本發(fā)明涉及病毒培養(yǎng)技術領域，具體涉及到一種采用兩次細胞培養(yǎng)工藝提高病毒液病毒含量的方法。
背景技術：
病毒(Virus)由一種核酸分子(DNA或RNA)與蛋白質(Protein)構成或僅由蛋白質構成(如朊病毒)。病毒個體微小，結構簡單。病毒沒有細胞結構，由于沒有實現(xiàn)新陳代謝所必需的基本系統(tǒng)，所以病毒自身不能復制。但是當它接觸到宿主細胞時，便脫去蛋白質外套，它的核酸(基因)侵入宿主細胞內，借助后者的復制系統(tǒng)，按照病毒基因的指令復制新的病毒。
豬偽狂犬病(Porcine Pseudorabies,PR)是由偽狂犬病病毒(Porcinepseudorabies virus,PRV)引起的以發(fā)熱和腦脊髓炎為主要特征的急性、發(fā)熱性傳染病。該病可引起豬、牛、羊、犬、貓、家兔、小白鼠、水貂、狐等多種家畜和野生動物發(fā)病，具有高致死率。而豬是該病毒增殖感染唯一可存活的宿主，是該病毒的自然儲存庫。所以，從豬群中切斷偽狂犬病毒的傳播是控制偽狂犬病的有效途徑。成年豬一般呈隱性感染，引起生長停滯，增重緩慢等；懷孕母豬可導致流產(chǎn)、死胎、木乃伊等綜合癥；7日齡以內的仔豬發(fā)病死亡率可達100％，斷奶仔豬發(fā)病率可達20％～40％。
目前，該病分布于全世界50多個國家和地區(qū)，我國已有23個省(市)報道了該病的發(fā)生，給畜牧業(yè)造成了巨大的損失。因此必須對該病進行有效的預防和控制，最根本的措施是疫苗接種，而疫苗效果好壞主要取決于抗原的制備，抗原的制備又大多采用細胞增殖病毒的方法，但由于該病毒在不同的細胞上增 殖效果不盡相同，出現(xiàn)病變的時間、病變特征、病變觀察的難易程度、病毒含量均有所差別，如不能掌握其規(guī)律選擇最佳的細胞系進行病毒的培養(yǎng)，將難以生產(chǎn)出優(yōu)質的疫苗的。
轉瓶培養(yǎng)細胞是較傳統(tǒng)的一種生產(chǎn)工藝，該工藝按照常規(guī)的生產(chǎn)方法制備的半成品抗原效價較低，批間差會比較大，生產(chǎn)效率低下，難以達到配苗要求。常規(guī)方法的轉瓶生產(chǎn)，常在接毒時間、接毒量以及收獲時間上進行工藝摸索，找到病毒增殖的一個峰值；但是現(xiàn)有工藝基礎上對抗原病毒含量有進一步提升難度是非常大的。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種采用兩次細胞培養(yǎng)工藝提高病毒液病毒含量的方法。
為達上述目的，本發(fā)明的一個實施例中提供了一種采用兩次細胞培養(yǎng)工藝提高病毒液病毒含量的方法，包括以下步驟：
(1)、細胞培養(yǎng)：取生長良好的傳代細胞，棄掉原培養(yǎng)液，使用PBS溶液沖洗；沖洗完畢后加入處理液進行消化傳代培養(yǎng)，傳代時細胞的接種密度為20萬～40萬個/ml，獲得接種細胞；
(2)、制備種毒：取生長良好的傳代細胞加入生長液使傳代細胞長成單層后棄掉生長液，接種基礎種毒，加入維持液并使基礎種毒均勻而充分的接觸單層細胞，待細胞病變達到70％～80％時將細胞在低溫下凍融，凍融后收獲得到生產(chǎn)用種毒；
(3)、制備細胞懸液：在接種細胞中加入處理液分散成單個細胞，然后加入含有血清的維持液振蕩待用，得到細胞懸液；
(4)、制備病毒液：取生長成單層的接種細胞加入生產(chǎn)用種毒，然后再加 入細胞懸液后培養(yǎng)，當細胞病變達到70％～80％時停止培養(yǎng)進行凍融處理，收獲病毒液。
優(yōu)選的，述傳代細胞為ST細胞或者VERO細胞。
優(yōu)選的，處理液為0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶的混合液。
優(yōu)選的，步驟(1)細胞培養(yǎng)過程中，接種體積為接種瓶體積的10％。
優(yōu)選的，步驟(2)中基礎種毒為豬傳染性胃腸炎病毒TGEV或偽狂犬病毒；所述凍融的低溫溫度為-15℃。
優(yōu)選的，步驟(3)中加入接種瓶體積30％的維持液，所述維持液中含有2％～8％的血清。
優(yōu)選的，步驟(4)中細胞懸液的加入量為培養(yǎng)瓶體積的10％。
優(yōu)選的，步驟(4)中生產(chǎn)用種毒的接毒量為0.001MOI～0.1MOI。
優(yōu)選的，步驟(4)中培養(yǎng)溫度為37℃。
優(yōu)選的，步驟(4)中取生長成單層的接種細胞的具體過程為：接種細胞按照1:3的比例進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)40小時～60小時后細胞生長層致密單層。
