的凋亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用(圖 5)。
[0046]因此，本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體具有多種有利的生物活性，可以具有廣泛的用途。
[0047]同時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，盡管本發(fā)明公開的技術(shù)方案中對(duì)亞全能干細(xì)胞和其分泌的外來(lái)體的制備過(guò) 程進(jìn)行了限定，但這并非意味著本發(fā)明只能以所述限定的技術(shù)方案實(shí)施。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明宗旨的情況下對(duì)所述技術(shù)方案做出各種改變而仍能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，這樣的技術(shù)方案也包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0048]圖1:亞全能干細(xì)胞的三胚層分化能力，其中左側(cè)兩欄上部a_d圖顯示了亞全能干細(xì)胞的成骨分化，左側(cè)兩欄下部a-d圖顯示了亞全能干細(xì)胞的成脂分化，右側(cè)兩欄上部四圖顯示了亞全能干細(xì)胞的成胰腺細(xì)胞分化，右側(cè)兩欄下部四圖顯示了亞全能干細(xì)胞的成神經(jīng)分化。
[0049]圖2:間充質(zhì)干細(xì)胞在外來(lái)體處理后遷移能力增強(qiáng)。P-外來(lái)體刺激后，干細(xì)胞在24h、36h和48h的遷移能力均明顯增加。
[0050]圖3:P-外來(lái)體可以抑制HK2腎小管上皮細(xì)胞或HEK294T人胚胎腎臟細(xì)胞的凋亡。
[0051]圖4:P-外來(lái)體抑制肝星狀細(xì)胞系的增殖能力。將不同濃度的P-外來(lái)體與肝星狀細(xì)胞系分別進(jìn)行共培養(yǎng)后，肝星狀細(xì)胞系的增殖能力均相對(duì)于單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)下降，提示P-外來(lái)體對(duì)肝星狀細(xì)胞系的增殖影響是抑制性的作用。
[0052]圖5:P-外來(lái)體保護(hù)谷氨酸毒性損傷的神經(jīng)細(xì)胞系PC12細(xì)胞。應(yīng)用MTS法檢測(cè)谷氨酸損傷后不同處理組PC12細(xì)胞的存活率，結(jié)果顯示P-外來(lái)體對(duì)于谷氨酸誘導(dǎo)的PC 12細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。
【具體實(shí)施方式】
[0053]下面將通過(guò)下述非限制性實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，在不背離本發(fā)明精神的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出許多修改，這樣的修改也落入本發(fā)明的范圍。
[0054]下述實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法，所使用的實(shí)驗(yàn)材料如無(wú)特別說(shuō)明，均可容易地從商業(yè)公司獲取。本發(fā)明下述實(shí)施例中使用的各種抗體均來(lái)源于商業(yè)途徑的標(biāo)準(zhǔn)抗體。
[0055]實(shí)施例
[0056]實(shí)施例1亞全能干細(xì)胞的獲得及檢測(cè)
[0057]1.實(shí)驗(yàn)方法
[0058]實(shí)驗(yàn)標(biāo)本
[0059]成人脂肪樣品取自醫(yī)科院整形醫(yī)院，成人骨髓樣品取自解放軍307醫(yī)院。所有樣品均簽訂知情同意書。
[0060]成人脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞(aMSCs)的分離:成人脂肪組織取自吸脂手術(shù)患者(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形醫(yī)院)，與供者簽訂知情同意書，供者均為25~35歲的健康女性。脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法簡(jiǎn)述如下:
[0061]I)將采用吸脂術(shù)采集出來(lái)的脂肪組織用D-Hanks洗去血細(xì)胞和麻醉藥，0.2%11型膠原酶消化lh，然后用D-Hanks洗滌2遍以除去膠原酶；
