本發(fā)明屬于免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于口蹄疫病毒3b表位蛋白的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的危害偶蹄動(dòng)物的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病。目前，我國(guó)對(duì)于口蹄疫的防控主要實(shí)行普遍的疫苗免疫、血清學(xué)監(jiān)測(cè)和撲殺政策。因此，從口蹄疫疫苗免疫過(guò)的動(dòng)物中區(qū)分出感染的動(dòng)物至關(guān)重要。對(duì)于口蹄疫的診斷來(lái)說(shuō)一直存在一個(gè)挑戰(zhàn)，存在于滅活疫苗中的非結(jié)構(gòu)蛋白污染而造成的假陽(yáng)性問(wèn)題很難解決。這是由于口蹄疫的滅活疫苗是當(dāng)前使用最為普遍的口蹄疫疫苗。在滅活疫苗的純化過(guò)程中，非結(jié)構(gòu)蛋白不會(huì)完全被除去。當(dāng)動(dòng)物被多次免疫口蹄疫滅活疫苗后，其機(jī)體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)不同程度的非結(jié)構(gòu)蛋白抗體，從而給區(qū)分疫苗免疫動(dòng)物與病毒感染動(dòng)物帶來(lái)了一定的困難。

申請(qǐng)?zhí)枮?01611052512.8的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了“一種?？谔阋?abc抗體發(fā)光檢測(cè)試劑盒”，其公開(kāi)的技術(shù)方案中化學(xué)發(fā)光免疫分析板上包被的是3abc融合蛋白，但是因?yàn)樵跍缁钜呙缰斜厝粫?huì)存在3abc的相關(guān)成分，因此在多次免疫滅活疫苗后，健康動(dòng)物的血清中就會(huì)出現(xiàn)一定程度的3abc抗體，從而引起檢測(cè)的假陽(yáng)性。申請(qǐng)?zhí)枮?01611051539.5的中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)了“一種豬口蹄疫3abc和2c抗體化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒”，其公開(kāi)的技術(shù)方案中化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板上混合包被3abc和2c蛋白，雖然能夠區(qū)分疫苗免疫的豬與口蹄疫感染的豬，但檢出率并不高，只有36.03%，而且不能避免會(huì)有假陽(yáng)性。當(dāng)前也存在利用非結(jié)構(gòu)蛋白3b單克隆抗體檢測(cè)口蹄疫病毒的情況，但大多采用全蛋白，除制備過(guò)程復(fù)雜耗費(fèi)人力物力外，特異性并不高，檢測(cè)結(jié)果假陽(yáng)性較多，而且制備的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，一般都需要1-2h，無(wú)形中增加了時(shí)間成本。因此仍需開(kāi)發(fā)新的檢測(cè)抗原或檢測(cè)方法來(lái)解決該問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

面對(duì)上述難題，本發(fā)明的目的在于提供一種可區(qū)分口蹄疫病毒感染和免疫動(dòng)物的化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，該試劑盒中的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板混合包被3b非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域的兩種表位蛋白3bepi1和3bepi2，首次建立了基于口蹄疫非結(jié)構(gòu)表位蛋白的clia方法，該試劑盒能夠較為準(zhǔn)確地區(qū)分出口蹄疫病毒感染和疫苗免疫動(dòng)物，尤其在免疫過(guò)5次滅活疫苗的動(dòng)物檢測(cè)中，準(zhǔn)確率高達(dá)97.14%，且檢測(cè)用時(shí)較短，在15分鐘內(nèi)即可完成檢測(cè)。

一種基于口蹄疫病毒3b表位蛋白的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，包括化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板、酶標(biāo)抗體、血清稀釋液、化學(xué)發(fā)光底物和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑，其特征在于：所述化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板混合包被口蹄疫病毒3b非結(jié)構(gòu)蛋白區(qū)域中的3bepi1和3bepi2兩種表位蛋白。

進(jìn)一步地，所述3bepi1和3bepi2兩種表位蛋白均經(jīng)基因獲取、表達(dá)載體的構(gòu)建、蛋白的表達(dá)和純化制備而成，其中，在基因獲取過(guò)程中，首先設(shè)計(jì)引物，然后各組引物直接退火形成分別編碼3bepi1和3bepi2表位蛋白的雙鏈dna分子。

更進(jìn)一步地，所述引物的組成包括各表位序列和pre-nick限制性酶切位點(diǎn)；其中，編碼3bepi1的雙鏈dna的引物序列如seqidno：5和seqidno：6所示，編碼3bepi2的雙鏈dna的引物序列如seqidno：7和seqidno：8所示。