優(yōu)選的，所示維持液為含有質量分數(shù)為0.5％赤蘚酮糖、質量分數(shù)為0.5％丁基羥基茴香醚、體積分數(shù)為2％～5％牛血清的MEM培養(yǎng)基。
綜上所述，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
本發(fā)明在現(xiàn)有常規(guī)的生產(chǎn)工藝上進行了優(yōu)化，在單層細胞接種后再加入細胞懸液進行兩次細胞培養(yǎng)工藝，能夠打破現(xiàn)有生產(chǎn)工藝的瓶頸，有效提高病毒液中病毒的含量和滴度，有效縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)品質量，降低生產(chǎn)成本；同時本發(fā)明的方法還具有操作簡單和重復性好的特點。
具體實施方式
為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚明白，下面結合實施例，對 本發(fā)明作進一步的詳細說明，本發(fā)明的示意性實施方式及其說明僅用于解釋本發(fā)明，并不作為對本發(fā)明的限定。
實施例一：偽狂犬病毒的增殖
1、實驗材料準備
實驗細胞：ST細胞；
基礎種毒：偽狂犬病毒Bartha-K61株；
處理液：0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶的混合液；
培養(yǎng)瓶；
生長液：含體積濃度10％的新生牛血清(內蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培養(yǎng)基(gibco公司)；
維持液：含體積濃度2％的新生牛血清(內蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培養(yǎng)基(gibco公司)；
2、實驗步驟：
(1)、細胞培養(yǎng)：取生長良好的ST細胞，棄掉原培養(yǎng)液，使用PBS溶液沖洗1到2次；沖洗完畢后加入處理液進行消化傳代培養(yǎng)，傳代時細胞的接種密度為30萬個/ml，獲得接種細胞；培養(yǎng)溫度37±0.5℃，轉速：10轉/小時；接種體積為接種瓶體積的10％；
(2)、制備種毒：取生長良好的ST細胞加入生長液在37℃下培養(yǎng)使傳代細胞長成單層后棄掉生長液，接種2％的基礎種毒，加入培養(yǎng)瓶體積10％的維持液轉動培養(yǎng)瓶使基礎種毒均勻而充分的接觸單層細胞，最后把細胞瓶放入37℃培育箱內培養(yǎng)，按時觀察。待細胞病變達到70％～80％時將細胞在置于-15℃下凍融，凍融后收獲得到生產(chǎn)用種毒；
(3)、制備細胞懸液：在接種細胞中加入處理液分散成單個細胞，然后加 入含有血清的維持液振蕩待用；維持液的加入體積為接種瓶體積的30％，維持液中含有2％的血清，得到細胞懸液；
(4)、制備病毒液：接種細胞按照1:3的比例進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)40小時～60小時后細胞生長層致密單層；取生長成單層的接種細胞加入生產(chǎn)用種毒，生產(chǎn)用種毒的接毒量為0.001MOI～0.1MOI。然后再加入細胞懸液后于37℃下培養(yǎng)，細胞懸液的加入量為培養(yǎng)瓶體積的10％；當細胞病變達到80％時停止培養(yǎng)于-15℃下進行凍融處理，測定病毒含量為9.12logTCID50/ml，將收獲的病毒液置于2～8℃保存。
3、對比實驗：
采用現(xiàn)有的單層細胞接毒后培養(yǎng)制備病毒液，制備方法參考CN103756974專利中公開的方法。為了減少誤差，對比實驗設置三組，雙層細胞接毒為本發(fā)明的方法制備得到。對比實驗結果如表1所示。
表1：對比實驗數(shù)據(jù)結果(單位：TCID50/ml)
實施例二：
1、實驗材料準備
實驗細胞：ST細胞；
基礎種毒：豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)SCJY株；
處理液：0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶的混合液；
培養(yǎng)瓶；
生長液：含體積濃度10％的新生牛血清(內蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培養(yǎng)基(gibco公司)；
維持液：含體積濃度4％的新生牛血清(內蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培養(yǎng)基(gibco公司)；
