本發(fā)明屬于生物技術(shù)及細胞工程領域，尤其涉及一種分泌抗微囊藻毒素抗體的雜交瘤細胞株及其所分泌的單克隆抗體。

背景技術(shù)：

微囊藻毒素(Microcystin，MC)是水體中藍藻爆發(fā)性繁殖產(chǎn)生的二級毒性代謝物，MC為肝毒素，能在貽貝和扇貝的消化腺內(nèi)積累并沿食物鏈進入到魚、鳥、哺乳動物和人等高級營養(yǎng)生物體內(nèi)，引起中毒甚至死亡。MC是一類具有生物活性的環(huán)狀七肽化合物，由于多肽中兩種可變氨基酸組成的不同，具有60余種異構(gòu)體。其中存在最普遍、含量最多的是MC-LR，MC-RR,MC-YR這3種微囊藻毒素(L、R、Y分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸)。MC的毒性和其結(jié)構(gòu)相關(guān)，Adda是表達MC毒性的必須基團，研究表明，MC-LR的急性毒性最強，MC-YR次之，MC-RR最弱，以上是分布最廣泛的肝毒素。微囊藻毒素主要由淡水藻銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)產(chǎn)生，具有相當?shù)姆€(wěn)定性，它能夠強烈抑制蛋白磷酸酶的活性，還有強烈的肝臟癌促進劑。

2001年衛(wèi)生部衛(wèi)法監(jiān)發(fā)[2001]161號文件附件和地表水環(huán)境質(zhì)量標準[GB 3838-2002]都有微囊藻毒素的檢測項目，世界衛(wèi)生組織(WHO)在《飲用水衛(wèi)生基準》中制定的微囊藻毒素的指標為1μg/L。

目前水體中藻毒素的檢測大多采用HPLC-MS或是LC-MS等檢測方法，這類檢測技術(shù)往往操作復雜、耗時長、價格較高、精度難以滿足要求，限制了常規(guī)檢測的次數(shù)，而免疫檢測技術(shù)在藻毒素的檢測領域呈現(xiàn)了較好的應用前景，受到國內(nèi)外研究人員的關(guān)注。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種抗微囊藻毒素抗體的雜交瘤細胞株及其所分泌的單克隆抗體。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案：一種抗微囊藻毒素抗體的雜交瘤細胞株,所述細胞株的保藏號為CGMCC NO.13802。

上述雜交瘤細胞株分泌的抗微囊藻毒素單克隆抗體。

所述單克隆抗體為IgG2b類抗體，抗體輕鏈為κ亞型。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的抗原制備方法簡便可行,制備的完全抗原免疫BALB/c小鼠產(chǎn)生了較好的免疫應答；本發(fā)明提供的微囊藻毒素單克隆抗體特異性強，制備方法簡單，用于微囊藻毒素的研究和微囊藻毒素免疫學檢測方法的建立；獲得穩(wěn)定分泌微囊藻毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞株6G7，測得6G7腹水ELISA效價為6.05×10⁵。經(jīng)鑒定該單克隆抗體為IgG2b類抗體，抗體輕鏈為κ亞型。

附圖說明

圖1純化后單抗的電泳圖(1道為微囊藻毒素抗體)。

圖2微囊藻毒素半抑制濃度曲線。

具體實施方式

抗微囊藻毒素抗體的雜交瘤細胞株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC NO.13802，保藏日：2017-02-23，分類命名：鼠源雜交瘤細胞株。

本發(fā)明的抗微囊藻毒素抗體的雜交瘤細胞株,保藏號為CGMCC NO.13802。

上述雜交瘤細胞株分泌的抗微囊藻毒素單克隆抗體。

所述單克隆抗體為IgG2b類抗體，抗體輕鏈為κ亞型。

本發(fā)明的單克隆抗體是將牛血清白蛋白(BSA)作為載體蛋白與微囊藻毒素偶聯(lián)自備完全抗原，免疫BALB/c小鼠，利用雜交瘤技術(shù)獲得能特異性識別微囊藻毒素的單克隆抗體6G7雜交瘤細胞株。

制備方法包括：

1)免疫抗原MC-LR-BSA的制備

配制微囊藻毒素-LR的二甲基亞砜(DMSO)溶液，加入N-羥基琥珀酰胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)進行MC-LR的活化。將上述溶液緩慢滴加于牛血清白蛋白(BSA)溶液進行微囊藻毒素與BSA的偶聯(lián)，反應產(chǎn)物用磷酸鹽緩沖液(PBS)透析，得到微囊藻毒素與載體蛋白的偶聯(lián)物。

2)小鼠免疫

本發(fā)明采用低劑量長周期的免疫方案。使用偶聯(lián)蛋白MC-LR-BSA作為免疫抗原，對4～6周齡的雌性BALB/c小鼠進行免疫。按30μg/只的免疫劑量對BALB/c小鼠進行6次免疫，最后一次免疫三天后摘取小鼠脾臟，做細胞融合。