[0062]2)離心收集細(xì)胞，細(xì)胞以2X IO6個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于含58%DMEM/F12+40%MCDB-201、2% 胎牛血清(FCS)、10ng/ml EGFUOng/ml PDGF、1X 胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium, ITS)、IX 亞油酸-牛血清白蛋白(Iinoleicacid-bovine serum albumin, LA_BSA)、50 μ M β 疏基乙醇、2mM L-谷氨酸胺、100 μ g/ml 青霉素和100U/ml硫酸鏈 霉素的培養(yǎng)液，37°C、5%C02、95%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
[0063]3) 2d后換液，棄去未貼壁的細(xì)胞，以后每3d半量換液；
[0064]4)當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%~80%匯合時(shí)，0.25%胰酶(Gibco公司)常規(guī)消化，細(xì)胞按照1:3進(jìn)行傳代。
[0065]成人骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞(bMSCs)的分離方法簡(jiǎn)述如下:
[0066]I)無(wú)菌采集健康志愿者的骨髓5-10ml于無(wú)菌的肝素管中；
[0067]2)取一無(wú)菌的離心管，用D-Hanks液適當(dāng)稀釋骨髓后計(jì)數(shù)，并調(diào)整骨髓細(xì)胞濃度至IO7個(gè)細(xì)胞/ml ；
[0068]3)取一新的離心管，分別加入恢復(fù)至室溫的Ficoll和上述骨髓細(xì)胞懸液，加入時(shí)仔細(xì)操作勿破壞界面，二者的比例為1:1;
[0069]4)將上述離心管重量配平后放入常溫臺(tái)式離心機(jī)中，20°C以l，800rpm的速度離心20min。取出離心管后，無(wú)菌操作條件下仔細(xì)吸取白膜層即獲得了單個(gè)核細(xì)胞，將單個(gè)核細(xì)胞用D-Hanks液洗滌兩次并計(jì)數(shù)；
[0070]5)將上述單個(gè)核細(xì)胞以I X IO6個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)體系均為含 58%DMEM/F12+40%MCDB-201、2% 胎牛血清(FCS)、10ng/ml EGF、10ng/mlPDGF>I X 膜島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸(Insulin-Transferrin-Selenium, ITS)、1X 亞油酸-牛血清白蛋白(linoleic acid-bovine serum albumin, LA-BSA)>50 μ M β 疏基乙醇、2mM L-谷氨酰胺、100 μ g/ml青霉素和100U/ml硫酸鏈霉素的培養(yǎng)液，37°C、5%C02、95%濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
[0071 ] 6)24hr后，去除懸浮細(xì)胞，補(bǔ)充培養(yǎng)基，細(xì)胞每隔3d換液一次，待細(xì)胞長(zhǎng)至70_80%匯合時(shí)，用0.05%胰蛋白酶-0.0P/oEDTA消化傳代。
[0072]2.亞全能干細(xì)胞的獲得[0073]以I個(gè)細(xì)胞/孔的密度將第三代脂肪或者骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞接種于96孔板中，待長(zhǎng)出單克隆后，將這些單克隆進(jìn)一步擴(kuò)增，將單克隆進(jìn)一步擴(kuò)增后的細(xì)胞作為種子細(xì)胞，4-6h細(xì)胞完全貼壁后加入I號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)Id后，更換2號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4d，獲得亞全能干細(xì)胞，即Flkl陽(yáng)性的MSC，所述I號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基是高糖DMEM(HG-DMEM)，其中包含20ng/ml活化素A+200ng/ml Wnt3a+6%FBS，所述2號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基也是高糖 DMEM (HG-DMEM)，其中包含 20ng/ml 活化素 Α+100 μ M RA+10%FBS。
[0074]3.亞全能干細(xì)胞的檢測(cè)
[0075]將獲得的具有上皮樣形態(tài)的亞全能干細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)的免疫細(xì)胞熒光染色檢測(cè)和Western Blot檢測(cè)，其中所述免疫細(xì)胞熒光染色檢測(cè)的指標(biāo)包括Foxa2、Soxl7、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Soxl、Pax6,所述 Western Blot 檢測(cè)的指標(biāo)包括 Foxa2、Soxl7、T、Gsc、Epcam、Vimatin。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)獲得的亞全能干細(xì)胞的表型,方法如下:
[0076]用間接免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞的免疫表型，針對(duì)細(xì)胞表面抗原，細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，用洗液(含0.5%BSA的PBS)沖洗，加入一抗4°C孵育30min。一抗為小鼠抗人的CD29、CD31、⑶34、⑶45、⑶44、⑶105、FlkUvWF或HLA-DR的單克隆抗體。用洗液洗兩次。為檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原，細(xì)胞與一抗孵育之前，用2%多聚甲醛4°C固定15min，并在室溫下用0.1%的皂角素透膜lh。本發(fā)明選用同種同型非相關(guān)IgG抗體作為陰性對(duì)照。用洗液洗過(guò)后，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗4°C孵育30min。細(xì)胞洗3次，并懸浮在300 μ L的PBS中，置于冰上待流式細(xì)胞儀檢測(cè)。本發(fā)明上述方法獲得的亞全能干細(xì)胞的典型指標(biāo)是Flkl+CD31TD34_。
[0077]實(shí)施例2亞全能干細(xì)胞的分化
[0078]對(duì)亞全能干細(xì)胞進(jìn)行向三胚層多譜系的誘導(dǎo)分化；神經(jīng)誘導(dǎo)分化:DMEM/F12(DF12)1:1基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入N2/B27、20ng/ml EGF和50ng/ml IGF-1，誘導(dǎo)兩周后加入30ng/ml NT3 和 10n g/ml bFGF，兩周后加入 30ng/ml NT3 和 10ng/ml BDNF再誘導(dǎo) 7d ;成脂分化:DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入10%FCS、I μ M地塞米松、0.5mM IBMX、ImM抗壞血酸誘導(dǎo)8d ;成骨分化:DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入10%FCS、IOmM β -甘油磷酸鈉、IOnM地塞米松和0.2mM抗壞血酸誘導(dǎo)8d;肝上皮誘導(dǎo)分化:基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入20ng/ml HGFUOng/ml FGF_4、20ng/mlEGF和2%FBS誘導(dǎo)3周；造血細(xì)胞誘導(dǎo)分化:基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入150ng/mL SCF和200ng/mL G-CSF誘導(dǎo)7d，收集細(xì)胞，接種在無(wú)血清甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含l%BSA、50ng/mLBMP-4、50ng/mL IL_6、50ng/mL SCF、50ng/mL Flt_3L、lOng/mL G-CSF、lOng/mL TP0U0μ g/mL ΕΡ0、200μ g/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、2mM L-谷氨酰胺、0.1mMβ巰基乙醇、1%非必需氨基酸，誘導(dǎo)9d，收集的細(xì)胞，洗去甲基纖維素，計(jì)數(shù)5000個(gè)細(xì)胞，重新接種在含血清的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中再誘導(dǎo)14d檢測(cè)獲得的干細(xì)胞是否具有三胚層分化潛能重要基因表型標(biāo)志，即限定性的內(nèi)胚層:Foxa2、Soxl7 ;中內(nèi)胚層:Gsc、T、Eomes ;中胚層:Kdr、Tbx6 ;外胚層:SoxU Pax6，并且具有較高的誘導(dǎo)效率，F(xiàn)oxa2、Soxl7陽(yáng)性的限定性內(nèi)胚層細(xì)胞效率達(dá)到90%以上。本發(fā)明所用的亞全能干細(xì)胞具備向三胚層多譜系的分化能力(圖1)。
[0079]實(shí)施例3亞全能干細(xì)胞中外來(lái)體的獲得
[0080]收集亞全能干細(xì)胞培養(yǎng)48hr后的上清液，用差速離心法提取外來(lái)體，簡(jiǎn)述如下:細(xì)胞培養(yǎng)上清液1，000 X g離心10min ;取上清，10，000 X g離心10min ;取上清液，將30%蔗糖/重水墊、上清液及PBS依次放入離心管中，100，000Xg離心Ih ;取混有外來(lái)體的蔗糖/重水墊，用PBS懸浮，加入到IOOkD超濾離心管中，重復(fù)3次，濃縮液即為外來(lái)體，本發(fā)明將其命名為P-外來(lái)體，用0.22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌，放入-80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> [0081]實(shí)施例4P-外來(lái)體的鑒定