2、實驗步驟：
(1)、細胞培養(yǎng)：取生長良好的ST細胞，棄掉原培養(yǎng)液，使用PBS溶液沖洗1到2次；沖洗完畢后加入處理液進行消化傳代培養(yǎng)，傳代時細胞的接種密度為35萬個/ml，獲得接種細胞；培養(yǎng)溫度37℃，轉速：10轉/小時；接種體積為接種瓶體積的10％；
(2)、制備種毒：取生長良好的ST細胞加入生長液在37℃下培養(yǎng)使傳代細胞長成單層后棄掉生長液，接種3％的基礎種毒，加入培養(yǎng)瓶體積10％的維持液轉動培養(yǎng)瓶使基礎種毒均勻而充分的接觸單層細胞，最后把細胞瓶放入37℃培育箱內培養(yǎng)，按時觀察。待細胞病變達到75％時將細胞在置于-15℃下凍融，凍融后收獲得到生產(chǎn)用種毒；
(3)、制備細胞懸液：在接種細胞中加入處理液分散成單個細胞，然后加入含有血清的維持液振蕩待用；維持液的加入體積為接種瓶體積的30％，維持液中含有2％的血清，得到細胞懸液；
(4)、制備病毒液：接種細胞按照1:3的比例進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)40小時～60小時后細胞生長層致密單層；取生長成單層的接種細胞加入生產(chǎn)用種毒，生產(chǎn)用種毒的接毒量為0.001MOI～0.1MOI。然后再加入細胞懸液后于37℃下培養(yǎng)，細胞懸液的加入量為培養(yǎng)瓶體積的10％；當細胞病變達到80％時停止培養(yǎng)于-15℃下進行凍融處理，測定病毒含量為9.12logTCID50/ml，將收獲的病毒液置于2～8℃保存。
3、對比實驗：
采用現(xiàn)有的單層細胞接毒后培養(yǎng)制備病毒液，制備方法參考CN103756974專利中公開的方法。為了減少誤差，對比實驗設置三組，雙層細胞接毒為本發(fā)明的方法制備得到。對比實驗結果如表2所示。
表2：對比實驗數(shù)據(jù)結果(單位：TCID50/ml)
實施例三：
1、實驗材料準備
實驗細胞：VERO細胞；
基礎種毒：豬流行性腹瀉病毒(PEDV)SCJY株；
處理液：0.02％EDTA-0.25％胰蛋白酶的混合液；
培養(yǎng)瓶；
生長液：含體積濃度10％的新生牛血清(內蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培養(yǎng)基(gibco公司)；
維持液：含體積濃度4％的新生牛血清(內蒙古金源康生物工程有限公司)的MEM培養(yǎng)基(gibco公司)；
2、實驗步驟：
(1)、細胞培養(yǎng)：取生長良好的ST細胞，棄掉原培養(yǎng)液，使用PBS溶液沖洗1到2次；沖洗完畢后加入處理液進行消化傳代培養(yǎng)，傳代時細胞的接種密度為35萬個/ml，獲得接種細胞；培養(yǎng)溫度37℃，轉速：10轉/小時；接種體 積為接種瓶體積的10％；
(2)、制備種毒：取生長良好的ST細胞加入生長液在37℃下培養(yǎng)使傳代細胞長成單層后棄掉生長液，接種3％的基礎種毒，加入培養(yǎng)瓶體積10％的維持液轉動培養(yǎng)瓶使基礎種毒均勻而充分的接觸單層細胞，最后把細胞瓶放入37℃培育箱內培養(yǎng)，按時觀察。待細胞病變達到75％時將細胞在置于-15℃下凍融，凍融后收獲得到生產(chǎn)用種毒；
(3)、制備細胞懸液：在接種細胞中加入處理液分散成單個細胞，然后加入含有血清的維持液振蕩待用；維持液的加入體積為接種瓶體積的30％，維持液中含有2％的血清，得到細胞懸液；
(4)、制備病毒液：接種細胞按照1:3的比例進行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)40小時～60小時后細胞生長層致密單層；取生長成單層的接種細胞加入生產(chǎn)用種毒，生產(chǎn)用種毒的接毒量為0.001MOI～0.1MOI。然后再加入細胞懸液后于37℃下培養(yǎng)，細胞懸液的加入量為培養(yǎng)瓶體積的10％；當細胞病變達到80％時停止培養(yǎng)于-15℃下進行凍融處理，測定病毒含量為9.12logTCID50/ml，將收獲的病毒液置于2～8℃保存。
3、對比實驗：
采用現(xiàn)有的單層細胞接毒后培養(yǎng)制備病毒液，制備方法參考CN103756974專利中公開的方法。為了減少誤差，對比實驗設置三組，雙層細胞接毒為本發(fā)明的方法制備得到。對比實驗結果如表3所示。
表3：對比實驗數(shù)據(jù)結果(單位：TCID50/ml)
從上述三組對比實驗可以得知，本發(fā)明采用雙層細胞培養(yǎng)方法相對于單層細胞接毒培養(yǎng)的方法能夠顯著提高病毒液中病毒含量。