廣東紫珠多組分同時(shí)測(cè)定方法及指紋圖譜構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種廣東紫珠多組分同時(shí)測(cè)定方法及指紋圖譜構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 指紋圖譜可通過(guò)不同的特性共有峰來(lái)表示，其能基本上反映中藥的化學(xué)成分W及 含量分布情況。美國(guó)、英國(guó)、印度、德國(guó)、加拿大等國(guó)家均已接受指紋圖譜的質(zhì)控方法，對(duì)指 紋圖譜中所呈現(xiàn)的各個(gè)峰所表示的組分，并不要求其有清楚的化學(xué)結(jié)構(gòu)，也不需要對(duì)呈現(xiàn) 在指紋圖譜中的每個(gè)組分都清楚的定量，而僅需要不同批號(hào)的同一藥品的指紋圖譜保持一 致。例如，德國(guó)和法對(duì)其聯(lián)合開(kāi)發(fā)的銀杏葉標(biāo)準(zhǔn)制劑EGb761制定的標(biāo)準(zhǔn)，不僅控制了總黃 麗和總內(nèi)醋的含量W及指標(biāo)成分之間的比例，而且還設(shè)置了內(nèi)控的色譜指紋圖鑒別。美國(guó) 食品藥品監(jiān)督管理局在1996年制定的《FDA關(guān)于植物物制品的指南》中，要求對(duì)植物原料、 植物藥中間體和植物藥產(chǎn)品提供相關(guān)的指紋圖譜。中國(guó)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局于2000 年發(fā)布了《中藥注射劑的指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)》，明確要求對(duì)新申報(bào)的中藥注射 劑和已上市的中藥注射劑實(shí)行采用指紋圖譜控制其標(biāo)準(zhǔn)；《中國(guó)藥典》2010版中也有多個(gè) 藥材和制劑要求用指紋圖譜控制其質(zhì)量的要求。
[0003] 中藥一般是通過(guò)多成分、多途徑、多層次和多祀點(diǎn)在人體內(nèi)發(fā)揮作用，該些都給中 藥的深入研究和質(zhì)量控制帶來(lái)很大困難。長(zhǎng)期W來(lái)，中藥存在質(zhì)量控制水平低、不能進(jìn)行定 性和定量分析W及質(zhì)量不穩(wěn)定等問(wèn)題。中藥指紋圖譜特指中藥樣本經(jīng)光譜或色譜等現(xiàn)代分 析技術(shù)得到的中藥組分群的特征圖譜和圖像，目前已成為國(guó)內(nèi)外公認(rèn)鑒別中藥品種和評(píng)價(jià) 中藥質(zhì)量的最有效手段之一。中藥指紋圖譜主要包括色譜法巧日薄層色譜（TLC))、氣相色 譜（GC)、高效液相色譜0PLC)及超臨界流體色譜（SFC)等)、光譜法幼日紫外、紅外光譜等)、 核磁共振譜（NMR)和聯(lián)用技術(shù)(如GC-MS質(zhì)譜，LC-MS、LC-NMR、和LC-DAD(二極管陣列檢 巧IJ)-Msn等)。其中，色譜指紋圖譜是目前研究最為廣泛的方法。
[0004] 廣東紫珠（Callica巧akwangtungensisQum)來(lái)源于馬鞭草科植物廣東紫珠的 地上干燥部分，其具有收斂止血、散癒和清熱解毒之功效，主要用于外傷出血、肺熱咳嗽、咽 喉腫痛、熱毒瘡瘍和水火燙傷。廣東紫珠中藥材也被新收錄于2010版《中國(guó)藥典》，其中規(guī) 定了廣東紫珠的性狀、理化鑒別及W金石蠶巧和連翅醋巧B兩個(gè)指標(biāo)成分的定量。眾所周 知，廣東紫珠中藥成分極其復(fù)雜，僅靠性狀鑒別和含量測(cè)定不足W全面控制廣東紫珠藥材 質(zhì)量，因此，本領(lǐng)域亟需一種能夠全面控制廣東紫珠藥材質(zhì)量的手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了解決廣東紫珠中藥成分極其復(fù)雜，僅靠性狀鑒 別和含量測(cè)定不足W全面控制廣東紫珠藥材質(zhì)量的技術(shù)問(wèn)題，而提供了一種廣東紫珠多組 分同時(shí)測(cè)定方法及指紋圖譜構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明的廣東紫珠多組分同時(shí)測(cè)定方法操作 簡(jiǎn)單，且穩(wěn)定性、精密性和重現(xiàn)性均良好，并且該方法中廣東紫珠的色譜峰分離度好、分析 時(shí)間短；其得到的廣東紫珠指紋圖譜能夠全面控制廣東紫珠藥材質(zhì)量，使得廣東紫珠藥材 質(zhì)量控制更加全面與科學(xué)。
[0006] 本發(fā)明提供了一種廣東紫珠多組分同時(shí)測(cè)定方法，其包含下列步驟；將廣東紫珠 的供試品溶液經(jīng)超快速液相色譜法檢測(cè)、高分離度快速液相色譜法檢測(cè)或者超高效液相色 譜法進(jìn)行檢測(cè)，即可；
