一種h1、h3和h9型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種H1、H3和H9型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒及檢 測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 禽流感（Avianinfluenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一種禽類(lèi)的 急性、烈性傳染病，除了可感染禽類(lèi)外，還可感染人、豬和馬等多種動(dòng)物，被0ΙΕ列為A類(lèi)傳 染病。禽流感病毒（AIV)屬于A型流感病毒，禽流感病毒（AIV)變異頻繁，血清亞型眾多。 根據(jù)HA抗原性差異分為16個(gè)HA亞型?？乖儺愋詮?qiáng)，宿主范圍廣泛，亞型間無(wú)交叉保護(hù) 性，使得禽流感頻繁暴發(fā)，且由于禽流感潛伏期極端，爆發(fā)突然，多不見(jiàn)任何臨床癥狀而突 然死亡，發(fā)病率和死亡率可高達(dá)100%，成為養(yǎng)禽業(yè)的一大毀滅性疾病。
[0003]目前，我國(guó)部分地區(qū)以H9亞型為主的中低致病力禽流感的流行，能造成雞產(chǎn)蛋量 下降，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，這一點(diǎn)已引起國(guó)內(nèi)各界的廣泛關(guān)注。另外禽流感 還可感染人，研究表明人類(lèi)流感首先來(lái)自家禽，家禽流感傳染給人類(lèi)，有些感染者嚴(yán)重的導(dǎo) 致死亡。近年在我國(guó)流行的H7N9流感也是在禽類(lèi)上無(wú)臨床癥狀，一旦感染人就表現(xiàn)高致病 性，這就為我們?nèi)粘５募膊”O(jiān)控預(yù)防提出要求，必須有一種簡(jiǎn)單快速適用的檢測(cè)方法能夠 應(yīng)用。
[0004] -些早期快速檢測(cè)無(wú)疑是預(yù)防、控制禽流感的前提條件，尤其是針對(duì)Hl、H3和H9 亞型的AIV。病毒分離、血清學(xué)試驗(yàn)至今仍是診斷AI和對(duì)AIV進(jìn)行定型普遍采用的方法，但 這些方法操作繁瑣復(fù)雜；難以對(duì)AIV進(jìn)行快速診斷；十分不利于AIV的防治。聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR)已經(jīng)成為了分子生物學(xué)領(lǐng)域最基本也是最重要的 技術(shù)手段之。PCR是一種體外基因擴(kuò)增技術(shù)，可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)對(duì)某段基因進(jìn)行擴(kuò)大數(shù)百萬(wàn) 倍。該技術(shù)特異性強(qiáng)、敏感性高。為AIV早期快速診斷提供了敏感、快速、實(shí)用的方法。但 常用的PCR檢測(cè)需要精密的儀器以及繁瑣的試驗(yàn)程序，難以滿(mǎn)足非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè) 的要求，例如不能進(jìn)一步滿(mǎn)足一線獸醫(yī)人員的快速檢測(cè)。
[0005] 因此，需要一種能夠快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)禽流感病毒的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的禽流感病毒檢測(cè)繁瑣難以滿(mǎn)足需求的 問(wèn)題，為此本發(fā)明提供了一種Hl、H3和H9型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
[0007] 本發(fā)明提供的一種H1、H3和H9型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒，其中，所述試劑盒包括： RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和RPA檢測(cè)試劑盒；
[0008] 所述RNA提取試劑盒用于提取待測(cè)樣品的RNA作為檢測(cè)模板；
[0009] 所述RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒用于對(duì)所述檢測(cè)模板中的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA;
[0010] 所述RPA檢測(cè)試劑盒包括引物和熒光染料，所述引物用于對(duì)所述cDNA進(jìn)行擴(kuò)增得 到擴(kuò)增DNA序列，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和所述反向引物的序 列如下：
[0017] 所述熒光染料用于對(duì)所述擴(kuò)增DNA序列進(jìn)行熒光檢測(cè)。
[0018] 優(yōu)選的，所述試劑盒還包括試紙條，用于檢測(cè)所述擴(kuò)增DNA序列。
[0019] 優(yōu)選的，所述試紙條為快速顯色試紙條。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種H1、H3和H9型禽流感病毒檢測(cè)方法，其中，所述方法包括：
[0021] 提取試劑提取待測(cè)樣品的RNA作為檢測(cè)模板；
[0022] 對(duì)所述檢測(cè)模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到得到cDNA;
[0023] 對(duì)所述cDNA進(jìn)行擴(kuò)增得到擴(kuò)增DNA序列；
[0024] 對(duì)所述擴(kuò)增DNA序列進(jìn)行熒光檢測(cè)得到擴(kuò)增曲線；
[0025] 根據(jù)所述擴(kuò)增曲線判斷檢測(cè)結(jié)果。
[0026] 優(yōu)選的，所述方法還包括在對(duì)所述cDNA進(jìn)行擴(kuò)增得到擴(kuò)增DNA序列后，通過(guò)試紙 條檢測(cè)所述擴(kuò)增DNA序列，根據(jù)試紙條的顯示結(jié)果判斷檢測(cè)結(jié)果。
[0027] 優(yōu)選的，若所述試紙條顯示條帶，則判斷所述檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。
[0028] 優(yōu)選的，所述試紙條為快速顯色試紙條。