[0082]提取P-外來(lái)體中的總RNA，變性瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA的完整性，獲得完整的總RNA。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為10%)分離總RNA中的microRNA。初步結(jié)果表明本發(fā)明所獲得的P-外來(lái)體除表達(dá)外來(lái)體通用的標(biāo)志物CD63、CD81外，其特征在于同時(shí)特異性表達(dá)hsa-miR-3191-5p、hsa-miR-471 l-3p和hsa_miR-1273a三種microRNA。另外在部分外來(lái)體中還發(fā)現(xiàn)同時(shí)特異性表達(dá)hsa-miR-3142、hsa-miR-4456和hsa-miR-4714-5p。本發(fā)明后續(xù)使用5’端32P標(biāo)記的特異性microRNA探針(序列分別為:hsa-miR-3191_5p 探針:5，uggaagguagucggccagagag3’ (SEQ ID NO:1)，hsa-miR-471l_3p 探針:5，aucaagccagaagacacg3’ (SEQ ID NO:2), hsa_miR-1273a探針:5，aagaaagagucuugcuuugucgccc3’ (SEQ ID NO:3), hsa-miR-3142 探針:5Jucugaagguucagaaaggccuu3J (SEQ ID NO:4),hsa-miR-4456 探針:5，aaaaggaagccaccagg3，(SEQ ID NO:5)和 hsa-miR-4714_5p 探針:5，aucaaccuaaggggucagaguu 3，(SEQIDNO:6))，通過(guò)放射自顯影方法觀察按本發(fā)明上述方法重復(fù)獲得的P-外來(lái)體中hsa-miR-3191_5p、hsa-miR-471 l-3p> hsa_miR-1273a、hsa-miR-3142、hsa-miR-4456 和hsa-miR-4714-5p的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)每批次獲得的亞全能干細(xì)胞分泌的P-外來(lái)體中均至少特異性表達(dá) hsa-miR-3191-5p、hsa-miR-4711_3p 和 hsa_miR-1273a 三種 microRNA,另外在部分外來(lái)體中還發(fā)現(xiàn)同時(shí)特異性表達(dá)hsa-miR-3142、hsa-miR-4456和hsa-miR-4714_5p。因此，若前三種miCToRNA均同時(shí)存在，則認(rèn)為此批次P-外來(lái)體符合本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)，可以用于隨后的功能實(shí)驗(yàn)。
[0083]實(shí)施例5P-外來(lái)體的功能實(shí)驗(yàn)
[0084]1.促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移和短期歸巢能力
[0085]遷移實(shí)驗(yàn):`
[0086]遷移實(shí)驗(yàn)在Transwell小室(Costar公司)中進(jìn)行。具體過(guò)程如下:
[0087]I)配制C-Buffer (DMEM培養(yǎng)基+ 0.5%BSA)，趨化液及細(xì)胞懸液均用C-Buffer配制，使用前應(yīng)預(yù)先平衡至37°C ；
[0088]2)上室膜(12mm直徑，孔徑12 μ m)用FN (纖連蛋白)包被:10 μ g/mL，37°C孵育Ih ；PBS洗兩遍；
[0089]3)在下室配制趨化液1.5mL/孔(用C-Buffer將SDF-1 (基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1)稀釋為0、100、200、300、400叩/1^)，然后將上室放入，371:平衡Ih ；
[0090]4)將間充質(zhì)干細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液(調(diào)整細(xì)胞濃度為1.4X IO6個(gè)細(xì)胞/mL)，把500 μ L細(xì)胞懸液加入上室中；
[0091]5) 37°C、5%C02培養(yǎng)15h后取出濾膜，PBS洗兩遍，甲醇固定；
[0092]6)將0.5%結(jié)晶紫用PBS 1:4稀釋后，室溫染色20min ；
[0093]7)用濕棉簽小心將膜上層細(xì)胞擦去；
[0094]8)顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移至濾膜外表面的細(xì)胞數(shù)，每張濾膜隨機(jī)取5個(gè)視野(X400)，取均值，三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