3)細胞融合

取Sp2/0骨髓瘤細胞與免疫的BALB/c小鼠脾細胞按比例均勻混合，在50％聚乙二醇1500(PEG 1500)作用下進行細胞融合，用含20％FCS和HAT的DMEM培養(yǎng)基在5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)14d后，逐步用20％FCS和HT的DMEM培養(yǎng)基和20％FCS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當融合的細胞生長至96孔板孔底面積的1/7時，取上清進行抗微囊藻毒素單克隆抗體檢測。

4)雜交瘤篩選

用微囊藻毒素-卵清白蛋白(MC-LR-OVA)的碳酸鹽緩沖液做包被原，以0.8％明膠溶液做封閉液，1∶12000稀釋的辣根過氧化物酶標的羊抗鼠IgG作為二抗，TMB-H₂O₂為底物，2M硫酸溶液為終止液，PBST做洗液，1:500稀釋的陽性參考血清和1:500稀釋的陰性參考血清做對照的間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，對雜交瘤細胞上清中的抗微囊藻毒素抗體分泌情況進行檢測，篩選分泌抗微囊藻毒素抗體的陽性雜交瘤細胞。經(jīng)酶標儀測定OD450nm值：以空白對照調(diào)零，當陽性參考血清的OD450nm值與陰性參考血清的OD450nm值的比值≥2.1，檢測孔判為陽性，當陽性參考血清的OD450nm值與陰性參考血清的OD450nm值的比值＜1.5的檢測孔判為陰性，比值介于中間判為可疑。

5)有限稀釋法對雜交瘤細胞亞克隆

首先將陽性孔活細胞用臺盼蘭進行染色和計數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋成100個細胞/15mL培養(yǎng)基，將稀釋的細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板，達到每孔1個細胞，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)8～9d時取細胞上清，及時進行ELISA檢測。選擇陽性的單克隆細胞再進行同樣的亞克隆3次以上，直至該細胞所有孔的上清液檢測均為陽性且各孔檢測OD值較接近，將多次亞克隆培養(yǎng)后的陽性細胞擴大培養(yǎng)和凍存。

6)抗微囊藻毒素單克隆抗體腹水的制備

BALB/c小鼠腹腔接種液體石蠟，每只小鼠0.5mL。兩周后，腹腔接種用無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細胞，每只小鼠5×10⁵/0.2mL。間隔8天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待腹水盡可能多而小鼠瀕于死亡時，處死小鼠，無菌條件下將腹水吸出。室溫靜止30min，10000rpm，離心10min，收集上清，分裝，-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

7)抗微囊藻毒素單克隆抗體的純化

純化方案為辛酸-硫酸銨沉淀法。取1份預處理過的腹水加2份0.06mol/L pH4.0醋酸緩沖液，用1mol/L HCl調(diào)pH至4.5；按每毫升稀釋腹水加11μL辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30min內(nèi)加完，4℃靜置2h，取出12000rpm離心30min，棄沉淀；上清經(jīng)尼龍篩過濾(125μm)，加入1/10體積的0.1mol/L PBS，用1mol/L NaOH調(diào)pH至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45％飽和度，輕輕混勻30min，靜置1h；12000rpm離心30min，棄上清；沉淀溶于適量PBS中，對50～100倍體積的PBS透析，4℃過夜；取出12000rpm離心30min，除去不溶性沉淀，分裝，凍存?zhèn)溆谩?/p>

8)抗微囊藻毒素單克隆抗體的腹水效價測定

用PBS緩沖液1∶100稀釋單克隆抗體腹水，然后進行倍比稀釋，加入MC-LR-OVA包被的酶標板，100μL/孔，37℃，孵育30min；PBST洗滌3次，每次1min，最后一次拍干；加入1∶12000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃，孵育30min；PBST洗滌5次每次1min，最后一次拍干；加入底物TMB-H₂O₂，100μL/孔，室溫避光顯色15min；每孔加入50μL2mol/L硫酸終止反應；用酶標儀測定OD450nm值。以陰性OD450nm值小于0.2，檢測孔與陰性OD450nm值的比值大于2.1判為陽性，以陽性孔的最大稀釋度作為單克隆抗體的腹水效價。

9)抗微囊藻單克隆抗體半抑制濃度IC₅₀的測定

經(jīng)過點陣法確立，包被原濃度為0.1μg/mL，抗MC-LR單抗稀釋倍數(shù)為65000倍，酶標二抗?jié)舛葹?:12000稀釋，抗原抗體反應時間為35min，酶標反應時間為30min，TMB底物顯色時間為15min，MC-LR標準品藥物濃度設定范圍為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ng/mL。每孔加入50μL2mol/L硫酸終止反應。用酶標儀測定OD450nm值。采用酶免軟件進行統(tǒng)計，計算IC₅₀值

