專利名稱：一種水體中微囊藻毒素mc-lr的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法，屬于環(huán)保技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著全球淡水水華的持續(xù)大規(guī)模的爆發(fā)，藍藻死亡過程中釋放的次級代謝產(chǎn)物微囊藻毒素已成為水體中一類廣泛存在的天然有毒物。微囊藻毒素是七肽單環(huán)化合物，到目前為止，已發(fā)現(xiàn)80種不同的微囊藻毒素亞型。其中以可變氨基酸為亮氨酸(L)和精氨酸(R)的微囊藻毒素MC-LR為最常見、毒性最強，目前已知毒性僅次于二惡英。微囊藻毒素MC-LR在環(huán)境中的分布、遷移、積累的歸宿等環(huán)境行為，已受到環(huán)保工作者的特別關(guān)注。目前對水體中微囊藻毒素MC-LR的檢測方法可分為生物毒理學(xué)法、化學(xué)分析法、免疫檢測法。1、生物測試法采取對小鼠進行灌喂或腹腔注射來鑒定藻毒素的毒性。它的優(yōu)點是簡便直觀，能較為粗略地判斷提取物是否有毒性。具有操作簡單，結(jié)果直觀、快速等優(yōu)點，但需要消耗較多的毒素，靈敏度和專一性不高，無法準確定量，也不能辨別毒素的異構(gòu)體類型。且小鼠的維持費用高、工作量大。2、免疫檢測法利用毒素誘發(fā)免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體，利用抗體對抗原的特異性識別來對各種毒素進行檢測。主要包括酶聯(lián)免疫分析法、蛋白磷酸酶抑制分析法等。免疫檢測法簡單易行、分析速度快、靈敏度較高，但不能對毒素起到良好的鑒別作用，有時會出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。3、化學(xué)分析法包括高效液相色譜(HPLC)、薄層色譜(TLC)高效液相色譜和質(zhì)譜(HPLC-MS)、氣相色譜和質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用、毛細管電泳(CE)等方法?；瘜W(xué)分析法中的GC分析法快速、準確、靈敏、痕量，但只能測定藻毒素的總量，且技術(shù)含量高、操作復(fù)雜，儀器設(shè)備價格昂貴，不能普遍采用。TLC法分離度有限，對其實際應(yīng)用還有難度。CE法檢測時間短，分離度較高，樣品量小，但在監(jiān)測的靈敏度方面要遜色于HPLC。HPLC法準確、靈敏、重現(xiàn)性好，并能同時分析出不同的藻毒素異構(gòu)體，操作相對簡單，儀器設(shè)備價格適中，但在鑒定過程中需要借助藻毒素標準樣品。相對來說，HPLC是常用的一種分析手段。由于生物測試與免疫檢測均需要生物樣本，且測定過程中存在上述不確定性，因此在環(huán)境監(jiān)測中應(yīng)用不普遍。HPLC法因其分析速度快，方法重現(xiàn)性好而應(yīng)用較普遍。但在樣品預(yù)處理上仍存在以下問題(1)樣品預(yù)處理時采用樹脂作為富集柱，體積較大，洗脫步驟多，消耗有機溶劑多，且有機溶劑涉及四氯化碳、丙酮等毒性相對較大的溶劑，對操作人員相對風(fēng)險較大；
(2)采用常規(guī)規(guī)格的C18硅膠柱對樣品富集純化，因其尺寸較大，所需填料及溶劑較多，存在浪費溶劑及填料利用不充分的現(xiàn)象，且填料回收利用率較低，往往是一次性的，對環(huán)境影響較大。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決上述的水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法中所存在有機溶劑用量大、毒性大、步驟繁多等技術(shù)問題而提供一種簡單、快速、準確、環(huán)保的水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法，即利用GF/C玻璃纖維濾紙過濾待測水樣中的藻細胞，用C18硅膠為填料的固相萃取柱SPE柱分離純化過濾后的待測水樣，并用高效液相反相色譜系統(tǒng)進行測定其出峰面積，然后通過預(yù)先獲得的不同濃度的微囊藻毒素MC-LR 標準品所對應(yīng)的出峰面積的標準曲線求出待測水樣中微囊藻毒素MC-LR的含量。