進(jìn)一步地，所述3bepi1和3bepi2兩種表位蛋白在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板上的包被條件均為25ng/孔。

更進(jìn)一步地，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板的包被過(guò)程為：用碳酸鹽緩沖液稀釋含有3bepi1和3bepi2表位蛋白的混合液，使混合液中3bepi1和3bepi2的濃度均為250ng/ml；將混合液以100μl/孔加入到化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板上，于4℃過(guò)夜進(jìn)行包被；然后以300μl/孔加入封閉液，于37℃作用2h即完成包被。

進(jìn)一步地，所述酶標(biāo)抗體為hrp標(biāo)記的兔抗牛igg抗體；所述血清稀釋液為pbs緩沖液，其中包含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的吐溫和體積分?jǐn)?shù)為1%的大腸桿菌裂解液；所述化學(xué)發(fā)光底物為0.1mmol/l的魯米諾溶液；所述化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑包含0.07mmol/l的ipp、3mmol/l的h2o2和體積分?jǐn)?shù)為0.002%的tween。

本發(fā)明還提供一種利用上述化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，步驟為：將待檢血清樣品和標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性對(duì)照血清用血清稀釋液稀釋5-40倍，37℃作用5min，再用pbst洗滌，加入用血清稀釋液稀釋20000倍的hrp標(biāo)記的兔抗牛igg抗體，37℃作用5min，經(jīng)pbst漂洗后，加入化學(xué)發(fā)光底物和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑，5min后用化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)儀器檢測(cè)發(fā)光值。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明所述化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒以3bepi1和3bepi2兩種表位蛋白混合包被化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板，首次建立了基于口蹄疫非結(jié)構(gòu)表位蛋白的clia方法，在檢測(cè)感染或免疫動(dòng)物的血清時(shí)具有較強(qiáng)的特異性和免疫原性，進(jìn)而在相關(guān)試劑和檢測(cè)方法的配合下，能夠較為準(zhǔn)確地區(qū)分出口蹄疫病毒感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物，假陽(yáng)性概率極低，尤其在免疫過(guò)5次滅活疫苗的動(dòng)物檢測(cè)中，準(zhǔn)確率高達(dá)97.14%。而且，該試劑盒檢測(cè)方法用時(shí)較短，在15分鐘內(nèi)即可完成檢測(cè)，相對(duì)于常規(guī)試劑盒1-2h的檢測(cè)時(shí)間，大大節(jié)約了時(shí)間成本，具有良好的應(yīng)用前景。

本發(fā)明所用的3bepi1和3bepi2兩種表位具有強(qiáng)烈的免疫原性，這兩種表位可以在滅火疫苗的純化過(guò)程中被除去，因此檢測(cè)這些表位所產(chǎn)生的抗體就可完全區(qū)分口蹄疫病毒感染與免疫的動(dòng)物；另外，3bepi1和3bepi2表位蛋白相對(duì)于全蛋白的制備，制備簡(jiǎn)單、較易獲得，使用的引物由表位序列和限制性酶切位點(diǎn)組成，采用pre-nick技術(shù)，由引物直接退火形成pre-nick雙鏈dna分子，之后將其連接到表達(dá)載體上構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)制備表位蛋白并進(jìn)行純化，純度較高，與其他小rna病毒科的病毒不具有交叉反應(yīng)性，且與口蹄疫陽(yáng)性牛血清反應(yīng)較為強(qiáng)烈，具有良好的免疫反應(yīng)性，對(duì)基于此制備區(qū)分口蹄疫感染和免疫的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒提供了前提和條件。

附圖說(shuō)明

圖1是3aepi1和3aepi2蛋白表達(dá)的電泳圖；其中，m：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、3aepi1誘導(dǎo)后大腸桿菌裂解液；2、3aepi1誘導(dǎo)前大腸桿菌裂解液；3、3aepi2誘導(dǎo)后大腸桿菌裂解液；4、3aepi2誘導(dǎo)前大腸桿菌裂解液；

圖2是3bepi1、3bepi2和3bepi3蛋白表達(dá)的電泳圖；m:蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、3bepi1誘導(dǎo)前大腸桿菌裂解液；2、3bepi1誘導(dǎo)后大腸桿菌裂解液；3、3bepi2誘導(dǎo)前大腸桿菌裂解液；4、3bepi2誘導(dǎo)后大腸桿菌裂解液；5、3bepi3誘導(dǎo)前大腸桿菌裂解液；6、3bepi3誘導(dǎo)后大腸桿菌裂解液；