10)抗體亞型的鑒定

采用商業(yè)化試劑盒對抗微囊藻毒素單克隆抗體進行亞型測試。

本發(fā)明，通過制備其單克隆抗體，可為微囊藻毒素抗原性研究和微囊藻免疫學檢測方法的建立以及檢測樣品前處理試劑的制備提供必要組分和技術(shù)手段，對探索MC各結(jié)構(gòu)區(qū)域的生物學功能和建立MC的特異、靈敏的檢測方法具有重要意義。

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細說明：

實施例1免疫抗原微囊藻毒素-BSA的制備

微囊藻毒素的活化：取1mg微囊藻毒素-LR溶解于0.05mLDMSO溶液中，分別量取NHS和EDC加入上述溶液中(微囊藻毒素∶NSH∶EDC摩爾比為1∶2∶2)，室溫下避光劇烈搖動1h。微囊藻毒素的偶聯(lián)：將上述溶液緩慢滴加于BSA溶液(5mg蛋白溶于1mL 0.1mol/L碳酸氫鈉溶液中)，室溫下避光振蕩2h；反應產(chǎn)物于0.01mol/L PBS緩沖液中4℃下避光透析72h，每6h更換透析液一次，得到微囊藻毒素與載體蛋白的偶聯(lián)物。

實施例2雜交瘤細胞株的建立

1)小鼠免疫

本發(fā)明采用低劑量長周期的免疫方案。使用偶聯(lián)蛋白MC-LR-BSA作為免疫抗原，對4～6周齡的雌性BALB/c小鼠進行免疫。按30μg/只的免疫劑量(按蛋白含量計)，與弗氏完全佐劑1∶1(V/V)混合，乳化50min，達到油包水狀，在水中不溶解或4℃過夜不分層視為有效乳化。將乳化的完全抗原，頸背部多點皮下注射免疫BALB/c小鼠(30μg/只)；2周后，以相同抗原和等體積的弗氏不完全佐劑乳化，30μg/只進行加強免疫；6次免疫后，不加佐劑以100μg/只，進行腹腔注射加強免疫。從第三次開始，每次免疫一周后尾靜脈或眼球采血，37℃靜置1h，4℃過夜析出血清，5000rpm離心10min，分離血清測試血清滴度。最后一次免疫三天后摘取小鼠脾臟，做細胞融合。

2)細胞融合

取Sp2/0骨髓瘤細胞與免疫的BALB/c小鼠脾細胞按1:5～1:10的比例混合于50mL離心管中，充分混勻，1000rpm離心10min，棄上清，用手掌輕擊管底，使細胞松散均勻，置38℃水浴預熱，用1mL吸管在60s內(nèi)加完預熱至38℃的1mL 50％PEG 1500，邊加邊輕輕振蕩，然后在90s內(nèi)加入30mL預熱至37℃的DMEM不完全培養(yǎng)基，室溫靜置10min，1000rpm離心10min，棄上清，加入20mL含20％FCS和HAT的DMEM培養(yǎng)基重懸。分裝到已有飼養(yǎng)細胞的96孔板上，于5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7d后，觀察細胞的生長狀況，用含有20％FCS和HT的DMEM培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基；14d后，改用20％FCS和HT DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，當融合的細胞生長至96孔板孔底面積的1/7時，取上清進行抗體檢測。

3)抗微囊藻毒素雜交瘤細胞的篩選

用包被液為0.05mol/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液，將偶聯(lián)好的包被抗原(MC-LR-OVA)，做倍比稀釋包被ELISA板，100μL/孔，置4℃包被過夜；PBST洗滌3次，每次1min，最后一次拍干；以0.8％明膠溶液封閉每孔，300μL/孔，37℃放置2h；PBST洗滌3次，每次1min，最后一次拍干；將細胞上清、1:500稀釋的陽性參考血清和1:500稀釋的陰性參考血清，加入相應孔內(nèi)，100μL/孔，37℃作用60min；PBST洗滌3次，每次1min，最后一次拍干；加入1:12000稀釋的酶標羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃放置60min；PBST洗滌5次，每次5min，最后一次拍干；加入底物TMB-H₂O₂，100μL/孔，室溫避光顯色15min；每孔加入50μL 2mol/L硫酸溶液終止反應。經(jīng)酶標儀測定OD 450nm值：以空白對照調(diào)零，當陽性參考血清的OD 450nm值與陰性參考血清的OD450nm值的比值≥2.1，檢測孔判為陽性，當陽性參考血清的OD 450nm值與陰性參考血清的OD 450nm值的比值＜1.5的檢測孔判為陰性，比值介于中間判為可疑。