上述的一種水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法，具體包括如下步驟(1)、水樣的預(yù)處理將5-10mL待測水樣經(jīng)過規(guī)格為1. 2 μ m的GF/C玻璃纖維濾紙過濾去除藻細胞及水樣中其他懸浮顆粒物，收集過濾后的待測水樣待用；(2)、固相萃取柱SPE柱的活化與微囊藻毒素MC-LR的萃取固相萃取柱SPE柱中的填料為C18硅膠，每個樣品柱的填料為500 mg,固相萃取柱SPE 柱先用5mL甲醇活化，并用IOmL的Mill1-Q水調(diào)節(jié)；所述的固相萃取柱SPE柱的規(guī)格SPE柱為固相萃取小柱，柱管容量6mL ；將步驟(I)的過濾后的待測水樣，用上述活化后的SPE柱萃取，過濾后的待測水樣以lOmL/min的速度進SPE萃取柱，保留分離物，其他干擾物通過吸附劑，所得的分離物用 5mL20%的甲醇沖洗I次，使先前保留的干擾物選擇性地淋洗掉；經(jīng)20%甲醇沖洗后的分離物用3mL的純甲醇洗脫，洗脫液即為待測水樣中MC-LR提取物，控制溫度為45°C用氮吹至干，溶于200 μ L色譜純甲醇，于_20°C保存；(3)、微囊藻毒素MC-LR標準曲線的繪制取MC-LR標準樣品，用色譜醇甲醇配成不同濃度的MC-LR標準品甲醇溶液，用HPLC反相色譜系統(tǒng)測定其不同濃度MC-LR標準品甲醇溶液對應(yīng)的出峰時間在6min的峰面積，然后以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制不同濃度的微囊藻毒素MC-LR標準品所對應(yīng)的出峰面積，得到不同濃度的微囊藻毒素MC-LR標準品所對應(yīng)的出峰面積的標準曲線；(4)、水樣中MC-LR的高效液相色譜HPLC測定取步驟(2)處理好的待測水樣中MC-LR提取物用色譜純甲醇定容到lmL，得到待測水樣中MC-LR提取物甲醇溶液，用HPLC反相色譜系統(tǒng)測定，然后根據(jù)步驟(3)所得的標準曲線求出其對應(yīng)的MC-LR濃度值，即為待測水樣濃縮5-10倍后的MC-LR濃度值；即測定值應(yīng)該是待測水樣中實際值的5-10倍，因為取樣5-10mL，經(jīng)過濾、萃取濃縮、吹干，最終定容至ImL進行檢測。
上述的一種水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法，最低檢測限為O. 002mg/Lo
本發(fā)明的技術(shù)效果 本發(fā)明的一種微囊藻毒素MC-LR的測定方法，由于采用6mL規(guī)格的SPE小柱對水樣進行預(yù)處理，所需待測水樣僅為5-10mL，并采用甲醇為淋洗溶劑，使得洗脫液的用量及毒性與傳統(tǒng)方法相比都有所降低，對操作人員更安全。進一步，由于所需待測水樣量的減少，從而相對的減少廢液排放量，填料得以充分利用，對環(huán)境更友好，檢測成本低。進一步，本發(fā)明的一種微囊藻毒素MC-LR的測定方法，由于采用SPE小柱-HPLC聯(lián)用技術(shù)，是集樣品預(yù)處理與分析檢測一體的分析方法，因此，具有步驟簡單、操作方便、分析速度快、溶劑消耗少、方法重現(xiàn)性好、易于自動化等優(yōu)點。進一步，本發(fā)明的一種微囊藻毒素MC-LR的測定方法，操作過程中，待測水樣首先在GF/C玻璃纖維濾紙過濾后可將懸浮顆粒物及藻細胞過濾去除，進C18硅膠為填料的SPE柱后，可明顯看到淺黃色物質(zhì)吸附在填料上，其中可能包含一些色素干擾物，在用20%的甲醇沖洗后，并用純甲醇解吸附，將待測樣品濃縮后進HPLC反相色譜系統(tǒng)檢測鑒定，峰形非常清晰，并在檢測限之上，能很好的檢測到MC-LR的含量，最低檢測限為O. 002mg/L。


