本發(fā)明涉及以原核表達(dá)的P53蛋白免疫小鼠獲得的分泌P53單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株6C4，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

P53基因是一種腫瘤抑制基因（或抑癌基因），是最早發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因之一。P53 基因位于人類17號(hào)染色體短臂上（17P13），大約長2萬個(gè)堿基，是一條53KD的由393個(gè)氨基酸組成的富含磷酸基的核蛋白（因此命名為P53），其編碼的蛋白質(zhì)分為野生和突變兩種亞型。

P53蛋白主要分布于細(xì)胞核漿，能與DNA特異結(jié)合，其活性受磷酸化、乙?；⒓谆?、泛素化等翻譯后修飾調(diào)控。P53蛋白在細(xì)胞周期捕獲，DNA修復(fù)，細(xì)胞衰老、分化、調(diào)亡等過程中都起著重要的作用，它能修復(fù)損傷細(xì)胞，或者除去嚴(yán)重?fù)p傷的細(xì)胞從而避免這些細(xì)胞對(duì)機(jī)體的危害作用。有P53基因缺陷的細(xì)胞沒有這種控制，甚至在不利條件下繼續(xù)分裂。細(xì)胞中P53蛋白被稱為基因衛(wèi)士，在G1期檢查DNA損傷點(diǎn)，監(jiān)視基因組的完整性。如有損傷，P53蛋白阻止DNA復(fù)制，以提供足夠的時(shí)間使損傷DNA修復(fù)；如果修復(fù)失敗，P53蛋白則引發(fā)細(xì)胞凋亡。

P53基因突變后，由于其空間構(gòu)象發(fā)生改變，失去了對(duì)細(xì)胞生長、凋亡和DNA 修復(fù)的調(diào)控作用。如果p53基因的兩個(gè)拷貝都發(fā)生了突變，對(duì)細(xì)胞的增殖失去控制，導(dǎo)致細(xì)胞癌變，P53基因由抑癌基因轉(zhuǎn)變?yōu)榘┗?。引起腫瘤形成或細(xì)胞轉(zhuǎn)化的P53蛋白是P53基因突變的產(chǎn)物，是一種腫瘤促進(jìn)因子，它可以消除正常P53蛋白的功能。

P53基因是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，研究表明，半數(shù)以上的實(shí)體瘤細(xì)胞均存在P53蛋白的基因突變或功能喪失，目前發(fā)現(xiàn)的與p53基因突變有關(guān)的腫瘤有肝癌、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、軟組織肉瘤、卵巢癌、腦瘤、淋巴細(xì)胞腫瘤、食道癌、肺癌、成骨肉瘤等。若p53基因常在腫瘤發(fā)生的早期發(fā)生突變，則有助于腫瘤的早期診斷，另外p53基因突變者多對(duì)放化療反應(yīng)差，也容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，可作為治療療效和預(yù)后判定的指標(biāo)，所以免疫組化檢測突變型P53，對(duì)于各種惡性腫瘤的研究具有重要作用。

目前，國內(nèi)外已經(jīng)獲得了多種小鼠抗人P53的單克隆抗體用于免疫組化檢測突變型P53，但制備表達(dá)量更多，親和性更好，稀釋度更高，具有更多優(yōu)良特性的P53單克隆抗體對(duì)于各類腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究、量化P53蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用、腫瘤的診斷治療和預(yù)后評(píng)價(jià)以及檢測P53蛋白藥物在動(dòng)物體內(nèi)分布代謝研究都有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種高親和性的、可用于科研或臨床免疫組化檢測P53表達(dá)的小鼠抗人P53單克隆抗體及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

（1）根據(jù)P53的基因序列（BC003596.1）的編碼框，設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物，Trizol Reagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴(kuò)增P53基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體PET28a-P53，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)并親和純化蛋白作為抗原。

（2）采用經(jīng)典的細(xì)胞融合技術(shù)制備P53單克隆抗體，親和層析純化抗體蛋白，SDS-PAGE測定抗體純度，直接ELISA 法測定純化抗體的滴度。