4)有限稀釋法對陽性雜交瘤細胞進行亞克隆

對于篩選所得的分泌特異性單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，及時采用有限稀釋法進行亞克隆。首先將陽性孔活細胞用臺盼蘭進行染色和計數(shù)，用DMEM完全培養(yǎng)基稀釋成120個細胞/15mL培養(yǎng)基，將稀釋的細胞懸液加入96孔細胞培養(yǎng)板，0.15mL/孔，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4～5d后，顯微鏡下可觀察克隆細胞的形成，記錄只有單個克隆生長孔，8～9d時取細胞上清，及時進行ELISA檢測。選擇陽性的單克隆細胞再進行同樣的亞克隆3次以上，直至所有細胞孔上清液檢測均為陽性、且各孔檢測OD值較接近；將多次亞克隆培養(yǎng)后的陽性細胞擴大培養(yǎng)和凍存，獲得穩(wěn)定分泌微囊藻毒素單克隆抗體的雜交瘤細胞株命名為6G7。

實施例3生產(chǎn)抗微囊藻毒素單克隆抗體的腹水

BALB/c小鼠腹腔接種液體石蠟，每只小鼠0.5mL。兩周后，腹腔接種用無血清培養(yǎng)基稀釋的雜交瘤細胞，每只小鼠5×10⁵個/0.2mL。間隔8天后，每天觀察小鼠腹水產(chǎn)生情況，待腹水盡可能多而小鼠瀕于死亡時，處死小鼠，無菌條件下將腹水吸出。室溫靜止30min，10000rpm，離心10min，收集上清，分裝，-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

實施例4抗微囊藻毒素單克隆抗體的純化(見圖1)

純化方案為辛酸-硫酸銨沉淀法。取1份預處理過的腹水加2份0.06mol/L pH4.0醋酸緩沖液，用1mol/L HCl調(diào)pH至4.5；按每毫升稀釋腹水加11μL辛酸的比例，室溫攪拌下逐滴加入辛酸，于30min內(nèi)加完，4℃靜置2h，取出12000rpm離心30min，棄沉淀；上清經(jīng)尼龍篩過濾(125μm)，加入1/10體積的0.1mol/L PBS，用1mol/L NaOH調(diào)pH至7.2；在4℃下加入飽和硫酸銨至45％飽和度，輕輕混勻30min，靜置1h；12000rpm離心30min，棄上清；沉淀溶于適量PBS中，對50-100倍體積的PBS透析，4℃過夜；取出12000rpm離心30min，除去不溶性沉淀，分裝，凍存?zhèn)溆谩?/p>

實施例5抗微囊藻毒素單克隆抗體的腹水效價測定

用PBS緩沖液1∶100稀釋單克隆抗體腹水，然后進行倍比稀釋，加入MC-LR-OVA包被的酶標板，100μL/孔，37℃，孵育30min；PBST洗滌3次，每次1min，最后一次拍干；加入1∶12000稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃，孵育30min；PBST洗滌5次每次1min，最后一次拍干；加入底物TMB-H₂O₂，100μL/孔，室溫避光顯色15min；每孔加入50μL2mol/L硫酸終止反應；用酶標儀測定OD450nm值。以陰性OD450nm值小于0.2，檢測孔與陰性OD450nm值的比值大于2.1判為陽性，以陽性孔的最大稀釋度作為單克隆抗體的腹水效價。結(jié)果顯示，6G7細胞株腹水間接ELISA效價為6.05×10⁵。

實施例6抗微囊藻單克隆抗體抑制濃度IC₅₀的測定以及半抑制濃度曲線繪制(圖2)

經(jīng)過點陣法確立，包被原濃度為0.1μg/mL，抗MC-LR單抗稀釋倍數(shù)為65000倍，酶標二抗?jié)舛葹?:12000稀釋，抗原抗體反應時間為35min，酶標反應時間為30min，TMB底物顯色時間為15min，MC-LR標準品藥物濃度設定范圍為0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6ng/mL。每孔加入50μL2mol/L硫酸終止反應。用酶標儀測定OD450nm值。采用酶免軟件進行統(tǒng)計，計算IC₅₀值并繪制半抑制濃度曲線。

實施例7抗體亞型的鑒定

用商業(yè)化的鼠源單克隆抗體亞型試劑盒進行測試。首先用PBS將腹水進行稀釋，至抗體濃度為0.1～1μg/mL，取150μL加入測試管。15～25℃，30s，然后搖動渦旋管子，使管內(nèi)藍色膠質(zhì)充分懸浮，插入試紙條，5～10min后，參照陽性對照，出現(xiàn)藍色條帶處即為該抗體亞型類別。該單克隆抗體的亞型為IgG2b，輕鏈為κ鏈。

以上所述的實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點，其目的在于使本領域內(nèi)的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，不能僅以本實施例來限定本發(fā)明的專利范圍，即凡本發(fā)明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。