本發(fā)明屬于微生物病毒領(lǐng)域，具體涉及一種血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：Ⅰ群禽腺病毒屬于腺病毒科、禽腺病毒屬。Ⅰ群禽腺病毒，代表株為致死雞胚孤兒病毒。它們享有一種共同的群特異性抗原，其中從雞分離的有12個(gè)血清型(FAV1-12)，火雞兩個(gè)血清型(TAV1-2)，鵝三個(gè)血清型(GAV1-3)和鴨1個(gè)血清型。Ⅰ群禽腺病毒可引起禽類(lèi)不同程度的疫病，且各血清型之間交叉保護(hù)效果不佳。近年不斷有報(bào)道，血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒力增強(qiáng)，在國(guó)內(nèi)多地爆發(fā)疫病，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。2015年湖北也有多個(gè)養(yǎng)雞場(chǎng)雞群發(fā)病，部分雞只急性死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)，心包積水、肝臟質(zhì)脆變色、腎臟腫大、腺胃網(wǎng)狀出血。通過(guò)病毒分離鑒定、病毒基因組測(cè)序分析、動(dòng)物回歸試驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)證明該病是由血清4型的Ⅰ群禽腺病毒所引起。但國(guó)內(nèi)尚無(wú)預(yù)防Ⅰ群禽腺病毒的商品化疫苗，也無(wú)預(yù)防血清4型的Ⅰ群禽腺病毒的商品化疫苗。Ⅰ群禽腺病毒疫苗的研制均處在臨床階段或?qū)嶒?yàn)室階段。獲得生產(chǎn)特性?xún)?yōu)良的疫苗毒株，并盡早研發(fā)出用于預(yù)防血清4型Ⅰ群禽腺病毒的疫苗是有效防控疫病的關(guān)鍵。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株，本發(fā)明將其命名為CPHB03株，CPHB03株于2016年9月20日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué))，其分類(lèi)命名為Ⅰ群禽腺病毒CPHB03AviadenovirusCPHB03，保藏號(hào)為CCTCCNO：V201651。所述的Ⅰ群禽腺病毒毒株CPHB03株毒力強(qiáng)，可作為Ⅰ群禽腺病毒疫苗效力檢驗(yàn)時(shí)的攻毒用強(qiáng)毒使用。所述的Ⅰ群禽腺病毒毒株CPHB03株可用于制備I群禽腺病毒疫苗。一種Ⅰ群禽腺病毒疫苗，包含所述的Ⅰ群禽腺病毒毒株CPHB03株。綜上，本發(fā)明的血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株可作為疫苗生產(chǎn)毒株和疫苗檢驗(yàn)毒株生產(chǎn)疫苗、防控疫病。本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：本發(fā)明將血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株滅活后與礦物油佐劑混合乳化制成滅活疫苗，免疫易感動(dòng)物(雞)，免疫后21日，血清中和抗體效價(jià)幾何平均值10000左右。免疫后21日攻毒，免疫組死亡率、排毒率顯著低于空白雞攻毒組。血清學(xué)研究、攻毒保護(hù)研究的結(jié)果顯示，CPHB03株制備的疫苗能夠使易感動(dòng)物產(chǎn)生較高效價(jià)的中和抗體、能抵御本病的致死性攻擊，能明顯降低感染后的排毒率。附圖說(shuō)明圖1是血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果圖。圖2是血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株的同源性分析結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株的分離、培養(yǎng)與鑒定2015年湖北某養(yǎng)雞場(chǎng)蛋雞群發(fā)病、部分雞只急性死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)，心包積水、肝臟質(zhì)脆變色、腎臟腫大、腺胃網(wǎng)狀出血。無(wú)菌取病死雞的肝臟，用研缽將肝臟研碎，向其中加入滅菌生理鹽水，混勻后樣品移入15mL離心管，3000rpm離心10min，上清經(jīng)0.22μm濾器過(guò)濾除菌，即為病毒液，備用。將上述病毒液原倍、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度分別接種長(zhǎng)勢(shì)良好的原代雞胚肝細(xì)胞，置于37℃培養(yǎng)120小時(shí)左右，凍收細(xì)胞病變達(dá)70％左右的最高稀釋度的培養(yǎng)物，分裝，標(biāo)記為F1代病毒液，冷凍保存。將F1代病毒液原倍、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度分別接種長(zhǎng)勢(shì)良好的原代雞胚肝細(xì)胞，置于37℃培養(yǎng)120小時(shí)左右，凍收細(xì)胞病變達(dá)70％左右的最高稀釋度的培養(yǎng)物，分裝，標(biāo)記為F2代病毒液，冷凍保存。如上操作獲得F3代。