本發(fā)明涉及分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，還涉及所述雜交瘤細(xì)胞系及其分泌的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體在口蹄疫診斷或防治中的應(yīng)用，屬于口蹄疫的防治領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,FMDV)屬于小RNA病毒科口蹄疫病毒屬的成員，為單股正鏈RNA，其基因組RNA全長(zhǎng)約8.5kb?？谔阋?foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的，主要侵害牛、豬、羊等家畜及多種野生偶蹄動(dòng)物的高度接觸性傳染病，人也可以感染。該病引起幼畜死亡、產(chǎn)奶量下降、肉食減少、肉品下降、動(dòng)物的生產(chǎn)性能降低，而且具有極強(qiáng)的傳染性，可形成大范圍流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。預(yù)防和控制口蹄疫的關(guān)鍵是高效疫苗和準(zhǔn)確的診斷方法的應(yīng)用。

口蹄疫病毒有7個(gè)血清型，分別為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial，各血清型之間無交叉免疫保護(hù)。目前，中國(guó)主要流行O型、A型和Asial型FMD?？谔阋卟《镜目乖Y(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，不同血清型、基因型和分離株的抗原位點(diǎn)和抗原表位都不盡相同，存在廣泛的抗原變異。因此，開發(fā)口蹄疫病毒共享型單克隆抗體，對(duì)于口蹄疫的診斷和防治等均具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是提供一株分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體3D9的雜交瘤細(xì)胞系以及其分泌的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體3D9；

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是將上述分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體3D9的雜交瘤細(xì)胞系及其分泌的單克隆抗體3D9應(yīng)用于口蹄疫的診斷或防治。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明首先公開了一株分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體3D9的雜交瘤細(xì)胞系。

本發(fā)明用滅活并純化的O型口蹄疫病毒抗原免疫BALB/c鼠，將免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞?？贵w陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞經(jīng)3次有限稀釋法亞克隆，最終獲得三株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為3D9、4A7和7E2。經(jīng)IFA特異性鑒定，單抗3D9為一株血清型共享性單抗，其與O型、A型和Asia1型口蹄疫病毒抗原均有反應(yīng)；而單抗4A7和7E2僅與O型毒株均呈陽(yáng)性反應(yīng)，為O型毒株特異性單抗。

本發(fā)明將分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體3D9的雜交瘤細(xì)胞系提交專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號(hào)為：CGMCC No.13293；分類命名為：分泌FMDV共享型單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏時(shí)間是2016年11月25日；保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了由所述雜交瘤細(xì)胞系分泌的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體3D9。免疫球蛋白亞類鑒定顯示，單抗3D9重鏈類型為IgG2_b，輕鏈為κ類型。微量細(xì)胞中和試驗(yàn)表明，單抗3D9無中和活性。

本發(fā)明所述分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體3D9的雜交瘤細(xì)胞系或其分泌的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體3D9能夠應(yīng)用于制備診斷、預(yù)防或治療口蹄疫的試劑或藥物。其中，所述口蹄疫包括由O型、A型或Asia1型口蹄疫病毒引起的口蹄疫中的任意一種或多種。

本發(fā)明還公開了所述分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體3D9的雜交瘤細(xì)胞系或其分泌的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體3D9在制備口蹄疫病毒抗原或抗體檢測(cè)的試劑中的應(yīng)用。其中，所述口蹄疫病毒包括：O型、A型或Asia1型口蹄疫病毒。