（3）通過免疫組織化學(xué)分析P53單克隆抗體染色人乳腺癌石蠟切片。

（4）根據(jù)抗體基因的恒定區(qū)序列合成特異性引物，PCR擴(kuò)增單克隆抗體P53重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，回收目的片段，克隆到pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl細(xì)胞后篩選陽性克隆，抽提質(zhì)粒后測序確定了單克隆抗體P53的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。

本發(fā)明提供的以原核表達(dá)的P53蛋白為抗原、免疫小鼠獲得的分泌P53單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，名稱為6C4，該細(xì)胞株6C4已于2012年11月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所），保藏編號(hào)為CGMCC No. 6916。

本發(fā)明還提供了所述雜交瘤細(xì)胞株6C4 CGMCC No. 6916產(chǎn)生的單克隆抗體。該抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，重鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:9，輕鏈可變區(qū)氨基酸序列為SEQ ID NO:10。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

本發(fā)明應(yīng)用重組人的P53蛋白為免疫抗原，免疫Balb/c小鼠, 采用經(jīng)典的細(xì)胞融合技術(shù)，通過ELISA篩選，獲得一株能穩(wěn)定分泌抗P53的雜交瘤細(xì)胞株，命名為6C4，亞型鑒定為IgG1，將雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)后收集上清，采用Protein A親和層析法對(duì)P53單抗進(jìn)行純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化后抗體純度在95%以上; ELISA 滴度測定結(jié)果顯示，單抗的滴度均在1∶10000以上。人乳腺癌石蠟切片經(jīng)抗P53抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到細(xì)胞核出現(xiàn)均勻著色的棕褐色顆粒，背景清晰，無非特異性著色。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上來看，本發(fā)明制備了高效價(jià)，高特異性的P53單克隆抗體，用該抗體檢測證實(shí)，其對(duì)細(xì)胞中的P53蛋白具有高識(shí)別能力，可用于科研或臨床免疫組化檢測P53表達(dá)。P53陽性者說明預(yù)后不良，同時(shí)可作為細(xì)胞凋亡中的一個(gè)調(diào)控因子。

附圖說明

圖1 SDS-PAGE 分析純化后的P53單克隆抗體。

圖2 ELISA 法測定P53單克隆抗體滴度。

圖3免疫組織化學(xué)檢測分析P53單克隆抗體染色人乳腺癌石蠟切片。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常施方法。

實(shí)施例1：雜交瘤細(xì)胞株6C4及其產(chǎn)生的單克隆抗體的獲得

1、抗原制備

（1）獲得目的基因

在該實(shí)施例中，根據(jù)P53的基因序列（BC003596.1）的編碼框，設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物：

引物1 ：5'- CGCGGATCCATGGAGGAGCCGCAGTCAG-3' (SEQ ID NO:1)

引物2 ：5'- CCGCTCGAGGGCCCTTCTGTCTTGAACATG-3'；(SEQ ID NO:2)

Trizol Reagent試劑提取人脂肪組織總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并以cDNA為模板PCR擴(kuò)增P53基因。

（2）構(gòu)建重組表達(dá)載體

將步驟（1）獲得的PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4 DNA連接酶作用下連接入表達(dá)載體PET28a，構(gòu)建重組質(zhì)粒PET28a-P53。

（3）獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種

將步驟（2）獲得的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)，用含有硫酸卡那霉素的固體培養(yǎng)基篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。測序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確，進(jìn)入下步操作。以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。

（4）誘導(dǎo)表達(dá)和蛋白純化

將步驟（2）提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)，用含有硫酸卡那霉素的固體培養(yǎng)基篩選，挑選單克隆至10ml含有硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃，220rpm培養(yǎng)10h，取5ml液體培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至250ml的大瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)至OD值為0.8，加入0.2mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，16℃誘導(dǎo)過夜，收集菌液超聲，取上清用Ni-NTA瓊脂糖親和層析法純化P53蛋白。

