1.一種H5亞型禽流感病毒的增殖方法,其特征在于,所述的方法包括如下的步驟:
1)取H5亞型禽流感病毒用病毒稀釋液進(jìn)行稀釋后接種10日齡的SPF雞胚,在36℃培養(yǎng),然后收獲72h未死亡雞胚的尿囊液,收集尿囊液,置-40℃保存;
2)將步驟1)收集的尿囊液再用病毒稀釋液進(jìn)行10倍倍比稀釋,選取10-6~10-9范圍稀釋度的病毒液接種10日齡SPF雞胚,置35.5℃培養(yǎng),收獲72h未死亡胚尿囊液,再取高稀釋度且HA效價(jià)最高的尿囊液混合后作為種子液。
3)按照步驟3)的方法對(duì)步驟2)收集的種子液連續(xù)傳代4次,再取高稀釋度且HA效價(jià)為10log2、9log2、10log2的尿囊液混合,獲得最終制備疫苗用的病毒液。
2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的H5亞型禽流感病毒,為Re-6、Re-7、Re-8株中的任一種或幾種。
3.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,所述的病毒稀釋液,是添加氨基酸混合物和維生素混合物的磷酸緩沖液。
4.如權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,所述的磷酸緩沖液的配比如下:1.56g的NaH2PO4·2H2O,3.58g的Na2HPO4·12H2O,9g的Nacl,加水至1000ml。
5.如權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,所述的病毒稀釋液中氨基酸混合物的質(zhì)量百分比為0.3%,維生素混合物的質(zhì)量百分比為0.5%。
6.如權(quán)利要求3或5所述的方法,其特征在于,所述的氨基酸混合物的配比如下:40%天冬氨酸、30%脯氨酸、30%谷氨酰胺。
7.如權(quán)利要求3或5所述的方法,其特征在于,所述的維生素混合物的配比如下:40%維生素B3、30%維生素B1和30%維生素B7。
8.一種H5亞型禽流感病毒滅活疫苗的制備方法,其特征在于,所述的方法中使用的病毒液是使用權(quán)利要求1所述的方法制備的。
9.一種H5亞型禽流感病毒滅活疫苗的制備方法,其特征在于,所述的方法包括如下的步驟:
1)油相制備:取獸用白油95份,硬脂酸鋁1份,置于油相制備罐中加熱至80℃后,再加5份的司本-80,至溫度達(dá)到115℃時(shí),維持30min,冷卻后備用;
2)水相制備:將病毒液滅活后加入水相中,取滅菌后的5份吐溫-80,加入配液罐中,同時(shí)加入病毒液95份,攪拌20~30min,使吐溫-80完全溶解;
所述的病毒液是使用權(quán)利要求1所述的方法制備的;
3)乳化:取油相2份放于高速剪切機(jī)內(nèi),開動(dòng)電機(jī)慢速轉(zhuǎn)動(dòng)攪拌,同時(shí)加入水相1份,以10000r/min,乳化5分鐘,乳化后,取10ml,以3000r/min離心15分鐘完成制備。