圖1A、不同濃度的微囊藻毒素MC-LR標準品所對應(yīng)的出峰面積的標準曲線圖，其中 O. 002 彡 X 彡 O. 2mg/L;
圖1B、不同濃度的微囊藻毒素 MC-LR標準品所對應(yīng)的出峰面積的標準曲線圖，其中x^O. 2mg/L ；
圖2、實施例1含MC-LR為lmg/L的帶出自來水水樣中微囊藻毒素MC-LR含量測定的HPLC 圖3、實施例2人工湖夏陽湖水水樣中微囊藻毒素MC-LR含量測定的HPLC圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明進一步闡述，但并不限制本發(fā)明。本發(fā)明所用的SPE柱中的填料C18硅膠，杭州沃華濾紙有限公司生產(chǎn)；
本發(fā)明所用的固相萃取柱SPE柱為固相萃取小柱，柱管容量6mL，杭州沃華濾紙有限公司生產(chǎn)；
本發(fā)明所用的1.2μπι的GF/C玻璃纖維濾紙，上海摩速科學(xué)器材有限公司；
本發(fā)明所用的MC-LR標準品分子式C49H74NltlO12,分子量995. 2，伊普瑞斯科技有限公司生產(chǎn)，HPLC純度彡95% ；
本發(fā)明所用的甲醇，色譜級。實施例1
一種水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法，具體包括如下步驟
(1)、水樣的預(yù)處理
取自來水水樣添加MC-LR標準樣品得到待測自來水水樣，并使待測自來水水樣中MC-LR理論值為lmg/L。取5mL待測自來水水樣，經(jīng)過規(guī)格為1. 2 μ m的GF/C玻璃纖維濾紙過濾，收集過濾后的待測自來水水樣待用；
(2)、固相萃取柱SPE柱的活化與微囊藻毒素MC-LR的萃取
SPE柱中的填料為C18硅膠，每個樣品柱的SPE填料為500mg，SPE柱先用5mL甲醇活化，并用IOmL的Mill1-Q水調(diào)節(jié)；
將步驟(I)的過濾后的待測自來水水樣，用上述活化后的SPE柱萃取，過濾后的待測自來水水樣以lOmL/min的速度進SPE萃取柱，保留分離物，其他干擾物通過吸附劑，所得的分離物用5mL20%的甲醇沖洗I次，使先前保留的干擾物選擇性地淋洗掉；經(jīng)甲醇沖洗后的分離物用3mL的純甲醇解吸附，殘留物即為待測自來水水樣中MC-LR 提取物，45°C氮吹至干,溶于200 μ L色譜純甲醇,于-20°C保存；(3)、微囊藻毒素MC-LR標準曲線的繪制依次用色譜純甲醇配制濃度分別為O. 002mg/L、0. 01mg/L、0. 02mg/L、0. 05mg/L、0. lmg/ L、0. 2mg/L、0. 5mg/L、lmg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L 的 MC-LR標準品甲醇溶液,采用 HPLC 反相色譜系統(tǒng)進行測定不同濃度的MC-LR標準品甲醇溶液在出峰時間為6min處的出峰面積； 測定所用的反相色譜系統(tǒng)型號為LC-2000，日本JASCO公司生產(chǎn)，所用色譜柱為大連伊利特柱Hypersil ODS 25 μ m，色譜柱尺寸為4. 6 X 250 mm ；測定條件流動相為甲醇水的體積比為60/40，并用三氟乙酸調(diào)pH為3. 2，流速為 O. 8mL/min,柱溫保持在25°C，紫外檢測波長238nm，進樣量為10 μ L ;`以MC-LR標準品甲醇溶液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，最終得到標準曲線如圖1Α，圖1B所示，從圖1Α、圖1B中可以得出y=8. 15x+0. 8313，R2=O. 9266，其中y為峰面積，χ為MC-LR標準品甲醇溶液， O. 002 ^ χ ^ O. 2mg/L ；y=0. 1975x+2. 434，R2=9843，其中y為峰面積，χ為MC-LR標準品甲醇溶液，χ彡O. 2mg/L ；(4)、高效液相色譜HPLC的測定取步驟(2)處理好的待測自來水水樣中MC-LR提取物用色譜純甲醇定容到lmL，得到待測水樣中MC-LR提取物甲醇溶液，用與步驟(3)所述的HPLC反相色譜系統(tǒng)進行測定，測定條件同步驟(3)，測定結(jié)果如圖2所示，從圖2中獲得出峰時間在6min處的峰面積，然后根據(jù)步驟(3)所得的標準曲線求出MC-LR濃度為4. 6mg/L,由于檢測過程中待測自來水水樣取樣為5mL，經(jīng)過濾、萃取濃縮、吹干，最終定容至ImL進行檢測，因此實際測定的MC-LR濃度為待測自來水水樣的5倍，即實際的待測自來水水樣中MC-LR濃度為O. 92mg/L。
