一種新型抗原群的h9n2禽流感病毒及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種禽流感病毒，具體來說是一種新型抗原群的 H9N2禽流感病毒及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] H9N2亞型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV)自上個世紀90年代以來已 經(jīng)廣泛在我國和世界各地流行，不僅僅給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，而且給公共衛(wèi)生 安全造成的隱患不可估量，對人類的健康也構(gòu)成了巨大的威脅。在我國，獨特的地理環(huán)境及 養(yǎng)殖模式為此病的發(fā)生、傳播提供了有利條件。而免疫壓力及活禽市場的存在又為H9N2亞 型禽流感病毒的重組和變異提供了必要條件。目前，H9N2亞型的疫苗已用于常規(guī)免疫，在 一定程度上控制了 H9N2亞型AIV的暴發(fā)流行。但是，由于禽流感病毒具有傳播快、感染宿 主具有多樣性，病毒株血清型眾多、不同毒株間毒力差異大、變異性強等特點，造成局部地 區(qū)仍有流行，且非典型性流行增多，免疫失敗也屢見不鮮。Radu等及Kilbourne等指出疫 苗株應(yīng)經(jīng)常改變，因為老的疫苗株通常僅對新毒株產(chǎn)生部分的保護力。1999年，Garcia等 證實禽流感暴發(fā)期間AIV分離株有很高的變異性，從而導致疫苗無效。Suarez等認為，AIV 的變異可引起禽類甚至人類疫苗免疫的失敗。劉紅旗等研究指出，HA基因的變異可能與頻 繁的疫苗免疫選擇壓力有關(guān)。本試驗擬通過HI交叉試驗來比較分析2002年，2006-2014年 上海地區(qū)分離的H9N2亞型禽流感病毒之間的抗原相關(guān)性，探討其抗原性是否發(fā)生漂移，為 H9N2亞型禽流感的防制提供參考依據(jù)。為了 了解不同年份分離的H9N2亞型禽流感病毒與 目前使用的疫苗株CK/SH/F/98之間的抗原相關(guān)性，挑選2002年，2006-2014年間在上海地 區(qū)分離的14株H9N2亞型禽流感病毒以及CK/SH/F/98病毒，通過HI交叉試驗進行抗原性比 較和分析。HI試驗結(jié)果顯示：2002年，2006-2014年間在上海地區(qū)流行的H9N2亞型不同毒 株間已經(jīng)發(fā)生了抗原性的漂移，劃分成4個不同的抗原群，A/chicken/Shanghai/Yl/2002， A/chicken/Shanghai/Yl/2006 和 A/duck/Shanghai/C60/2007 同屬于一個抗原群，命名為 A 群；A/chicken/Shanghai /C/2011 獨自成為一個抗原群，命名為B群；A/pigeon/Shanghai/ JC1/2013和A/chicken/Shanghai/1107/2013歸為同一個抗原群，命名為D群；其余毒株均 為一個抗原群，命名為C群。從抗原性聚類分析發(fā)現(xiàn)14株病毒均從CK/SH/F/98演化而來。 綜上所述，整體來看一方面H9N2病毒是隨時間的增長，抗原發(fā)生了不同程度的漂變，但是 也存在在某個時間段，多種抗原群共存的情況。該研究結(jié)果從理論上為我市制定禽流感防 控策略、有效防制H9N2流行提供了科學的指導，為生產(chǎn)上H9N2亞型流感免疫與制苗毒株的 選擇提供參考依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種新型抗原群的H9N2禽流感 病毒及其用途，所述的這種新型抗原群的H9N2禽流感病毒及其用途解決了現(xiàn)有技術(shù)中無 法預防新的禽流感病毒從而導致新的禽流感疫情在禽類或者人類傳播的技術(shù)問題。
[0004] 本發(fā)明提供了一種分離的H9N2禽流感病毒（抗原群D群），其基因組由SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 7和SEQ ID NO :8所示的RNA片段組成。
[0005] 本發(fā)明還提供了一種分離的H9N2禽流感病毒，其保藏號為CGMCC NO :10925。
[0006] 本發(fā)明還提供了一種用于預防上述的H9N2禽流感病毒的疫苗，含有滅活的上述 的H9N2禽流感病毒。
[0007] 本發(fā)明還提供了上述的用于預防H9N2禽流感病毒的疫苗的制備方法，包括如下 步驟：
[0008] a)，一個疫苗抗原液制備及毒價測定的步驟，將權(quán)利要求1或2所述的H9N2 禽流感病毒用滅菌生理鹽水稀釋后，接種非免疫雞胚，收取尿囊液，測定其毒價：在 l(f6-l(fsEID50, HA價在I :256-512之間，病毒液置冰箱中保存?zhèn)溆茫?br>[0009] b)，一個抗原液滅活的步驟，將福爾馬林溶液加入病毒液中，檢驗合格后作為制備 抗原液；
[0010] c)，一個制備油相佐劑的步驟；
[0011] d)，一個制備疫苗水相的步驟；
[0012] e)，一個配制疫苗的步驟，將油相與水相預混后，再將混合物注入到高壓勻漿栗內(nèi) 乳化，制成油包水乳劑即為疫苗。