本發(fā)明以?？笷MDV多抗作為捕獲抗體、單抗3D9純化標(biāo)記后作為檢測(cè)抗體，分析了3D9作為檢測(cè)抗體在口蹄疫病毒抗原檢測(cè)中的應(yīng)用效果。結(jié)果表明，單抗3D9可用于FMDV抗原的特異性檢測(cè)，對(duì)A型FMDV細(xì)胞毒的最低檢出量為1.8×10⁴TCID₅₀，對(duì)O型FMDV細(xì)胞毒的最低檢出量為7.9×10³TCID₅₀。為檢驗(yàn)單抗3D9在口蹄疫病毒抗體檢測(cè)中的應(yīng)用效果，本發(fā)明使用兩株FMDV血清型共享的單抗3D9和4B2，以4B2作為包被抗體、HRP標(biāo)記的3D9作為檢測(cè)抗體建立固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，分別檢測(cè)系列稀釋的A、O和Asia1型FMDV的陰性和陽(yáng)性血清，計(jì)算反應(yīng)的抑制百分率。結(jié)果表明，用單抗3D9建立的固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法能夠特異性區(qū)分三種血清型FMDV的陰性和陽(yáng)性血清。以上結(jié)果證明，本發(fā)明所述口蹄疫病毒共享型單克隆抗體3D9及分泌3D9單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，能夠用于FMDV病原診斷和抗體檢測(cè)。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種用于口蹄疫病毒抗原檢測(cè)的抗原捕獲ELISA試劑盒，包括：包被捕獲抗體的固相載體、檢測(cè)抗體、口蹄疫病毒陰性對(duì)照抗原、口蹄疫病毒陽(yáng)性對(duì)照抗原、封閉液、洗滌液、底物溶液和終止液。其中，所述檢測(cè)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體3D9，其最佳使用濃度為0.9μg/ml；所述捕獲抗體為牛抗口蹄疫病毒多克隆抗體，其最佳包被濃度為2.5μg/mL。所述洗滌液為0.05％Tween-20PBS(PBST)溶液；所述封閉液為5％脫脂乳PBST溶液；所述底物溶液為TMB底物溶液；所述終止液為2M H₂SO₄。所述口蹄疫病毒包括：O型、A型或Asia1型口蹄疫病毒。

本發(fā)明還公開了一種用于口蹄疫病毒抗體檢測(cè)的固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒，包括：包被包被抗體的固相載體、檢測(cè)抗體、口蹄疫病毒抗原、洗滌液、底物溶液和終止液。其中，所述檢測(cè)抗體為辣根過氧化物酶標(biāo)記的口蹄疫病毒共享型單克隆抗體3D9，所述包被抗體為抗口蹄疫病毒的單克隆抗體4B2。所述洗滌液為PBST溶液；所述底物溶液為TMB底物溶液；所述終止液為2M H₂SO₄。所述口蹄疫病毒包括：O型、A型或Asia1型口蹄疫病毒。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明篩選獲得一株FMDV共享型單克隆抗體3D9，IFA鑒定表明其與O型、A型和Asia1型口蹄疫病毒抗原均有反應(yīng)。本發(fā)明以單抗3D9作為檢測(cè)抗體，能夠用于FMDV抗原的特異性檢測(cè)；利用單抗3D9建立的固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法能夠特異性區(qū)分A、O和Asia1三種血清型FMDV陰性和陽(yáng)性血清。本發(fā)明所述口蹄疫病毒共享型單克隆抗體3D9及分泌單克隆抗體3D9的雜交瘤細(xì)胞系在口蹄疫的診斷或防治中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為IFA檢測(cè)單抗3D9與A型、O型、Asia1型FMDV毒株的反應(yīng)；其中，Positive Control為陽(yáng)性對(duì)照，Cell Control為BHK細(xì)胞對(duì)照；

圖2為用固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)A、O和Asia1型FMDV的強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性血清的抑制百分率變化曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1 FMDV各血清型毒株共享單克隆抗體的制備和鑒定

