一種利用熒光檢測微囊藻細胞dna損傷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境檢測與生態(tài)毒理評價技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種微囊藻細胞DNA損傷檢測的方法，它適用于水體中有毒有害物質(zhì)的生態(tài)安全評價及水環(huán)境中致癌致畸因子的早期監(jiān)測預(yù)警。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著水體富營養(yǎng)化的加劇，藍藻水華現(xiàn)象時常發(fā)生。藍藻水華造成水質(zhì)急劇惡化，魚類大量死亡，生境退化。微囊藻作為水華的主要藻種之一，不僅增殖能力強，而且產(chǎn)生微囊藻毒素，導(dǎo)致家畜死亡，也可能引發(fā)人類肝臟癌變。DNA作為中心法則的核心，對細胞的分裂、代謝與調(diào)控起著決定性作用，DNA損傷作為一個靈敏而有代表性的生物標志物，廣泛應(yīng)用于生態(tài)毒理與安全評價中。針對不同控藻方法的微囊藻DNA損傷評估，不僅有助于藍藻水華控制技術(shù)的開發(fā)；同時，微囊藻對環(huán)境中致癌致畸因子響應(yīng)靈敏，通過對微囊藻DNA損傷的檢測，可實現(xiàn)對水體環(huán)境中致癌致畸因子的早期監(jiān)測預(yù)警。
[0003]目前還沒有專門針對微囊藻細胞DNA損傷檢測的方法。Singh等(“Asimpletechnique for quantitat1n of low levels of DNA damage in individual cells”.Singh et al.,Experimental Cell Research，卷:175期:I頁:184-191，1988年3月15日)在前人方法的基礎(chǔ)上，提出了單細胞凝膠電泳法測定細胞DNA損傷。該方法簡便，靈敏，在醫(yī)學(xué)和毒理學(xué)檢測研究中有較多的應(yīng)用。然而，該方法只能檢測單鏈DNA損傷，并且操作主觀性強，不同操作者實驗結(jié)果偏差較大，因而限制了這一方法的廣泛應(yīng)用。最近，有一些學(xué)者提出了利用PCR擴增的方式來檢測DNA鏈斷裂的方法，如RAPD、rDNA和ARDRA(“Evidencesshowing ultrav1let-B radiat1n-1nduced damage of DNA in cyanobacteria andits detect1n by PCR assay，，.Kumar.，et al,B1chemical and B1physical ResearchCommunicat1ns，卷:318期:4頁:1025-1030 ,2004年6月11日)，以及通過實時熒光定量PCR(“DNA supercoiling suppresses real-time PCR: a new approach to thequantificat1n of mitochondrial DNA damage and repair”.Chen et al.,NucleicAcids Research，卷:35期:4頁:1377-1388，2007年2月11日)的辦法來定量DNA損傷的程度，這些方法在特定細胞DNA鏈斷裂檢測中顯示了很高的特異性，但應(yīng)用藻類DNA損傷中還有待進一步實驗證實，并且該方法操作難度大，需要大型儀器如熒光定量PCR儀，測試費用高，難以普遍應(yīng)用于環(huán)境檢測。本方法是根據(jù)不同斷裂水平的DNA鏈在堿性溶液中解旋速率不同，通過熒光染色對解旋后DNA鏈中雙鏈部分進行定量來測定細胞DNA損傷。其原理為:DNA鏈斷裂后，自由末端增多，雙鏈DNA在適宜的堿性pH值下氫鍵斷裂，雙鏈DNA解鏈，自由末端越多，解旋速率越快。雙鏈DNA熒光染料Hoechst 33258能選擇性的與雙鏈DNA結(jié)合，而不與單鏈DNA結(jié)合，由此可以計算DNA單雙鏈的比例，通過比較相同解旋時間后DNA單雙鏈的比例，來計算DNA鏈斷裂的水平。本方法不會受到染色體結(jié)構(gòu)的影響，并且靈敏度高，可以檢測到染色體上的單個斷裂位點，因此非常適合測定浮游生物DNA鏈斷裂。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是在于提供了一種利用熒光檢測微囊藻細胞DNA損傷的方法，該方法的優(yōu)點在于檢測不需要大型儀器，對操作者分子生物學(xué)的專業(yè)知識要求不高，易于掌握，并且靈敏度高，DNA鏈上單個斷裂位點即可檢測到。