通過上述的水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法測定出待測自來水水樣中的微囊藻毒素MC-LR的濃度O. 92mg/L，其與步驟(I)中的實際加入量即濃度為lmg/L相差8%。 由此表明本發(fā)明的一種水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法可靠、準確度高。
實施例2一種水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法，具體包括如下步驟(1)、水樣的預(yù)處理取人工湖夏陽湖水水樣5mL經(jīng)過規(guī)格為1. 2 μ m的GF/C玻璃纖維濾紙過濾，收集過濾后的待測人工湖夏陽湖水水樣待用；(2)、固相萃取柱SPE(固相萃取)柱的活化與微囊藻毒素MC-LR的萃取SPE柱中的填料為C18硅膠，每個樣品柱的填料為500mg，SPE柱先用5mL甲醇活化，并用IOmL的Mill1-Q水調(diào)節(jié)；將步驟(I)的過濾后的待測人工湖夏陽湖水水樣，用上述活化后的SPE柱萃取，過濾后的待測的人工湖夏陽湖水水樣以lOmL/min的速度進SPE萃取柱，保留分離物，其他干擾物通過吸附劑，所得的分離物用5mL20%的甲醇沖洗I次，使先前保留的干擾物選擇性地淋洗掉；
經(jīng)甲醇沖洗后的分離物用3mL的純甲醇解吸附，殘留物即為人工湖夏陽湖水水樣中MC-LR提取物，45 °C氮吹至干，溶于200 μ L色譜純甲醇，于-20 V保存；
(3)、微囊藻毒素MC-LR標準曲線的繪制 同實施例1的步驟(3)；
(4)、高效液相色譜HPLC的測定
取步驟(2)處理好的待測人工湖夏陽湖水水樣中MC-LR提取物用色譜純甲醇定容到lmL，得到待測人工湖夏陽湖水水樣中MC-LR提取物甲醇溶液，用HPLC反相色譜系統(tǒng)測定，測定條件同步驟(3)，結(jié)果如圖3所示，從圖3中獲得出峰時間在6min處的峰面積，然后根據(jù)步驟(3)所得的標準曲線求出MC-LR的濃度為2. 3mg/L,由于檢測過程中人工湖夏陽湖水水樣取樣為5mL，經(jīng)過濾、萃 取濃縮、吹干，最終定容至ImL進行檢測，因此實際測定的MC-LR濃度為待測人工湖夏陽湖水水樣的5倍，即實際的待測人工湖夏陽湖水水樣中MC-LR的濃度為 O. 46mg/L。上述內(nèi)容僅為本發(fā)明構(gòu)思下的基本說明，而依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案所作的任何等效變換，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.ー種水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法，其特征在于利用GF/C玻璃纖維濾紙過濾待測水樣中的藻細胞，用C18硅膠為填料的固相萃取柱SPE柱分離純化過濾后的待測水樣，并用高效液相反相色譜系統(tǒng)進行測定其出峰面積，然后通過預(yù)先獲得的不同濃度的微囊藻毒素MC-LR標準品所對應(yīng)的出峰面積的標準曲線求出待測水樣中微囊藻毒素MC-LR的含量。
2.如權(quán)利要求1所述的ー種水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法，其特征在于所述的GF/C玻璃纖維濾紙的規(guī)格為1. 2 ii m。