1、材料和方法

1.1病毒、細(xì)胞、菌株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

用于IFA進(jìn)行單抗特異性分析的毒株包括：A FMDV A/KT/58(GenBank accession number:AJ131665)，A FMDV A/JLYS/CHA/2014，A/XJBC/CHA/2010，Asia1 FMDV Asia1/YS/CHA/05(GU931682)，O/YS/CHA/05(HM008917)，O FMDV O/Tibet/CHA/99(AJ539138)，O/GD/86(AJ131468)(Wang H,Zhao L,Li W,Zhou G,Yu L(2011)Identification of a conformational epitope on the VP1 G-H Loop of type Asia1 foot-and-mouth disease virus defined by a protective monoclonal antibody.Vet Microbiol 148:189-199.)；乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞BHK-21、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞為本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存；清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。MAb 4B2由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存。A型、O和Asia1型FMDV的高免牛血清多抗及其離子交換層析純化抗體，由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2主要試劑

融合劑PEG/DMSO(Mw，1450)、HAT鹽(50x)、HT鹽(50x)、HRP或FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑購(gòu)自Sigma公司；單克隆抗體亞類鑒定試劑盒購(gòu)自Southern Biotech公司；L-谷氨酰胺(glutamine)、甘氨酸購(gòu)自Amresco公司；二甲基亞砜(DMSO)、鄰苯二胺(OPD)、PEG6000購(gòu)自Solarbio公司；高糖DMEM干粉購(gòu)自GIBCO公司；進(jìn)口優(yōu)級(jí)胎牛血清(PAA)購(gòu)自西班牙Nalgene公司；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自加拿大JET Biochemical公司。

1.3鼠免疫與單克隆抗體的制備

(1)將O型FMDV接種于BHK-21細(xì)胞單層，待75％以上細(xì)胞出現(xiàn)病變后收毒。將收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)凍融三次，裂解細(xì)胞釋放病毒。凍融后的病毒液加入1∶1000TritonX-100和4∶10000甲醛裂解與滅活48h以上，取滅活過的病毒液1mL接種BHK-21細(xì)胞盲傳三代、檢測(cè)滅活是否徹底。將經(jīng)凍融裂解后的培養(yǎng)液9000rpm(Beckman高速離心機(jī)，JA-10轉(zhuǎn)子)、4℃離心90min，回收病毒液上清，棄去細(xì)胞沉淀；按病毒液上清的體積加入80g/L的PEG6000和40g/L的NaCl，室溫?cái)嚢?h至完全溶解，4℃過夜沉淀；次日將上清9000rpm、4℃離心90min，棄上清回收沉淀；用NET緩沖液于低溫下將沉淀輕輕重懸，29000rpm、4℃離心2h，在冰盒中用適量的NET緩沖液輕輕重懸沉淀；制備15％～45％均勻線性蔗糖梯度，對(duì)病毒濃縮液進(jìn)行蔗糖密度梯度超速離心，利用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)OD₂₅₉值，根據(jù)公式計(jì)算146S抗原的含量。

(2)純化的O型FMDV抗原(100μg/200uL)加等體積弗氏完全佐劑進(jìn)行充分的乳化，背部皮下注射6周齡雌性BALB/c小鼠；2周后進(jìn)行第2次免疫，佐劑改為弗氏不完全佐劑；2周后，以不加佐劑的等量抗原進(jìn)行第3次免疫。為刺激小鼠快速產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，于融合前3d采用尾靜脈和脾臟注射相結(jié)合的免疫方式進(jìn)行加強(qiáng)免疫，使用二倍劑量的抗原。

(3)細(xì)胞融合

a)飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備：細(xì)胞融合前一天進(jìn)行飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備，眼科剪刀、眼科鑷子、平皿等試驗(yàn)用具用前高溫干熱滅菌，HAT完全培養(yǎng)液做無菌檢驗(yàn)。取2只BALB/c小鼠摘除眼球放血，按常規(guī)方法分離陰性血清。拉頸脫臼處死小鼠，將其浸泡于75％酒精中，10min后移入超凈工作臺(tái)。將小鼠腹部向上固定在鼠架上，用鑷子提起腹正中部皮膚，眼科剪刀橫向剪一小口，切勿剪破腹膜，用剪刀和鑷子上下撕開皮膚，充分暴露腹膜。用鑷子輕輕提起腹膜，將10mL注射器內(nèi)吸取的8-10mL HAT完全培養(yǎng)液注入腹腔，切勿刺破臟器和腸道，注射器不要拔出，在腹腔內(nèi)來回抽吸5-10次，然后用鑷子按摩兩側(cè)腹部30秒左右，再進(jìn)行抽吸，重復(fù)以上操作2-3次。用注射器回吸腹腔內(nèi)液體。注意避開腸系膜及脂肪組織，以免堵塞針頭。將從2只鼠中取出的腹腔細(xì)胞加入55mL HAT培養(yǎng)液中，吹散混勻細(xì)胞，以100μL/孔分裝于6塊96孔培養(yǎng)板，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