圖3是表位蛋白純化的電泳圖；其中：1、3aepi1；2、3aepi2；3、3bepi1；4、3bepi2；5、3bepi3；

圖4是westernblot結(jié)果圖；其中：1、3aepi1；2、3aepi2；3、3bepi1；4、3bepi2；5、3bepi3；

圖5是本發(fā)明所述clia檢測(cè)的指標(biāo)優(yōu)化分析圖；其中，p是指陽(yáng)性，n是指陰性；

圖6是本發(fā)明所述檢測(cè)方法的roc曲線圖；

圖7是本發(fā)明所述檢測(cè)方法交互式點(diǎn)狀圖；其中，0代表陰性樣品，1代表陽(yáng)性樣品。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體的案例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說(shuō)明。

試驗(yàn)例1表位蛋白載體的構(gòu)建、表達(dá)和純化

現(xiàn)有研究表明，口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白在口蹄疫病毒檢測(cè)方面具有較好的反應(yīng)，尤其是3a和3b蛋白，因此，本發(fā)明人以3a和3b為研究對(duì)象，首先根據(jù)位于3a與3b上的共五組表位，設(shè)計(jì)一系列的引物，這些引物的組成包括各表位序列與pre-nick限制性酶切位點(diǎn)。編碼3aepi1的基因的上下有引物的核苷酸序列分別如seqidno：1和seqidno：2所示，編碼3aepi2的上下游引物如seqidno：3和seqidno：4所示，編碼3bepi1的如seqidno：5和seqidno：6所示，編碼3bepi2的如seqidno：7和seqidno：8所示，編碼3bepi3的如seqidno：9和seqidno：10所示。引物序列如下表1所示。

表1：各表位的引物核苷酸序列

所述引物均由上海生物工程公司合成。

表達(dá)載體的構(gòu)建：將上述各組引物直接進(jìn)行退火，形成帶有酶切位點(diǎn)缺口的pre-nick雙鏈dna分子。具體操作為：將100μmol/l的上游引物與100μmol/l的下游引物各10μl，去離子水70μl和10×t4連接酶的buffer10μl進(jìn)行混合均勻，形成混合物。將該混合物置95℃水浴鍋中反應(yīng)5min，然后關(guān)掉水浴鍋電源使其溫度慢慢降為室溫（約50min-60min）。此時(shí)該混合物就為帶有酶切位點(diǎn)缺口的雙鏈dna分子?？芍苯舆M(jìn)行載體的連接。對(duì)pgex4t-1載體進(jìn)行雙酶切后，各組退火的pre-nick雙鏈dna通過(guò)bamhⅰ和notⅰ限制性酶切位點(diǎn)連接到pgex4t-1載體上。經(jīng)過(guò)酶切鑒定和測(cè)序正確后，將構(gòu)建成功的五組表達(dá)載體進(jìn)行后續(xù)的蛋白表達(dá)。

蛋白的表達(dá)：將測(cè)序正確的五組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化bl21（de3）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在過(guò)夜培養(yǎng)的lab平板上挑取單克隆于5ml具有氨芐抗性的lb培養(yǎng)基中，37℃220rpm培養(yǎng)16h。然后，將該5ml菌液轉(zhuǎn)接到500ml具有氨芐抗性的lb中，37℃220rpm培養(yǎng)3h后，待菌液的od600約為0.4-0.6時(shí)，加入終濃度為1mmol/l的iptg進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。37℃220rpm誘導(dǎo)表達(dá)6h后，收集菌液沉淀。沉淀用20ml的1×gstbindingbuffer（4.3mmol/lna2hpo4；1.4mmol/lkh2po4；13.7mmol/lnacl；2.7mmol/lkcl；ph：7.3）重懸，置于冰浴中超聲破菌15min，然后10000g離心30min分離上清與包涵體，進(jìn)行sds-page電泳，如圖1和2。結(jié)果表明，五株蛋白均以可溶性的形式表達(dá)。