[0005]—種利用熒光檢測微囊藻細胞DNA損傷的方法，其步驟是:
[0006](a)分組設(shè)定:除待檢測樣品外設(shè)置正常生長的樣品為對照組，待檢測樣品標記為t，對照樣品標記為0，將待檢測樣品和對照樣品分別平均分成三組，測試樣品標記為Pt樣品、Tt樣品和Bt樣品；對照樣品分別標記為Po樣品、To樣品和Bo樣品。在以下步驟(b)至⑴中，對測試樣品和對照樣品處理方式相同，因此，在以下步驟(b)至(f)的表述中，T樣品包含Tt樣品和To樣品，？樣品包含Pt樣品和Po樣品，13樣品包含Bt樣品和Bo樣品；
[0007](b)去除細胞角質(zhì)鞘:1500乂8離心151^11收集1'、？和8樣品中藻細胞，將細胞重懸浮于ImL SE緩沖液(SE緩沖液的配制方法:50mM NaCl,50mM Tris,5mM EDTA)，調(diào)pH至8.0顛倒混勾洗滌2?5m i η;
[0008](c)細胞裂解:1500\8離心151^11，去上清，將細胞分別重懸浮于415￥(￥代表1至100微升之間的任意體積，下同)體積的LyS i S裂解液(Lysi s裂解液的配制方法:40mM EDTA，400mM NaCl,50mM Tris-HCl，pH=9.0)，分別加入50V體積的濃度為50mg/ml溶菌酶，上下顛倒樣品管三次，37°C反應(yīng)20min;然后加入10￥體積濃度為511^/1111的蛋白酶K和25V體積濃度為10 %的十二烷基磺酸鈉，上下顛倒樣品管三次，50°C反應(yīng)2h;
[0009](d)細胞DNA鏈解旋:T樣品加入1000V體積的超純水，混勻;B樣品加入500V體積的
0.1M NaOH混勻，超聲處理180s，20°C溫浴30min，隨后加入500V體積的0.1M HCl，混勻；P樣品，加入500V體積的0.1M NaOH混勻，20°C溫浴30min，隨后加入500V體積的0.1M HCl，混勻；
[0010](e)染色:分別向以上T、P和B樣品中加入100V體積的60μΜ Hoechest 33258(溶解于0.1M磷酸緩沖液中，pH=7.6)，混勾，25?30°C下1000rpm離心5min，整個過程避光；
[0011](f)熒光測定:根據(jù)不同檢測器分別取對應(yīng)量T，P和B樣品上清液，于熒光檢測器中測熒光強度，T，P和B樣品的熒光強度分別記為f P、f B，和fT ；
[0012](g)結(jié)果計算:DNA鏈斷裂指數(shù)SSF的計算，
[0013]首先，計算殘留雙鏈0嫩百分比？{=(辦一作)/市一作)\100%
[0014]然后，根據(jù)所計算出的F值計算DNA鏈斷裂指數(shù)，計算公式為
[0015]SSF = -ln(Ft/Fo)
[0016]其中，F(xiàn)o為對照組的F值，由對照組的Po樣品、To樣品和Bo樣品的熒光強度f計算得到;Ft為處理組的F值，由處理組Pt樣品、Tt樣品和Bt樣品的熒光計算強度f得到。
[0017]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法的優(yōu)點和有益效果如下:
[0018](a)方法靈敏度高，DNA鏈上一個斷裂位點即可檢測到；
[0019](b)操作簡便，不需要熒光顯微鏡及熒光定量PCR儀等分子生物學(xué)大型儀器，常規(guī)加熱設(shè)備、超聲發(fā)生設(shè)備加上熒光檢測設(shè)備即可完成測試；
[0020](C)提高工作效率，單細胞凝膠電泳需要對每一個樣品在熒光顯微鏡下單次拍照，耗時長，本方法通過96孔板可對大量樣品進行高通量測定，測定一批樣品可在4h內(nèi)完成。
【附圖說明】
[0021]圖1為一種化感物質(zhì)焦性沒食子酸(PA)對銅綠微囊藻DNA鏈斷裂的影響。
[0022]【附圖說明】:銅綠微囊藻細胞在2mg/L焦性沒食子酸(PA)暴露4、8和12h條件下，DNA鏈的斷裂水平分別為0.08,0.14和0.17SSF(1SSF= 16000個斷裂位點)。隨著暴露濃度的升高和暴露時間的延長，DNA鏈的斷裂水平呈現(xiàn)明顯的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)，在50mg/L暴露12h的時候到達0.968SSF，相當(dāng)于DNA鏈上有15488個斷裂位點。這個測試結(jié)果表明，化感物質(zhì)焦性沒食子酸即使在2mg/L這樣的低濃度作用條件下也能明顯引起銅綠微囊藻DNA鏈的斷裂，在高濃度化感物質(zhì)暴露下，DN