3.如權(quán)利要求1所述的ー種水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法，其特征在于所述的SPE柱為固相萃取小柱，柱管容量6mL。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的ー種水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法，其特征在于具體包括如下步驟 (1)、水樣的預(yù)處理 將5-10mL待測水樣經(jīng)過GF/C玻璃纖維濾紙過濾，收集過濾后的水樣待用； (2)、固相萃取柱SPE柱的活化與微囊藻毒素MC-LR的萃取 固相萃取柱SPE柱填料為C18硅膠，每個樣品柱的填料為500mg，固相萃取柱SPE柱先用5mL甲醇活化，并用IOmL的Mill1-Q水調(diào)節(jié)； 將步驟(I)的過濾后的待測水樣，用上述活化后的SPE柱萃取，過濾后的待測水樣以lOmL/min的速度進SPE萃取柱，保留分離物，其他干擾物通過吸附劑，所得的分離物用5mL20%的甲醇沖洗I次； 經(jīng)20%甲醇沖洗后的分離物用3mL的純甲醇洗脫，洗脫液即為待測水樣中MC-LR提取物，控制溫度為45°C用氮吹至干，溶于200 u L色譜純甲醇，于_20°C保存； (3)、微囊藻毒素MC-LR標準曲線的繪制 取MC-LR標準樣品，用色譜純甲醇配成不同濃度的MC-LR標準品甲醇溶液，用HPLC反相色譜系統(tǒng)測定其不同濃度MC-LR標準品甲醇溶液對應(yīng)的出峰時間在6min的峰面積，然后以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制不同濃度的微囊藻毒素MC-LR標準品所對應(yīng)的出峰面積，得到不同濃度的微囊藻毒素MC-LR標準品所對應(yīng)的出峰面積的標準曲線； (4)、水樣中MC-LR的高效液相色譜HPLC測定 取步驟(2)處理好的待測水樣中MC-LR提取物用色譜純甲醇定容到lmL，得到待測水樣中MC-LR提取物甲醇溶液，用HPLC反相色譜系統(tǒng)測定，然后根據(jù)步驟(3)所得的不同濃度的微囊藻毒素MC-LR標準品所對應(yīng)的出峰面積的標準曲線求出其對應(yīng)的MC-LR濃度值，即為待測水樣濃縮5-10倍后的MC-LR濃度值。
5.如權(quán)利要求4所述的ー種水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法，其特征在于所述的HPLC反相色譜系統(tǒng)型號為LC-2000，日本JASCO公司生產(chǎn)，所用色譜柱為大連伊利特柱Hypersil ODS 25 y m，色譜柱尺寸為 4. 6 X 250mm ; 測定條件流動相為甲醇水的體積比為60/40，并用三氟こ酸調(diào)pH為3. 2，流速為0. 8mL/min,柱溫保持在25°C，紫外檢測波長238nm，進樣量為10 Uし
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法，屬于環(huán)保技術(shù)領(lǐng)域。所述的水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法即利用GF/C玻璃纖維濾紙過濾待測水樣中的藻細胞，用C18硅膠為填料的固相萃取柱SPE柱分離純化過濾后的待測水樣，并用高效液相色譜進行檢測，然后通過預(yù)先獲得的不同濃度的微囊藻毒素MC-LR標準品所對應(yīng)的出峰面積的標準曲線求得待測水樣中微囊藻毒素MC-LR的含量。本發(fā)明的一種水體中微囊藻毒素MC-LR的測定方法具有步驟簡單、操作方便、洗脫液的用量及對環(huán)境的毒性都有所降低，對操作人員更安全，檢測成本低等優(yōu)點，最低檢測限為0.002mg/L。
文檔編號G01N30/02GK103048398SQ20121051308
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者葉璟, 張穎, 王魯梅, 樓春, 錢景茹 申請人:上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院