蛋白的純化：根據(jù)gst標(biāo)簽蛋白的純化過(guò)程對(duì)五株蛋白進(jìn)行純化。簡(jiǎn)言之，2.5ml的gst樹(shù)脂裝入層析柱中，用5倍體積的1×gstbindingbuffer洗滌樹(shù)脂后，將樣品蛋白液加入層析柱中，并與樹(shù)脂孵育30min。然后，用10倍體積的1×gstbindingbuffer洗滌樹(shù)脂。最后用3倍體積的1×gstelutionbuffer（10mmol/l還原性谷胱甘肽溶于50mmol/ltris-hcl；ph：8.0）洗脫目的蛋白。sds-page電泳鑒定純化效果，如圖3。結(jié)果表明，五株蛋白具有很高的純度。其中，3aepi1的氨基酸序列如seqidno：11所示，3aepi2的氨基酸序列如seqidno：12所示，3bepi1的氨基酸序列如seqidno：13所示，3bepi2的氨基酸序列如seqidno：14所示，3bepi3的氨基酸序列如seqidno：15所示。

westernblot鑒定五株蛋白的免疫反應(yīng)性：將純化好的五株蛋白電轉(zhuǎn)到pvdf膜上，加入1：200倍稀釋的口蹄疫病毒感染的陽(yáng)性牛血清室溫孵育1h。經(jīng)過(guò)pbst漂洗后，加入1：2000倍稀釋的hrp標(biāo)記的兔抗牛的igg（sigma-aldrich）室溫孵育1h。經(jīng)過(guò)pbst漂洗后加入dab底物顯色，如圖4。結(jié)果表明，五株蛋白均與口蹄疫陽(yáng)性牛血清反應(yīng)強(qiáng)烈。間接elisa表明，3bepi1與3bepi2與口蹄疫牛陽(yáng)性血清反應(yīng)最為強(qiáng)烈。

因此，選擇3bepi1與3bepi2兩株蛋白制備化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒。

試驗(yàn)例2區(qū)分口蹄疫病毒感染與疫苗免疫動(dòng)物的clia方法的優(yōu)化與建立

利用棋盤(pán)滴定法確定抗原的包被濃度和血清稀釋度。簡(jiǎn)言之，3bepi1與3bepi2的濃度分別稀釋為200ng/孔、100ng/孔、50ng/孔、25ng/孔，然后將相同濃度的兩個(gè)蛋白混合后4℃過(guò)夜包被。標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清分別做了1：5、1：10、1：20、1:40的稀釋?zhuān)鐖D5所示。最后綜合考慮信噪比和p/n等因素，確定抗原包被條件為25ng/孔的3bepi1與25ng/孔的3bepi2，血清稀釋度為1：5。

試驗(yàn)例3血清盤(pán)的建立

1、共106份樣品采集于未免疫過(guò)口蹄疫疫苗的并且臨床上健康的牛。經(jīng)蘭州獸醫(yī)研究所開(kāi)發(fā)的口蹄疫液相阻斷elisa試劑盒檢測(cè)結(jié)果表明，這些樣品沒(méi)有口蹄疫a、asia1、o型的結(jié)構(gòu)蛋白抗體（抗體滴度<1:4）。這些樣品用于確定該clia的臨界值和診斷特異性。

2、共175份樣品采集于免疫過(guò)4-5次口蹄疫滅活疫苗的并且臨床上健康的牛。液相阻斷elisa檢測(cè)結(jié)果表明，這些樣品的結(jié)構(gòu)蛋白抗體效價(jià)在1：128-1：1024之間。這些樣品用于確定該clia的臨界值和診斷特異性。

3、共161份樣品采集于口蹄疫爆發(fā)期間的具有典型口蹄疫癥的牛，這些樣品采集于2010年之前，并于-80℃存放。這些樣品用于確定該clia的臨界值和診斷敏感性。

4、應(yīng)用二次攻毒的高感染滴度的牛血清作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照陽(yáng)性血清，該血清應(yīng)用蘭州獸醫(yī)研究所開(kāi)發(fā)的3abc單抗阻斷elisa試劑盒的阻斷率為98%。應(yīng)用商品化的新生胎牛血清作為標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照血清。

5、共523份田間隨機(jī)樣品采集于口蹄疫可疑疫區(qū)，這些樣品用于比較該clia方法同商品化試劑盒的符合率。

試驗(yàn)例4具體操作步驟的實(shí)施

用ph=9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋含有3bepi1和3bepi2表位蛋白的混合液，使混合液中3bepi1和3bepi2的濃度均為250ng/ml；將混合液以每孔100μl包被到化學(xué)發(fā)光反應(yīng)板上，于4℃過(guò)夜；然后以每孔300μl加入封閉液，于37℃作用2h即完成包被。然后每孔加入封閉液300μl并于37℃作用2h。加入1：5倍稀釋的待檢樣品與標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性對(duì)照血清，所有樣品用血清稀釋液進(jìn)行稀釋37℃作用5min，pbst洗滌5次后，加入用血清稀釋液稀釋20000倍的hrp標(biāo)記的兔抗牛的igg。37℃作用5min。經(jīng)過(guò)pbst漂洗后，加入化學(xué)發(fā)光底物和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑，5min后用化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)儀器檢測(cè)發(fā)光值。