[0095]短期歸巢實(shí)驗(yàn):
[0096]I)將分離純化得到的間充質(zhì)干細(xì)胞用PKH26染色(按照Sigma的說(shuō)明書進(jìn)行)。[0097]具體步驟如下:
[0098]a)常規(guī)消化，用不含F(xiàn)CS的MDM培養(yǎng)基洗滌一次，1000rpm, IOmin,傾去上清；
[0099]b)用500mL C液重懸細(xì)胞，渦旋振蕩器混勻；
[0100]c)將4yL PKH26染料加入500 μ L C液中混勻后，加入到細(xì)胞懸液中，反復(fù)振蕩5min ；
[0101]d)用FCS ImL中止反應(yīng)，室溫放置Imin ；
[0102]e)用含 5% FCS 的 RPMI 1640 培養(yǎng)基洗滌 4 次，每次 lOOOrpm，IOmin ；
[0103]f)用 D-Hank’ s 平衡鹽溶液洗漆一次，I, OOOrpm, IOmin ；
[0104]g)顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞懸液為IO7個(gè)細(xì)胞/mL，放置在冰上待用；
[0105]h)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光染料染色情況；
[0106]上述操作步驟均在避光的條件下進(jìn)行。
[0107]2)經(jīng)PKH26染色的間充質(zhì)干細(xì)胞移植:
[0108]將受體N0D/SCID小鼠(6_8周齡)預(yù)先經(jīng)銫源全身照射300cGy后在4h內(nèi)從尾靜脈輸入經(jīng)PKH26染色的間充質(zhì)干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組移植前用P-外來(lái)體預(yù)先孵育細(xì)胞，并將細(xì)胞與P-外來(lái)體一起經(jīng)靜脈注射小鼠。對(duì)照組的間充質(zhì)干細(xì)胞未經(jīng)P-外來(lái)體處理。所有小鼠均飼養(yǎng)在無(wú)菌環(huán)境下至移植后24h，以頸椎脫白法處死小鼠。取受體小鼠的骨髓，用流式細(xì)胞儀分析其中PKH26+供體 細(xì)胞的數(shù)量，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較。
[0109]結(jié)果
[0110]間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移:
[0111]結(jié)果顯示P-外來(lái)體短時(shí)間(24_48hr)內(nèi)刺激間充質(zhì)干細(xì)胞后，間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)(圖2)。
[0112]間充質(zhì)干細(xì)胞的短期歸巢能力:
[0113]結(jié)果顯示，P-外來(lái)體刺激后，干細(xì)胞的短期歸巢能力明顯增加。24h后其骨髓中PKH26+細(xì)胞的數(shù)量較未刺激組增加了約1.6倍。
[0114]2.參與調(diào)節(jié)免疫
[0115]本發(fā)明的初步結(jié)果表明P-外來(lái)體可以抑制T細(xì)胞的增殖，下調(diào)ThO向Th2的分化，從而使Thl細(xì)胞的比例上調(diào)，進(jìn)而扭轉(zhuǎn)了 Thl細(xì)胞和Th2細(xì)胞的比例失衡而達(dá)到新的平衡點(diǎn)。因此對(duì)于移植物抗宿主病具有治療作用。
[0116]3.促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中NO的釋放
[0117]本發(fā)明的初步結(jié)果表明P-外來(lái)體可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中NO的釋放。NO在維持血管張力的恒定和調(diào)節(jié)血壓的穩(wěn)定性中起著重要作用。
[0118]4.P-外來(lái)體可以抑制HK2腎小管上皮細(xì)胞或HEK294T人胚胎腎臟細(xì)胞凋亡
[0119]凋亡誘導(dǎo):
[0120]將HK2腎小管上皮細(xì)胞或HEK294T人胚胎腎臟細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，誘導(dǎo)凋亡。實(shí)驗(yàn)組加入P-外來(lái)體。
[0121]凋亡的TUNEL (TdT-mediated dUTP nick end labeling)檢測(cè):
[0122]I)用新鮮配制的固定液室溫固定細(xì)胞Ih個(gè)定液:pH 7.4PBS配制4%多聚甲醛)；
[0123]2)用 PBS 洗滌一次；
[0124]3)透化液(Permeabilisation solution)冰上作用 2min (透化液:0.l%TritonX-1OO溶于新鮮制備的0.1%檸檬酸鈉)；
[0125]4) PBS 洗 2 遍;
[0126]5)將樣品晾干；