[0029] 本發(fā)明提供的禽流感檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法通過(guò)在試劑盒中使用RPA檢測(cè)技術(shù)， 檢測(cè)禽流感病毒時(shí)在RPA擴(kuò)增體系中加入熒光試劑便可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)模板擴(kuò)增的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，最 后通過(guò)得到的擴(kuò)增曲線來(lái)判斷檢測(cè)的結(jié)果。這種檢測(cè)禽流感的試劑盒及檢測(cè)方法極大地縮 短了檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化了檢測(cè)步驟，能夠?qū)崿F(xiàn)快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)禽流感病毒。
【附圖說(shuō)明】
[0030] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作一簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖是本發(fā) 明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以 根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0031] 圖1為本發(fā)明提供的一種HI、H3和H9型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒結(jié)構(gòu)圖；
[0032] 圖2為本發(fā)明提供的一種Hl、H3和H9型禽流感病毒檢測(cè)方法流程圖；
[0033] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例6提供的Hl、H3和H9單基因擴(kuò)增圖；
[0034] 圖4為本發(fā)明實(shí)施例7提供的檢測(cè)模板特異檢測(cè)圖；
[0035] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例8提供的H1流感靈敏度檢測(cè)圖；
[0036] 圖6為本發(fā)明實(shí)施例8提供的H3流感靈敏度檢測(cè)圖；
[0037] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例8提供的H9流感靈敏度檢測(cè)圖；
[0038] 圖8為本發(fā)明實(shí)施例9提供的試紙條快速檢測(cè)PCR產(chǎn)物結(jié)果圖；
[0039] 圖9為本發(fā)明實(shí)施例9提供的H1流感HA基因RPA產(chǎn)物瓊脂糖膠結(jié)果圖；
[0040] 圖10為本發(fā)明實(shí)施例9提供的H3流感HA基因RPA產(chǎn)物瓊脂糖膠結(jié)果圖；
[0041] 圖11為本發(fā)明實(shí)施例9提供的H9流感HA基因RPA產(chǎn)物瓊脂糖膠結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附 圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明 一部分示例性的實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例，僅用于解釋本發(fā)明，而不能解釋為對(duì)本發(fā)明 的限制?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲 得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0043] 本發(fā)明提供了各種特定工藝和材料的例子，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以意識(shí)到其他 工藝的可應(yīng)用性/或其他材料的使用。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的實(shí)施例將采用本領(lǐng)域技術(shù) 人員的能力范圍之內(nèi)的化學(xué)、分子生物學(xué)等領(lǐng)域的傳統(tǒng)技術(shù)。另外，實(shí)施例中未注明具體實(shí) 驗(yàn)步驟或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的常規(guī)實(shí)驗(yàn)步驟的操作或條件即可進(jìn)行。
[0044] 重組酶聚合酶擴(kuò)增（RecombinasePolymeraseAmplification，RPA)技術(shù)是模擬 生物體內(nèi)DNA復(fù)制、基于重組酶聚合酶介導(dǎo)的擴(kuò)增原理發(fā)展而來(lái)，利用重組酶和引物形成 微絲在模板DNA上搜索到與之完全互補(bǔ)的序列時(shí)，在單鏈DNA結(jié)合蛋白的幫助下，使模板 DNA解鏈，引物與模板DNA開(kāi)始配對(duì)形成復(fù)制所需自由的3'羥基末端，在DNA聚合酶的作用 下進(jìn)行復(fù)制延伸，形成新的DNA互補(bǔ)鏈反應(yīng)產(chǎn)物也是以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。與常規(guī)PCR反應(yīng)不同， RPA反應(yīng)所需引物長(zhǎng)度通常為30-35bp。引物設(shè)計(jì)時(shí)為了避免形成引物內(nèi)部及之間的二級(jí) 結(jié)構(gòu)，其長(zhǎng)度的增加也使引物設(shè)計(jì)及選擇難度增加，引物序列的設(shè)計(jì)與選擇對(duì)RPA的結(jié)果 至關(guān)重要。
[0045] 本發(fā)明實(shí)施例提供的H1、H3、H9型禽流感病毒檢測(cè)試劑盒，在GenBank中搜索三種 亞型HA基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物。經(jīng)過(guò)大量的試驗(yàn)和實(shí)際檢測(cè)，篩選、優(yōu)化出3對(duì)引物及 其反應(yīng)體系，所擴(kuò)增的DNA片段大小分別為HlHA159bp、H3HA268bp和H9HA144bp。結(jié)果表 明，通過(guò)擴(kuò)增條