一種螺旋藻類食品中微囊毒素的快速定量檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于食品檢測領域，具體涉及一種螺旋藻類食品中微囊毒素的快速定量檢測方法。
【背景技術】
[0002]目前主要的食用藻類主要有螺旋藻及小球藻。螺旋藻類含有豐富的營養(yǎng)成分，包括多種維生素(B1、B2、B6、B12、C、E、K等)、礦物質(鈣、鐵、鋅、磷、鎂和碘等)、氨基酸、β-胡蘿卜素、γ -亞油酸、葉綠素及蛋白質。世界衛(wèi)生組織(WHO)定為“人類21世紀的最佳保健品”，1981年美國食品和藥品管理局(FDA)確認其為“最佳蛋白質來源之一”，我國衛(wèi)生部也批準其為“新資源食品”。，目前，國內外對螺旋藻進行過系統(tǒng)的安全性毒理學評價，確認它是安全有效健康的食品。隨著人民生活水平及保健意識的提高，人們對保健食品的需求越來越大，同時對保健食品安全性也提出了更高的要求。而螺旋藻在人工養(yǎng)殖和自然環(huán)境中，都可能被有毒藍藻污染，伴生一類可對人類肝臟發(fā)生損害的微囊藻毒素。微囊藻毒素是一種單環(huán)7肽，至21世紀初已確定的MCYSTs的同分異構體已達60多種，是在藍藻水華污染中出現(xiàn)頻率最高、產毒量最大的一類藻類毒素，其具有強烈的促癌作用，其作用的靶器官是肝臟，它能強烈地抑制蛋白磷酸酶的活性，導致細胞內多種蛋白質的過磷酸化，導致肝細胞的損傷。由于其生態(tài)毒理學效應，日益引起人們的關注。近年來，由于全球環(huán)境污染加重，通過產毒微囊藻和其它有害藍藻污染的水體暴露微囊藻毒素是人類面臨的一個公共衛(wèi)生問題。一些國家和WHO還推薦了飲用水和娛樂用水中微囊藻毒素的安全限量標準，因此，如何有效檢測混在螺旋藻中的微囊藻毒素的含量對于我國對藻類保健品的質量監(jiān)管至關重要。
[0003]目前，微囊藻毒素的檢測方法包括蛋白磷酸酶抑制分析PPIA法、ELISA法及HPLC法，PPIA法、ELISA法在檢測過程中易受干擾，HPLC法檢測過程中樣品前處理復雜。為此，本發(fā)明提供一種檢測靈敏度高，定量準確的超高效液相色譜-串接質譜檢測方法。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術中存在的上述問題，提供一種檢測靈敏度高、抗干擾性強及檢測結果準確的螺旋藻類食品中微囊毒素的檢測方法。
[0005]本發(fā)明的技術方案如下:
一種螺旋藻類食品中微囊毒素的快速定量檢測方法，包括以下步驟:
(1)樣品前處理:取螺旋藻固體樣品l-5g，置于碾缽中研碎后加提取溶劑，放入磁力攪拌器中攪碎，離心，沉淀后用GF/C濾紙過濾，再次加入提取液，重復提取3-5次，將提取液置于旋轉蒸發(fā)儀上加溫濃縮，得樣品待測液備用；
(2)制備陽性對照液:取微囊毒素RR和微囊毒素LR標準品l_5g，加超純水溶解配制成1.0ug/ml的陽性對照溶液備用；
(3)樣品凈化:將步驟(I)中制備的樣品待測液加入HLB柱中進行富集，洗脫，收集洗脫液置于燒瓶中，于旋轉蒸發(fā)儀上蒸干，再次富集，再次洗脫，并將洗脫液于旋轉蒸發(fā)儀上蒸干，取蒸干后的樣品加入3-5倍體積的甲醇，轉入離心管中，加5-10ml純化水溶解，離心，取上清液待測；
(4)HPLC測定樣品中微囊毒素的含量:將步驟(2)中配制好的1.0ug/ml的陽性對照溶液分別進行一級全掃描與二級全掃描機多反應檢測，優(yōu)化色譜條件與質譜條件，對步驟(3)中的待測上清液進行HPLC-串接質譜法測定。
[0006]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的螺旋藻固體樣品劑型包括膠囊、片劑及精粉。
[0007]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的提取溶劑的加入量為30_50ml。
[0008]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的提取溶劑選自冰醋酸或醇溶液中的一種或多種。
[0009]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的冰醋酸為體積濃度為5-10%的冰醋酸。
[0010]優(yōu)選的，步驟(I)中所述的醇溶液為丁醇、甲醇和水的混合溶液，所述的丁醇、甲醇、水的體積比為(1-3):(4-12): (20-50)。
[0011]優(yōu)選的，步驟(I)與步驟(3)中所述的離心速度為10000-12000r/min，離心時間為20-30min ;步驟(I)中所述的加溫溫度為50-80°C。
[0012]優(yōu)選的，步驟(3)中所述的洗脫過程具體為:先用20-30%的甲醇水溶液洗脫，再用90-100%的甲醇水溶液洗脫。
[0013]優(yōu)選的，步驟(3)中再次洗脫過程具體為:先用濃度為10-20%的甲醇水溶液洗脫，再用60-70%的甲醇水溶液洗脫。