[0127]6)每份樣本加入 50 μ I TUNEL reaction mixture ；
[0128]7) 37 °C 避光孵育 Ih ;
[0129]8)加入 Hoechst33342 室溫 Imin ；
[0130]9) PBS 洗 3 遍;
[0131]10)熒光顯微鏡下觀察，拍照。[0132]結(jié)果:
[0133]P-外來(lái)體可以抑制HK2腎小管上皮細(xì)胞或HEK294T人胚胎腎臟細(xì)胞的凋亡(圖3)。
[0134]5.P-外來(lái)體可以抑制肝星狀細(xì)胞增殖
[0135]I)人永生化的肝星狀細(xì)胞系(SCs) twnt-4:
[0136]用DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清培養(yǎng)于37°C、5%C02、95%濕度的培養(yǎng)箱中。每3d半量換液。當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%~80%匯合時(shí)，用0.125%胰蛋白酶-0.0P/oEDTA常規(guī)消化，細(xì)胞按照1:3進(jìn)行傳代；
[0137]2) 3H-TdR摻入法檢測(cè)肝星狀細(xì)胞系的增殖能力:
[0138]將肝星狀細(xì)胞系(SCs) twnt-4與不同的量的P-外來(lái)體共培養(yǎng)于24孔板中24h。加入I μ Ci/孔3H-TdR,繼續(xù)在37°C、5%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。18h后，中止。用液閃儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)(cpm表示)。
[0139]結(jié)果:
[0140]P-外來(lái)體抑制肝星狀細(xì)胞系的增殖能力:
[0141]將不同濃度的P-外來(lái)體與肝星狀細(xì)胞系分別進(jìn)行共培養(yǎng)后，肝星狀細(xì)胞系的增殖能力均相對(duì)于單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)下降，提示P-外來(lái)體對(duì)肝星狀細(xì)胞系的增殖影響是抑制性的作用(圖4)。
[0142]6.P-外來(lái)體能夠明顯減少谷氨酸損傷后神經(jīng)細(xì)胞PC12的凋亡，具有神經(jīng)保護(hù)作用
[0143]I)谷氨酸毒性損傷模型及分組:
[0144]將PC12細(xì)胞按照I X IO5個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(或I X IO6個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板)，正常培養(yǎng)24hr后棄去培養(yǎng)上清，D-Hanks?洗I遍，用DF12配制的0.5mM谷氨酸室溫下作用15min，棄去含谷氨酸的培養(yǎng)基，D-Hanks’洗2遍，分別用不同組別培養(yǎng)基孵育，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。用未經(jīng)谷氨酸損傷的細(xì)胞作為對(duì)照組。
[0145]分組:1、正常培養(yǎng)組(對(duì)照組)
[0146]2、谷氨酸損傷組
[0147]3、谷氨酸損傷P-外來(lái)體保護(hù)組
[0148]2)細(xì)胞存活率檢測(cè)(MTS法):
[0149]細(xì)胞存活檢測(cè)使用CellTiter 96 AQueous One Solution Assay試劑盒,按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。[0150]96孔板棄去培養(yǎng)上清，用D-Hanks’洗I遍后，每孔加入100 μ LDF12+20 μ L MTS,37°C培養(yǎng)箱孵育2hn酶標(biāo)儀490nm檢測(cè)吸光度。
[0151]結(jié)果:
[0152]應(yīng)用MTS法檢測(cè)谷氨酸損傷后不同處理組PC12細(xì)胞的存活率，結(jié)果顯示p_外來(lái)體對(duì)于谷氨酸誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用(圖5)。
[0153]參考文獻(xiàn):
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【權(quán)利要求】