2、單抗的制備和純化

(1)、免疫動(dòng)物

一般選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行三次免疫注射。

首次免疫，純化的重組蛋白P53（用適量生理鹽水稀釋）+完全弗氏佐劑，100μg/只，頸背部皮下多點(diǎn)注射；

二次免疫（間隔兩周），純化的重組蛋白P53（用適量生理鹽水稀釋）+不完全弗氏佐劑，100μg/只，頸背部皮下多點(diǎn)注射；

三次免疫（間隔兩周），純化的重組蛋白P53（用適量生理鹽水稀釋），不完全弗氏佐劑，100μg/只，頸背部皮下多點(diǎn)注射；

三次免疫后7~10天采血，用建立的ELISA法檢測效價(jià)，選擇效價(jià)最高者用于細(xì)胞融合。

加強(qiáng)免疫（融合前3天），用純化的重組蛋白50μg腹腔注射。3天后，取脾臟融合。

(2)、細(xì)胞融合

采用眼球摘除放血法處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液。將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞SP2/0與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合（1:5~1:10），并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。采用HAT選擇性培養(yǎng)基，進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)和篩選。

用ELISA方法檢測雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清：以純化的P53蛋白（10μg/ml）包被酶標(biāo)板，每孔100μl，4℃包板過夜。甩掉包被液，加入200μl 5%的脫脂奶粉，37℃封閉1h后，洗滌3次，加雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)檢測上清100μl（陰性對(duì)照為PBS 100μl），37℃孵育1小時(shí)。洗滌3遍后，加酶標(biāo)記二抗（羊抗鼠 IgG-HRP），37℃孵育1小時(shí)，去掉酶標(biāo)二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50μl，室溫靜置5分鐘，加終止液50μl。用酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的OD值。OD值明顯高于陰性對(duì)照2倍以上者定為陽性。最后篩選得到一株分泌性能最佳的抗P53雜交瘤細(xì)胞株，命名為6C4，亞型鑒定為IgG1。

將選出的陽性雜交瘤細(xì)胞株6C4克隆化培養(yǎng)（有限稀釋法），獲得能產(chǎn)生高效價(jià)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆。將雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，并凍存保種。所述的陽性雜交瘤細(xì)胞為抗人P53雜交瘤細(xì)胞系6C4，該細(xì)胞系已保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 6916。

(3)單克隆抗體的大量制備與純化

將步驟（2）獲得的細(xì)胞株6C4接種至Balb/c小鼠腹腔，制備腹水，然后從腹水中提取抗體。

單克隆抗體P53的純化：采用Protein A親和層析法。首先制備protein A親和柱，用PBS平衡柱子后，取抗P53的腹水過柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液（PH）洗脫，收集峰值區(qū)的洗脫液，經(jīng)透析濃縮后備用。SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化后抗體純度在95%以上(參見圖1)。

(4) 直接ELISA 法測定純化抗體的滴度

以純化的P53蛋白（10μg/ml）包被酶標(biāo)板，每孔100μl，4℃包板過夜。甩掉包被液，加入200μl 5%的脫脂奶粉，37℃封閉1h后，洗滌3次，將純化的抗體按1: 200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800 進(jìn)行稀釋，以每孔100μl 加入酶標(biāo)板中（陰性對(duì)照為PBS 100μl），37℃孵育1小時(shí)。洗滌3遍后，加酶標(biāo)記二抗（羊抗鼠 IgG-HRP），37℃孵育1小時(shí)，去掉酶標(biāo)二抗，洗滌3遍，加底物顯色劑50μl，室溫靜置5分鐘，加終止液50μl。用酶標(biāo)儀檢測450nm波長處的OD值。ELISA 滴度測定結(jié)果顯示，單抗的滴度均在1:10000以上（參見圖2）。

實(shí)施例2：單克隆抗體鑒定及應(yīng)用

1、小鼠抗P53單克隆抗體的鑒定

裂解提取cos-7細(xì)胞裂解液，上樣至10%的SDS-PAGE膠孔中，20μg/孔，電泳后將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉后，用抗P53抗體進(jìn)行免疫染色，加入實(shí)施例1步驟（3）制備并純化的P53單克隆抗體，工作濃度設(shè)為1:40000，4℃過夜，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體，工作濃度1: 5000，于37℃反應(yīng) lh，結(jié)果出現(xiàn)一條分子量為55KDa的條帶（參見圖3），與文獻(xiàn)報(bào)道相符，證明此抗體為抗P53的特異性抗體；圖片顯示抗體1:40000稀釋后條帶依然清晰，證明本單抗效價(jià)極高。