[0014]優(yōu)選的，步驟(4)中的色譜條件為:流動相為0.3 %甲酸水溶液與乙腈的混合物，其中0.3 %甲酸水溶液與乙腈2-5的體積比為(1-3): (2-5);流速:0.4 mL/min ；色譜柱:Waters Acquity UPLC TM BEH C 18，1.7 μπι, 2.1 mm X 100 mm;柱溫:40_45°C ;樣品盤溫度:4 °C ;洗脫程序:等度，80 %的0.3 %甲酸水溶液，20 %乙腈；進樣量:5yL;質譜條件:儀器:Agilent 6460型三重四極桿質譜儀；電離源模式:電噴霧離子化；電離源極性:正離子模式；霧化氣:氮氣；霧化氣壓力:50 -55psi ；毛細管電壓:3400-3600V ;干燥氣溫度:325 -3400C ;干燥氣流速:5 L/min ;鞘氣溫度:380-400 °C ;鞘氣流速:12 L/min ;監(jiān)測方式:多反應監(jiān)測。
[0015]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，有益效果體現(xiàn)在:
1.在微囊毒素的檢測過程中，常規(guī)的提取液[甲醇、酸化甲醇(0.05 % TFA)、EDTA? Na2 (0.01 mo I/L )-酸化甲醇(0.05 % TFA )]雖然提取目標成分效果也好，但由于其組分太復雜，易產生基質效應，影響后期目標成分的定量分析。本發(fā)明中，采用體積濃度為5-10%的冰醋酸或體積比為(1-3): (4-12): (20-50)的丁醇、甲醇的水溶液作為提取液，在提取兩種微囊毒素時可以得到較高的回收率，可有效提高目標組分的提取。
[0016]2.目前，微囊藻毒素含量的測定方法包括許多，且水樣中微囊藻毒素的測定方法較為成熟，而生物樣品及螺旋藻類固體樣品中微囊毒素的測定方法研宄卻并不多，且國外學者等采用免疫親和柱純化HPLC檢測，樣品加標回收率約為80%。本研宄，在傳統(tǒng)測定方法基礎上采用質譜多反應監(jiān)測，可有效克服檢測樣品中干擾組分對檢測結果的影響，且通過測定特定質荷比的碎片離子峰，選擇性及靈敏度均較高。
[0017]3.由于螺旋藻類食品中干擾組分較多，為了改善峰形，提高樣品分離度，縮短分析時間，本發(fā)明中在對樣品進行預處理時，采用兩次梯度洗脫，在HPLC-串聯(lián)質譜檢測過程中，也選擇梯度洗脫，可使流出組分分離度更高，而且可明顯提高色譜峰的峰對稱性，使目標成分分離效果更好，避免了內源性雜質對目標成分分離的影響。
[0018]4.本研宄在在采用質譜多反應監(jiān)測過程中，選擇特定濃度的特定體積比的甲酸水溶液與乙腈作為流動相，可明顯提高微囊毒素RR和微囊毒素LR樣品的離子化效率及檢測響應靈敏度。
[0019]5.為了獲得微囊毒素檢測的最佳質譜參數(shù)，本發(fā)明還設置了陽性對照組，對色譜條件及質譜參數(shù)均進行了最大的優(yōu)化，從而最大限度提高了檢測的靈敏性及檢測結果的準確性。
【具體實施方式】
[0020]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明:
所述的陽性對照品微囊毒素RR和微囊毒素LR標準品購于TaiWan Algal Science
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[0021]實施例1
一種螺旋藻類食品中微囊毒素的快速定量檢測方法，包括以下步驟:
(1)樣品前處理:取螺旋藻膠囊樣品lg，置于碾缽中研碎后加30ml5%的冰醋酸，放入磁力攪拌器中攪碎，以10000r/min離心20min，沉淀后用GF/C濾紙過濾，再次加入提取液，重復提取3次，將提取液置于旋轉蒸發(fā)儀上加溫至50°C濃縮，得樣品待測液備用；
(2)制備陽性對照液:取微囊毒素RR和微囊毒素LR標準品lg，加超純水溶解配制成
1.0ug/ml的陽性對照溶液備用；
(3)樣品凈化:將步驟(I)中制備的樣品待測液加入HLB柱中進行富集，先用20%的甲醇水溶液洗脫，再用90%的甲醇水溶液洗脫，收集洗脫液置于燒瓶中，于旋轉蒸發(fā)儀上蒸干，再次富集，再次以10%的甲醇水溶液洗脫，再用60%的甲醇水溶液洗脫洗脫，并將洗脫液于旋轉蒸發(fā)儀上蒸干，取蒸干后的樣品加入3倍體積的甲醇，轉入離心管中，加5ml純化水溶解，以10000r/min離心20min，取上清液待測；
(4)HPLC測定樣品中微囊毒素的含量:將步驟(2)中配制好的1.0ug/ml的陽性對照溶液分別進行一級全掃描與二級全掃描機多反應檢測，優(yōu)化色譜條件與質譜條件，對步驟(3)中的待測上清液進行HPLC-串接質譜法測定。
[0022]步驟(4)中的色譜條件為:流動相為0.3 %甲酸水溶液I體積份與乙腈2體積份的混合物；流速:0.4 mL/min ；色譜柱:Waters Acquity UPLC TM BEH C 18 ,1.7 μ m,
2.1 mmX10 mm ；柱溫:40°C ;樣品盤溫度:4 °C ;洗脫程序:等度，80 %的0.3 %甲酸水溶液，20 %乙腈；進樣量:5 yL ;質譜條件:儀器:Agilent 6460型三重四極桿質譜儀；電離源模式:電噴霧離子化；電離源極性:正離子模式；霧化氣:氮氣；霧化氣壓力:50psi ；毛