b)骨髓瘤細(xì)胞的制備：融合前36-48h，將骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。融合當(dāng)天，用15mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞從瓶壁上吹下，收集于50mL離心管中，1000rpm離心10min。將細(xì)胞沉淀重懸置20mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，混勻。取少量骨髓瘤細(xì)胞懸液，臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)，備用。

c)免疫脾細(xì)胞的制備：融合前摘除小鼠眼球采血，制備陽(yáng)性血清。將小鼠拉頸脫臼致死，浸泡于75％酒精中，10min后放于超凈臺(tái)。無菌打開腹腔，分離結(jié)締組織并取出脾臟，將脾臟放入裝有滅菌尼龍網(wǎng)和盛有15mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液的平皿中，用滅菌玻璃注射器內(nèi)芯研磨脾臟，使脾細(xì)胞全部通過網(wǎng)孔進(jìn)入平皿中。將脾細(xì)胞溶液轉(zhuǎn)入50mL離心管中，加DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液大約至30mL，混勻，1000rpm離心8min，棄上清。將細(xì)胞沉淀懸于10mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，混勻。取細(xì)胞懸液，臺(tái)盼蘭染色計(jì)數(shù)，備用。

d)脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合：取65mL HAT培養(yǎng)液，15mL基礎(chǔ)DMEM培養(yǎng)液和1mL 50％PEG于37℃水浴中預(yù)熱，另備200mL燒杯盛有37℃的水。按5份脾細(xì)胞數(shù)加1份骨髓瘤細(xì)胞數(shù)取相應(yīng)細(xì)胞懸液量，加入50mL玻璃離心管中，補(bǔ)加DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液至30mL，混勻。1 000rpm離心10min，棄上清，盡可能倒干。用手掌輕擊離心管底部，使沉淀細(xì)胞松散均勻呈糊狀。將離心管放入盛有37℃水的200mL燒杯中，一手均勻轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，另一手用1mL巴氏吸管吸取37℃50％PEG溶液1mL，1min內(nèi)加完，靜置2min。隨后先慢后快地加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止反應(yīng)，37℃水浴靜置10min。1000rpm離心10min，棄上清，加入65mL HAT培養(yǎng)基，輕輕地吹散細(xì)胞，每孔0.1mL接種于已培養(yǎng)有飼養(yǎng)細(xì)胞的6塊96孔培養(yǎng)板，置37℃、5％的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5d后半量換液，8d后全換液，待克隆長(zhǎng)至孔底面積1/4-1/3時(shí)取上清進(jìn)行檢測(cè)并換HT培養(yǎng)液。

1.4抗體檢測(cè)ELISA

用提純的病毒抗原包被96孔板，加入100uL雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃溫育1h后洗滌，加入1:5000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，洗滌后加入底物TMB避光顯色10min，于波長(zhǎng)450nm測(cè)定吸光值。

1.5間接免疫熒光

96孔板微孔板培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞至單層，接種口蹄疫病毒4×10³TCID₅₀/孔，出現(xiàn)CPE之前用冷無水乙醇進(jìn)行固定，加入50uL雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，37℃溫育40min后PBS洗滌三次，加入1:200稀釋的FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG抗體，37℃溫育40min，洗滌后在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度。