1.一種亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體，所述亞全能干細(xì)胞呈Flkl陽(yáng)性，在體外具有誘導(dǎo)分化成三胚層來(lái)源的組織細(xì)胞的能力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體，其特征在于其特異性表達(dá)下述microRNA:hsa-miR-3191_5p、hsa-miR-471l-3p 和 hsa_miR-1273a,優(yōu)選地，其還特異性表達(dá)下述 microRNA:hsa_miR-3142、hsa-miR-4456 和 hsa-miR-4714_5p。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體，其特征在于所述亞全能干細(xì)胞的獲取步驟如下: A)常規(guī)方法分離aMSC或bMSC或其他組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞， B)以I個(gè)細(xì)胞/孔的密度將aMSC或bMSC或其他組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞接種于96孔板中，待長(zhǎng)出單克隆后，將這些單克隆進(jìn)一步擴(kuò)增， C)將單克隆進(jìn)一步擴(kuò)增后的細(xì)胞作為種子細(xì)胞，4-6h細(xì)胞完全貼壁后加入I號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)I天后，更換2號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4天，獲得亞全能干細(xì)胞，即Flkl陽(yáng)性的MSC，所述I號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含l-100ng/ml活化素A+l_500ng/ml Wnt3a+0.1-20%FBS+HG_DMEM，優(yōu)選地，5_50ng/ml 活化素 A，更優(yōu)選地，10_30ng/ml 活化素 A ;優(yōu)選地,50-300ng/ml Wnt3a,更優(yōu)選地，100-300ng/ml Wnt3a ；優(yōu)選地，2-10%FBS,更優(yōu)選地，5-8%FBS,所述2號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含l-100ng/ml活化素A+1-500 μ MRA+0.1-50%FBS+HG-DMEM, 5-50ng/ml 活化素 A，更優(yōu)選地，10-30ng/ml 活化素 A ;優(yōu)選地，20-400 μ M RA，更優(yōu)選地，50-200 μ M RA，將獲得的具有上皮樣形態(tài)的亞全能干細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光染色檢測(cè)和Western Blot檢測(cè)，其中所述免疫細(xì)胞熒光染色檢測(cè)的指標(biāo)包括 Foxa2、Soxl7、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Soxl、Pax6,所述 Western Blot 檢測(cè)的指標(biāo)包括Foxa2、Soxl7、T、Gsc、Epcam、Vimatin,檢測(cè)獲得的干細(xì)胞是否具有三胚層分化潛能重要基因表型標(biāo)志，即限定性的內(nèi)胚層:Foxa2、Soxl7 ;中內(nèi)胚層:Gsc、T、Eomes ;中胚層:Kdr、Tbx6 ;外胚層:S0Xl、PaX6，并且具有較高的誘導(dǎo)效率，F(xiàn)OXa2、SOX17陽(yáng)性的限定性內(nèi)胚層細(xì)胞效率達(dá)到90%以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體，其特征在于其通過(guò)如下步驟獲得: A)收集亞全能干細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)的上清液， B)用差速離心法提取外來(lái)體，細(xì)胞培養(yǎng)上清液l，000Xg，離心10min;取上清，10，OOOXg離心10min ;取上清液，將30%蔗糖/重水墊、上清液及PBS依次放入離心管中，100，000 X g，離心Ih ;取混有外來(lái)體的蔗糖/重水墊，用PBS懸浮，加入到IOOkD超濾離心管中，重復(fù)3次，濃縮液即為P-外來(lái)體， C)用0.22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌，放入_80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體，其特征在于所述亞全能干細(xì)胞的來(lái)源為脂肪組織或骨髓組織。
6.一種含有權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體的組合物。