[0013] 進一步的，所述的油相佐劑由白油、司本-80和硬脂酸鋁配制混合而成。
[0014] 進一步的，在制備疫苗水相的步驟中，將吐溫-80經(jīng)高溫滅菌后，加入到己滅活抗 原液中，吐溫-80的終濃度在2% - 5%之間，經(jīng)充分溶解混合即為水相。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種抗體，抗上述的一種分離的H9N2禽流感病毒。
[0016] 本發(fā)明還提供了一種診斷試劑，含有上述的一種抗體。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種試劑盒，含有上述的一種抗體。
[0018] 本發(fā)明對分離的抗原群D群H9N2禽流感病毒進行了保藏。上述的分離的H9N2禽 流感病毒的分類命名為甲型流感病毒H9N2亞型，該病毒保藏于中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心（CGMCC)中，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的地 址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號（中國科學院微生物研究所），保藏日期為2015年 9月8號，保藏號為CGMCC NO: 10925。
[0019] 接種本發(fā)明的疫苗，可以預防本發(fā)明的抗原群D群的H9N2禽流感病毒的感染。使 用本發(fā)明的抗體，可以治療本發(fā)明的抗原群D群的H9N2禽流感病毒的感染。并且本發(fā)明還 可以為禽流感病毒監(jiān)測系統(tǒng)提供生物信息。
【附圖說明】
[0020] 圖 1 是通過 PRIMER，version 7. 0 (PRIMER-E，Plymouth，United Kingdom)軟件分 析HI滴度，得到抗原性聚類圖。
【具體實施方式】
[0021] 實施例1病毒的獲得
[0022] 于2013年從上海地區(qū)的活禽批發(fā)市場雞群獲得，采集活禽樣品包括氣管或泄殖 腔拭子，將采集樣品放在含有抗菌素的pH值7. 0-7. 4的等滲磷酸鹽緩沖液（PBS)內(nèi)。將 鑒定為陽性樣品的棉拭子充分捻動、抒干后棄去拭子，樣品液經(jīng)l〇〇〇r/min離心10min， 取上清液作為接種材料。取處理好的樣品以〇.2mL/胚的量經(jīng)尿囊腔途徑接種9日齡-11 日齡SPF雞胚，每個樣品接種5個胚，于35°C -37°C孵化箱內(nèi)孵育，18h后每8h觀察雞胚 死亡情況。無菌收取18h以后的死胚及96h仍存活雞胚的雞胚尿囊液，測血凝活性，通 過下面的實施例對從雞胚尿囊液中的病毒進行基因測序和鑒定，是一種新抗原群的甲型 流感病毒H9N2禽流感病毒，對此進行了保藏，保藏號為：CGMCC N0:10925 (A/chicken/ Shanghai/1107/2013) 〇
[0023] 實施例2 H9N2禽流感病毒的全基因測序
[0024] 2. 1于2013年從上海地區(qū)的活禽批發(fā)市場雞群中獲得，共分離、鑒定了一株H9N2 禽流感病毒：A/chicken/Shanghai/1107/2013(保藏號為：CGMCC NO :10925)。首先對雞氣 管和泄殖腔樣品用H9熒光RT-PCR試劑盒進行檢測，將H9陽性樣品處理后接種雞胚尿囊 腔，將分離毒尿囊液應(yīng)用β -微量法進行HA試驗，以檢測其血凝性及HA效價。根據(jù)HA試 驗中所測得的HA效價，將分離毒尿囊液配制成4單位的溶液，分別用新城疫陽性血清，禽流 感Η5和Η9陽性血清進行HI試驗，以檢測該分離物的血凝性是否能被禽流感Η9陽性血清 所抑制，詳細步驟按照GB/U 18936-2003高致病性禽流感診斷技術(shù)。這1株病毒感染的雞 胚尿囊液血凝性能夠被Η9型陽性血清所抑制，而不能被Η5型陽性血清所抑制，表明這1株 病毒為Η9亞型。NA基因通過測序為Ν2亞型。
[0025] 2. 2將陽性樣本接種SPF雞胚，取感染雞胚尿囊液用TRIzoI抽提試劑進行RNA的 抽提。2. 3 8個基因片段RT-PCR擴增如下：采用20 μ L的cDNA合成體系置于0. 2mL反應(yīng) 管中，取溶于DEPC處理水中的AIV RNA樣品9 μ L，分別加入上游引物3 μ L，5倍RT-PCR緩 沖液 4 μ L，dNTPs (lOmmol/L) 2. 5 μ L，RNA 酶抑制劑 0· 5 μ L，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 2 μ L，用無 RNase 的超純水加至總體積為20 μ L，置于PCR儀中進行cDNA合成，以30°C 10min，42°C 60min，進 入PCR擴增。
[0026] PCR反應(yīng)體系IOOyL:在PCR反應(yīng)管中分別加入cDNAlO μ L，上、下游引物各 3yL(20pmol/yL)，10XLA PCR BufferlOyL，dNTPs(2.5mmol/L)10yL，MgCl2(25mmol/ L) 8 μ L，LA Taq DNA聚合酶0. 5 μ L (5U/