2、免疫組化應(yīng)用檢測

用P53單抗，按常規(guī)法作病理切片，對(duì)人乳腺癌石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色。

具體方法為：

(1) 脫蠟

切片依次置于二甲苯I、II、III脫蠟每次5分鐘，移至無水乙醇I、II中各浸泡4分鐘，移至95%酒精中浸泡4分鐘，移至85%酒精中浸泡4分鐘，再移至70%酒精中浸泡4分鐘，流水沖洗2分鐘。

(2) 抗原修復(fù)

將已沖洗干凈組織切片放入高壓鍋內(nèi)，加入約3000ml左右的EDTA抗原修復(fù)液（pH7.4），高火加熱煮沸后調(diào)至低火保持沸騰噴氣3分鐘，關(guān)掉電磁爐開關(guān)，兩分鐘后將高壓鍋移至冷水中冷卻，待高壓鍋內(nèi)抗原修復(fù)液完全冷卻后，打開高壓鍋將組織切片用流水沖洗干凈移至蒸餾水中浸泡2分鐘。

(3) 阻斷

3%H₂O₂中浸泡10分鐘，流水沖洗蒸餾水沖洗。取出切片，擦干組織周圍的水，用免疫組化筆在組織塊周圍畫一圓圈注意圈接頭要接好，防止抗體跑出圈外造成假陰性。PBS緩沖液沖洗。

(4) 滴加一抗

甩去待測組織切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗為實(shí)施例1步驟（3）制備并純化的P53單克隆抗體，稀釋度為1 : 300。放置在孵育盒內(nèi)4℃冰箱中過夜孵育約12小時(shí)。

(5) 滴加二抗

將孵育盒從冰箱取出，恢復(fù)至室溫后取出切片，用PBS洗3次，每次5分鐘。滴加通用型二抗-HRP聚合物。將切片放入孵育濕盒中，蓋上蓋子，連孵育盒一起放入37℃恒溫箱中孵育30分鐘。

(6) 顯色、襯染、封片

取出切片，擦掉組織周圍的多余的PBS，加入DAB顯色液中顯色3～5分鐘，在顯微鏡下控制染色的強(qiáng)度。待強(qiáng)度適中后將切片置自來水中終止顯色，再用流水沖洗5～10分鐘，蘇木素染液復(fù)染1分鐘，0.5%鹽酸酒精分化3秒鐘，流水沖洗5～10分鐘，脫水、透明、封片、鏡檢。

結(jié)果判定：按照國外學(xué)者對(duì)組織中P53的判定標(biāo)準(zhǔn)，P53蛋白陽性反應(yīng)為黃到棕黃色或棕褐色細(xì)小顆粒，定位于細(xì)胞核。人乳腺癌（參見圖3）經(jīng)抗P53抗體免疫組化染色，可于光鏡下觀察到胞核內(nèi)呈均勻著色的棕褐色顆粒，背景清晰，無非特異性著色，說明此P53小鼠單克隆抗體可以特異性的應(yīng)用于免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)。

實(shí)施例3：單克隆抗體可變區(qū)測序

根據(jù)抗體基因的恒定區(qū)序列合成以下引物：

zh08 5'-GGGGATATCCACCATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT-3'(SEQ ID NO:3)

zhr11 5'-GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3'(SEQ ID NO:4)

zl01 5'-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3'(SEQ lD NO:5)

zlr05 5'-GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3' (SEQ ID NO:6)