7.一種制備權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體的方法，其包括下述步驟: A)常規(guī)方法分離aMSC或bMSC或其他組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞， B)以I個(gè)細(xì)胞/孔的密度將a MSC或bMSC或其他組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞接種于96孔板中，待長(zhǎng)出單克隆后，將這些單克隆進(jìn)一步擴(kuò)增， C)將單克隆進(jìn)一步擴(kuò)增后的細(xì)胞作為種子細(xì)胞，4-6h細(xì)胞完全貼壁后加入I號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)I天后，更換2號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)4天，獲得亞全能干細(xì)胞，即Flkl陽(yáng)性的MSC，所述I號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含l-100ng/ml活化素A+l_500ng/ml Wnt3a+0.1-20%FBS+HG_DMEM，優(yōu)選地，5_50ng/ml 活化素 A，更優(yōu)選地，10_30ng/ml 活化素 A ;優(yōu)選地,50-300ng/ml Wnt3a,更優(yōu)選地，100-300ng/ml Wnt3a ；優(yōu)選地，2-10%FBS,更優(yōu)選地，5-8%FBS,所述2號(hào)誘導(dǎo)培養(yǎng)基包含l-100ng/ml活化素A+1-500 μ MRA+0.1-50%FBS+HG-DMEM, 5-50ng/ml 活化素 A，更優(yōu)選地，10-30ng/ml 活化素 A ;優(yōu)選地，20-400 μ M RA，更優(yōu)選地，50-200 μ M RA，將獲得的具有上皮樣形態(tài)的亞全能干細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光染色檢測(cè)和Western Blot檢測(cè)，其中所述免疫細(xì)胞熒光染色檢測(cè)的指標(biāo)包括 Foxa2、Soxl7、Kdr、Tbx6、Eomes、Gsc、T、Soxl、Pax6,所述 Western Blot 檢測(cè)的指標(biāo)包括Foxa2、Soxl7、T、Gsc、Epcam、Vimatin,檢測(cè)獲得的干細(xì)胞是否具有三胚層分化潛能重要基因表型標(biāo)志，即限定性的內(nèi)胚層:Foxa2、Soxl7 ;中內(nèi)胚層:Gsc、T、Eomes ;中胚層:Kdr、Tbx6 ;外胚層:S0Xl、PaX6，并且具有較高的誘導(dǎo)效率，F(xiàn)OXa2、SOX17陽(yáng)性的限定性內(nèi)胚層細(xì)胞效率達(dá)到90%以上， D)收集亞全能干細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)的上清液， E)用差速離心法提取外來(lái)體，細(xì)胞培養(yǎng)上清液l，000Xg，離心10min;取上清，`10，OOOXg離心10min ;取上清液，將30%蔗糖/重水墊、上清液及PBS依次放入離心管中，`100，000 X g，離心Ih ;取混有外來(lái)體的蔗糖/重水墊，用PBS懸浮，加入到IOOkD超濾離心管中，重復(fù)3次，濃縮液即為P-外來(lái)體， F)用0.22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌，放入_80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 8.一種根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體在制備促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移和短期歸巢能力的藥物中的用途。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體在制備促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中NO釋放的藥物中的用途。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體在制備抑制T細(xì)胞的增殖、下調(diào)ThO向Th2的分化的藥物中的用途。
11.一種根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體在制備抑制腎臟來(lái)源細(xì)胞凋亡的藥物中的用途。`
12.一種根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體在制備抑制肝星狀細(xì)胞的藥物中的用途。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的亞全能干細(xì)胞分泌的外來(lái)體在制備減少谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK103865873SQ201210535397
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2012年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月12日
【發(fā)明者】趙春華 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所