[0007] 所述的超快速液相色譜法、所述的高分離度快速液相色譜法和所述的超高效液相 色譜法中的色譜條件均為：色譜柱為十八烷基娃焼鍵合硅膠柱，流動(dòng)相A為己膳或甲醇，流 動(dòng)相B為0. 5%磯酸水溶液或0. 1%~0. 5%的甲酸水溶液，其中，所述的0. 5%磯酸水溶液中 的百分比是指磯酸的體積占磯酸水溶液體積的百分比，所述的0. 1%~0. 5%的甲酸水溶液 中的百分比是指甲酸的體積占甲酸水溶液體積的百分比，洗脫梯度如表1所示：
[0008]表1
[0009]
[0010] 檢測(cè)波長(zhǎng)為332皿。
[0011] 本發(fā)明中，所述的廣東紫珠的供試品溶液可按照本領(lǐng)域色譜供試品溶液常規(guī)的預(yù) 處理方法制備得到。本發(fā)明優(yōu)選下列方法和條件；將廣東紫珠藥材粉末，與40%~70%的甲 醇水溶液混合，所述的百分比是指甲醇的體積占甲醇和水總體積的百分比，超聲提取后，用 微孔濾膜過(guò)濾，即可。其中，所述的廣東紫珠藥材粉末在使用前，較佳地過(guò)30~100目篩， 得到粒度均勻的廣東紫珠藥材粉末。所述的40%~70%的甲醇水溶液與廣東紫珠藥材粉末 的體積質(zhì)量比較佳地為lOmL/g~lOOmL/g，更佳地為lOmL/g~50mL/g。所述的超聲提取 的時(shí)間為30~60min。所述的超聲提取后，冷卻至15~25C，稱(chēng)定重量，若重量有缺失，可 用40~70%的甲醇水溶液補(bǔ)足缺失的重量。所述的微孔濾膜的孔徑可為本領(lǐng)域常規(guī)使用 的微孔濾膜，一般根據(jù)所使用的色譜儀器選擇，本發(fā)明較佳地為0. 22ym的微孔濾膜。所述 的廣東紫珠藥材粉末的制備方法可按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備得到，較佳地，將廣東紫珠 分別用粉碎機(jī)粉碎成粗粉，即可。
[0012] 所述的超快速液相色譜法中的超快速液相色譜較佳地為L(zhǎng)C-20AD型超快速液相 色譜；色譜柱為十八烷基娃焼鍵合硅膠柱。其中，所述的十八烷基娃焼鍵合硅膠柱優(yōu)選 WelchMaterialCi8柱，其規(guī)格為外徑2.ImmX柱長(zhǎng)100mm，填料直徑1.8ym。
[0013] 所述的高分離度快速液相色譜法中的高分離度快速液相色譜較佳地為Agilent 1200Infinity高分離度快速液相色譜；色譜柱為十八烷基娃焼鍵合硅膠柱。其中，所述的 十八烷基娃焼鍵合硅膠柱優(yōu)選ZorbaxSBCi8柱，其規(guī)格為外徑2.ImmX柱長(zhǎng)150mm，填料 直徑1.Sum。
[0014] 所述的超高效液相色譜法中的超高效液相色譜為WatersUPLCsystem超高效液 相色譜；色譜柱為十八烷基娃焼鍵合硅膠柱。其中，所述的十八烷基娃焼鍵合硅膠柱優(yōu)選AC卵ITYUPLC?邸H柱，其規(guī)格為外徑2.ImmX柱長(zhǎng)150mm，填料直徑1. 7ym。
[0015] 本發(fā)明中，當(dāng)流動(dòng)相A為己膳時(shí)，流動(dòng)相B為0. 5%磯酸水溶液；當(dāng)流動(dòng)相A為甲醇 時(shí)，流動(dòng)相B為0. 1%~0. 5%的甲酸水溶液。當(dāng)流動(dòng)相A為己膳，流動(dòng)相B為0. 5%磯酸水 溶液時(shí)，最優(yōu)選如表2所示的洗脫梯度。
[0016]
[0017] 本發(fā)明中，所述的超快速液相色譜法檢測(cè)、高分離度快速液相色譜法檢測(cè)或者超 高效液相色譜法檢測(cè)的進(jìn)樣量根據(jù)色譜檢測(cè)領(lǐng)域常規(guī)知識(shí)選擇，一般為1~20祉，優(yōu)選2~ lOuL。本發(fā)明中，柱溫對(duì)分離效果影響不大，可采用常規(guī)的色譜柱可W允許使用的溫度范 圍，一般為15~4(TC，較佳地為35~4(TC。本發(fā)明中，流速對(duì)分離效果影響不大，可按本 領(lǐng)域常規(guī)方法選擇，一般為0. 2~0. 5血/min。
[0018]本發(fā)明還提供了一種廣東紫珠指紋圖譜的構(gòu)建方法，其包含下列步驟；采用如前 所述的方法檢測(cè)廣東紫珠藥材粉末，再采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（國(guó)家藥典 委2004A1. 0版)，生成廣東紫珠指紋圖譜。
[0019]所檢測(cè)的廣東紫珠藥材粉末的份數(shù)為建立指紋圖譜的最低所需要的樣品份數(shù)W 上，一般W10份為宜，本發(fā)明W10份樣品為例進(jìn)行說(shuō)明。
[0020] 所述的采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件生成廣東紫珠指紋圖譜按常 規(guī)進(jìn)行操作。運(yùn)用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)軟件，確定廣東紫珠的17個(gè)共有峰， 保留時(shí)間依次為 4. 79min、6. 15min、9. 23min、ll. 69min、12. 86min、13. 03min、15. 70min、 16. 43min、17. 47min、1