Trizol Reagent試劑分別提取5×10⁶雜交瘤細(xì)胞6C4的總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA。用zh08和zhr11為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增單克隆抗體P53重鏈可變區(qū)，用zl01和zlr05為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增單克隆抗體P53輕鏈可變區(qū)，PCR反應(yīng)均采用熱啟動(dòng)，反應(yīng)條件: 94℃ 5分鐘；94℃ 45 秒，60℃ 45 秒，72℃ 1分10 秒，30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 分鐘。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后回收純化目的片段（輕鏈長度392 bp，重鏈長度310 bp）?？寺〉絧GEM-T(Promega)載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl細(xì)胞后在 IPTGIX-gal平板上進(jìn)行篩選，取白色菌斑接種于含有氨韋青霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中擴(kuò)增。篩選陽性克隆，用 QIAGEN 的質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒并進(jìn)行測序，確定了單克隆抗體P53的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列。

單克隆抗體P53可變區(qū)的 DNA 序列和氨基酸序列：

單克隆抗體6C4重鏈可變區(qū)基因序列(5'→3'，310bp) (SEQ ID NO:7)；

單克隆抗體6C4的輕鏈可變區(qū)基因序列(5'→3'，392bp) (SEQ 1D NO:8)；

單克隆抗體6C4重鏈可變區(qū)的推斷氨基酸序列 (103氨基酸) (SEQ ID NO:9) ；

單克隆抗體6C4輕鏈可變區(qū)的推斷氨基酸序列(130 氨基酸) (SEQ 10 NO:10)。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津三箭生物技術(shù)股份有限公司

<120> 小鼠抗人P53單克隆抗體及分泌該抗體的雜交瘤細(xì)胞株

<130> DNA

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 引物

<400> 1

cgcggatcca tggaggagcc gcagtcag 28

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物

<400> 2

ccgctcgagg gcccttctgt cttgaacatg 30

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物

<400> 3

ggggatatcc accatgract tcgggytgag ctkggtttt 39

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

gachgatggg gstgtygtgc tagctgnrga gacdgtga 38

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物

<400> 5

ggggatatcc accatggaga cagacacact cctgctat 38

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物

<400> 6

ggatacagtt ggtgcagtcg acttacgttt katttccarc tt 42

<210> 7

<211> 310

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 7

cgacttttgt tggtcactat ctggtgtggg tgtaggctgc catctcgtca ccaattcagg 60

gaagggtctg gagtggctgg cacacatttg gtgggatgat gacaagagct ataacccagc 120

cctgaagagt cgactgacaa tctccaagga tacctccacc aatcaggtat tcctcaagat 180

cgccagtgtg gacactgcag atactgccac atattattgt gctcggatga ctacggctac 240

gtttgcttac tggggccagg ggactctggt cacagtctcc ccagctagca caacaccccc 300

catcagtcaa 310

<210> 8

<211> 392

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 8

ggaggtatgc tgctctgggt caggttccac tggtgacatt gtgctgacac agtctcctgc 60

ttccttagct gtatctctgg ggcagagggc caccatctca tacagggcca gcaaaagtgt 120

cagtacatct ggctatagtt atatgcactg gaaccaacag aaaccaggac agccacccag 180

actcctcatc tatcttgtat ccaacctaga atctggggtc cctgccaggt tcagtggcag 240

tgggtctggg acagacttca ccctcaacat ccatcctgtg gaggaggagg atgctgcaac 300

ctattactgt cagcacatta gggagcttac acgttcggag gggggaccaa gctggaaatc 360

aaacgtaagt cgactgcacc aaactgtata ca 392

<210> 9

<211> 103

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 9

Asp Phe Cys Trp Ser Leu Ser Gly Val Gly Val Gly Cys His Leu Val

1 5 10 15

Thr Asn Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp

20 25 30

Asp Asp Lys Ser Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser

35 40 45

Lys Asp Thr Ser Thr Asn Gln Val Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp

50 55 60

Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Thr Thr Ala Thr

65 70 75 80

Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Pro Ala Ser

85 90 95

Thr Thr Pro Pro Ile Ser Gln

100

<210> 10

<211> 130

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 10

Glu Val Cys Cys Ser Gly Ser Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr

1 5 10 15

Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile

20 25 30

Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met

35 40 45

His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

50 55 60

Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

65 70 75 80

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu

85 90 95

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Ser

100 105 110

Glu Gly Gly Pro Ser Trp Lys Ser Asn Val Ser Arg Leu His Gln Thr

115 120 125

Val Tyr

130