1.6單克隆抗體的純化

采用辛酸-飽和硫酸銨法對(duì)制備的腹水進(jìn)行純化，操作步驟簡(jiǎn)述如下：

(1)取3ml預(yù)處理過的腹水加6ml醋酸緩沖液(0.06mol，pH4.8)；腹水中加99ul辛酸室溫?cái)嚢?0分鐘，4℃靜置2小時(shí)以上；取出11000rpm離心30分鐘，棄沉淀；上清用2mol/L NaOH調(diào)pH至7.4；

(2)在4℃條件下加入飽和硫酸銨至50％飽和度，冰浴攪拌作用30分鐘，4℃靜置2小時(shí)以上；11000轉(zhuǎn)離心30分鐘，棄上清；沉淀溶于5ml PBS(0.1M，pH7.4)中；

(3)向沉淀懸浮物中邊攪拌邊加適量飽和硫酸銨溶液，使硫酸銨溶液中濃度為30％-40％，冰浴攪拌作用30分鐘，4℃靜止2小時(shí)以上；11000轉(zhuǎn)離心30分鐘，取沉淀，將沉淀融入2ml PBS中；

(4)將沉淀懸浮液裝入透析袋中，在4℃用PBS透析，2小時(shí)換液一次，透析2天。透析完成后，回收透析袋中的純化腹水，紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，用SDS-PAGE進(jìn)行純度檢測(cè)。

再用DEAE-Sephadex A-50(GE公司)柱層析進(jìn)一步純化單克隆抗體，回收純化后的單克隆抗體，紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度，用SDS-PAGE進(jìn)行純度檢測(cè)。

1.7抗原捕獲ELISA方法的建立

1)用pH9.6的碳酸鹽緩沖液包被牛多抗，4℃過夜。用0.05％Tween-20PBS(PBST)洗板3次，每次3min；2)用5％脫脂乳PBST封閉酶標(biāo)板，37℃1h，同上洗板；3)加待檢抗原和陰陽(yáng)性對(duì)照抗原，37℃1h，洗滌方法同上；4)加入HRP標(biāo)記的檢測(cè)mAb，37℃1h，洗滌方法同上；5)加入底物，室溫避光作用10min；6)加2M H₂SO₄(50uL/孔)終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450nm處測(cè)量吸光度A值(OD_450nm值)。

1.8固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)步驟

1)用pH9.6Na₂CO₃緩沖液按使用濃度稀釋包被單抗4B2于ELISA板，50μL/孔，4℃過夜。次日取出ELISA板，棄去液體，用pH7.4PBST洗板5次，甩干；2)用PBST稀釋口蹄疫病毒抗原至使用濃度，50μL/孔，37℃溫育1h，同上洗板5次；3)陰性血清，陽(yáng)性血清自1:8～1:512倍比稀釋，50μL/孔，加入ELISA板中；4)在ELISA板中立即加入用檢測(cè)抗體稀釋液稀釋的HRP-3D9，50μL/孔，充分搖振混勻，37℃溫育1h。此時(shí)，ELISA板中的反應(yīng)體系為100μL；5)同上洗板5次，加入底物溶液TMB，50μL/孔，室溫避光15min。15min后，加入2M H₂SO₄終止液，50μL/孔，終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上讀取OD_450nm值。

結(jié)果判定：通過檢測(cè)已知陰性和陽(yáng)性血清，計(jì)算抑制百分率(Percentage inhibition,PI)。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1一株FMDV各血清型毒株共享單克隆抗體的篩選和鑒定

免疫小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞，用間接ELISA和IFA方法驗(yàn)證其培養(yǎng)上清中的FMDV特異性抗體，陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為：以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)FMDV抗原的OD₄₅₀光吸收值與正常BALB/c小鼠血清、SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)FMDV抗原OD₄₅₀值之比均大于2.1，且雜交瘤細(xì)胞上清與正常BHK-21細(xì)胞不產(chǎn)生熒光反應(yīng)，判為陽(yáng)性?？贵w陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞經(jīng)3次有限稀釋法亞克隆，獲得三株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，分別命名為3D9、4A7和7E2。免疫球蛋白亞類鑒定顯示，單抗3D9重鏈類型為IgG2_b，輕鏈為κ類型。單抗4A7重鏈類型為IgG2_a，輕鏈為κ類型。單抗7E2重鏈類型為IgG2_b，輕鏈為κ類型。微量細(xì)胞中和試驗(yàn)表明，3D9、4A7和7E2均無中和活性。