其中，所述封閉液為pbs緩沖液，其中包含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的酪蛋白、體積分?jǐn)?shù)為0.1%的吐溫-20和體積分?jǐn)?shù)為2%的馬血清

所述血清稀釋液為為pbs緩沖液，其中包含體積分?jǐn)?shù)為0.1%的吐溫-20和體積分?jǐn)?shù)為1%的大腸桿菌裂解液；

所述化學(xué)發(fā)光底物為0.1mmol/l的魯米諾溶液；

所述化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑包含0.07mmol/l的4-(4’-iodo)-phenylphenol(ipp)、3mmol/l的h2o2和體積分?jǐn)?shù)為0.002%的tween。

試驗(yàn)例5臨界值的確定

根據(jù)上述步驟，對(duì)442份已知口蹄疫背景的血清進(jìn)行檢測(cè)。所有樣品最終以陽(yáng)性百分率表示（positivepercentpp），pp=（檢測(cè)樣品發(fā)光值-標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品發(fā)光值）*100%/（標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性樣品發(fā)光值-標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品發(fā)光值）。應(yīng)用medcacl軟件做roc曲線分析，如圖6、7和下表2所示。結(jié)果表明，當(dāng)臨界值為9.63%時(shí)，其診斷敏感性為90.06%，診斷特異性為96.44%。

表2：不同臨界值所對(duì)應(yīng)的診斷敏感性與診斷特異性

試驗(yàn)例6比較3bepi1-3bepi2-clia與3abcclia試劑盒以及國(guó)外進(jìn)口的priocheck@nspelisa試劑盒的診斷特性

應(yīng)用本發(fā)明制備的clia檢測(cè)試劑盒與兩種商品化elisa試劑盒對(duì)465份已知口蹄疫背景的牛血清和523份田間隨機(jī)樣品進(jìn)行檢測(cè)并比較三種方法的診斷特性。如下表3。對(duì)于未免疫的陰性血清來(lái)說(shuō)，三種方法都具有較高的準(zhǔn)確性分別為96.23%、95.28%和95.28%。對(duì)于疫苗免疫過(guò)的陰性血清，尤其是對(duì)于免疫過(guò)5次滅活疫苗的動(dòng)物來(lái)說(shuō)，該clia則顯現(xiàn)出較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，具有較高的準(zhǔn)確性為97.14%，而兩種商品化試劑盒的準(zhǔn)確率只有85.71%和89.14%。但對(duì)于未免疫的

陽(yáng)性血清來(lái)說(shuō)，該clia方法具有相對(duì)較低的準(zhǔn)確率為90.06%，而兩種商品化試劑盒的準(zhǔn)確率都較高為95.03%和96.89%。對(duì)于田間隨機(jī)523份樣品，3beip1-3bepi2clia與3abcclia試劑盒的符合率為87.38%，與進(jìn)口elisa試劑盒的符合率為89.48%。因此，從以上數(shù)據(jù)可以看出，該基于表位蛋白的clia方法在診斷疫苗免疫過(guò)的動(dòng)物中具有較高的準(zhǔn)確性。

表3：比對(duì)試驗(yàn)結(jié)果表

因此，本發(fā)明所述基于口蹄疫病毒3b表位蛋白的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，相比于3abcclia試劑盒和其他市售試劑盒，最突出的優(yōu)點(diǎn)在于可較準(zhǔn)確的區(qū)分口蹄疫病毒感染動(dòng)物和疫苗免疫動(dòng)物。對(duì)于免疫過(guò)5次滅活疫苗的動(dòng)物檢測(cè)中，3abcclia與procheck@fmdvnspelisa試劑盒產(chǎn)生了較高的假陽(yáng)性，而3bepi1-3bepi2clia仍具有很高的準(zhǔn)確性。此外，該檢測(cè)方法可在15min內(nèi)完成檢測(cè)。在實(shí)踐中，可配合檢測(cè)3abcclia方法，進(jìn)一步確定動(dòng)物的感染狀態(tài)。從而更加準(zhǔn)確的診斷口蹄疫。

需要說(shuō)明的是，以上試驗(yàn)例僅為解釋說(shuō)明性的，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書(shū)為準(zhǔn)。凡在本發(fā)明基礎(chǔ)上所做的等同性的、無(wú)創(chuàng)造性付出的修改或替換，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所

<120>一種基于口蹄疫病毒3b表位蛋白的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒

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<213>大腸桿菌

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