將單抗3D9培養(yǎng)上清分別與感染A、O和Asia1型FMDV的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)(圖1)，結(jié)果顯示，3D9與A、O、Asia1型毒株均呈陽(yáng)性反應(yīng)，表明3D9為FMDV血清型共享性單抗。而單抗4A7和7E2僅與O型毒株均呈陽(yáng)性反應(yīng)，為O型毒株特異性單抗。

本發(fā)明將能穩(wěn)定分泌FMDV血清型共享性單抗3D9的雜交瘤細(xì)胞系3D9提交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號(hào)為：CGMCC No.13293。

2.2單克隆抗體腹水的純化及標(biāo)記

鑒于單抗3D9的血清型共享性，本發(fā)明進(jìn)一步研究單抗3D9在口蹄疫病毒抗體檢測(cè)中的診斷價(jià)值。將本發(fā)明制備的單抗3D9腹水，經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨方法純化，紫外分光光度計(jì)測(cè)定3D9的濃度為6.23mg/ml?？贵w3D9再經(jīng)DEAE-sephadex a-50離子交換層析進(jìn)一步純化，用改良過碘酸鈉法標(biāo)記HRP。

2.3泛口蹄疫病毒抗原檢測(cè)方法的初步建立

2.3.1包被多抗和檢測(cè)單抗使用濃度的確定

對(duì)包被多抗和檢測(cè)單抗的使用濃度進(jìn)行方正滴定，結(jié)果如表1所示，當(dāng)捕獲?？笷MDV多抗1:1000稀釋(2.5μg/mL)、HRP標(biāo)記檢測(cè)單抗3D9為1：1000稀釋(0.9μg/ml)時(shí)，OD_450nm值接近1.0、而且P/N比值最大。

表1 多抗最佳包被濃度及檢測(cè)單抗最佳使用濃度的方陣滴定結(jié)果

2.3.2敏感性試驗(yàn)

將A型FMDV細(xì)胞毒(TCID₅₀＝10^6.75)和O型FMDV細(xì)胞毒(TCID₅₀＝10^6.5)梯度稀釋，進(jìn)行ELISA檢測(cè)。結(jié)果如表2所示，該方法對(duì)A型FMDV細(xì)胞毒的最低檢出量為1.8×10⁴TCID₅₀，對(duì)O型FMDV細(xì)胞毒的最低檢出量為7.9×10³TCID₅₀。

表2 敏感性實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

2.4檢測(cè)泛FMDV抗體的固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法的初步建立

為檢驗(yàn)單抗3D9及其雜交瘤細(xì)胞系在建立口蹄疫病毒抗體檢測(cè)方法中的應(yīng)用價(jià)值，參照OIE標(biāo)準(zhǔn)方法、應(yīng)用FMDV血清型共享MAb 3D9，初步建立一種用于檢測(cè)泛FMDV抗體的固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，分別檢測(cè)系列稀釋的A、O和Asia1的陰性血清和陽(yáng)性血清，并計(jì)算反應(yīng)的抑制百分率。

結(jié)果如圖2所示，應(yīng)用該固相競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)FMDV A、O和Asia1的強(qiáng)陽(yáng)性、弱陽(yáng)性和陰性血清，其抑制百分率曲線良好，能夠特異性區(qū)分三種血清型FMDV的陽(yáng)性血清與陰性血清。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定，單抗3D9在建立泛口蹄疫病毒抗原及其抗體檢測(cè)方法中具有應(yīng)用價(jià)值。