將F3代病毒液原倍、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋度分別接種長(zhǎng)勢(shì)良好的原代雞胚肝細(xì)胞，37℃孵育1小時(shí)，吸取、棄去病毒液，加入37℃的含1％瓊脂糖的細(xì)胞維持液，待瓊脂糖凝固后置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)120小時(shí)左右，10-7稀釋度的細(xì)胞培養(yǎng)皿中有多個(gè)獨(dú)立存在的可見(jiàn)噬斑，挑取其中一個(gè)獨(dú)立的噬斑，即為F4代病毒，凍融后備用。將F4代病毒液按0.1％(V/V)接種長(zhǎng)勢(shì)良好的原代雞胚肝細(xì)胞，置于37℃培養(yǎng)48小時(shí)左右，細(xì)胞病變達(dá)70％左右，凍收細(xì)胞培養(yǎng)物，分裝，標(biāo)記為F5代病毒液，冷凍保存。按《中國(guó)獸藥典》中外源病毒檢驗(yàn)方法檢驗(yàn)F5代病毒液，結(jié)果顯示，F(xiàn)5代病毒液無(wú)外源病毒污染，是純凈的病毒液。按此方法傳代、放大培養(yǎng)，用于后續(xù)研究。Hexon蛋白是禽腺病毒主要的抗原蛋白，含有型、組特異性抗原表位及中和抗原表位。編碼Hexon蛋白的Hexon基因在親緣關(guān)系較近的禽腺病毒中相對(duì)保守，可以用于確定禽腺病毒毒株在禽腺病毒的分類(lèi)學(xué)位置并確定其與其他毒株的進(jìn)化關(guān)系。設(shè)計(jì)特異性引物(表1)分段(A、B、C三段)測(cè)定Hexon基因序列，A、B、C三片段拼接后可獲得Hexon全基因序列。提取F5代病毒DNA，用特異性引物(表1)進(jìn)行PCR檢測(cè)，1％瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。將PCR產(chǎn)物基因測(cè)序，并進(jìn)行同源性分析和遺傳進(jìn)化分析。由結(jié)果(圖1、2)可以看出，所分離病毒屬于Ⅰ群禽腺病毒，與血清4型的Ⅰ群禽腺病毒同源性最接近，與其他型的Ⅰ群禽腺病毒同源性低。因此，鑒定所分離病毒為血清4型的Ⅰ群禽腺病毒，將其命名為CPHB03株。表1.特異性引物血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株于2016年9月20日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏地址：中國(guó).武漢.武漢大學(xué))，其分類(lèi)命名為Ⅰ群禽腺病毒CPHB03AviadenovirusCPHB03，保藏號(hào)為CCTCCNO：V201651。實(shí)施例2血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株的毒力測(cè)定1、CPHB03株對(duì)雞胚肝細(xì)胞的毒力(CPHB03株的病毒含量)制備雞胚肝細(xì)胞鋪96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)24小時(shí)左右，棄去96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)液。F5代CPHB03株病毒液用細(xì)胞維持液做10倍系列稀釋?zhuān)?0-6、10-7、10-8、10-9稀釋病毒液接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，0.1mL/孔，每個(gè)稀釋度6個(gè)重復(fù)孔，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。接種后7天，顯微鏡下觀察96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，統(tǒng)計(jì)各稀釋度出現(xiàn)、不出現(xiàn)細(xì)胞病變孔的數(shù)量，以Reed-Muench法計(jì)算被檢樣品病毒含量。CPHB03株F5代病毒含量為108.0TCID50/0.1mL。按照上述方法多次測(cè)定不同代次(F6代-F13代)的CPHB03株病毒含量，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，CPHB03株病毒含量高，F(xiàn)5代到F13代的病毒含量在108.0TCID50/0.1mL到109.2TCID50/0.1mL之間，明顯高于現(xiàn)有技術(shù)已知的血清4型Ⅰ群禽腺病毒毒株。業(yè)內(nèi)公知，以體液免疫為主的疫病，其疫苗中的抗原病毒含量是決定滅活疫苗保護(hù)效果的重要指標(biāo)，據(jù)此，血清4型Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株應(yīng)用于疫苗中更具有優(yōu)勢(shì)。表2.各代次CPHB03株病毒含量表代次病毒含量(TCID50/0.1mL)F6代108.0F7代108.5F8代108.0F9代109.2F10代109.0F11代109.2F12代108.5F13代109.02、CPHB03株對(duì)易感動(dòng)物(雞)的毒力將108.0TCID50/0.1mL、106.0TCID50/0.1mL、104.0TCID50/0.1mL、102.0TCID50/0.1mL的CPHB03株分別肌肉注射接種42日齡SPF雞10只，每只0.2mL。觀察記錄發(fā)病情況。攻毒后第1、3、5、7、10日，采集喉頭、泄殖腔棉拭子，檢測(cè)喉頭、泄殖腔排毒情況。試驗(yàn)雞攻毒后2-5日出現(xiàn)發(fā)病的臨床癥狀，表現(xiàn)為精神沉郁、羽毛逆立，發(fā)病后1-2日部分雞只死亡，不死的雞逐漸康復(fù)；各組死亡率分別為8/10、6/10、5/10、6/10；剖檢死亡雞可見(jiàn)典型的心包積水、肝臟質(zhì)脆變色、腎臟腫大、腺胃網(wǎng)狀出血。攻毒后10日內(nèi)排毒率10/10。該結(jié)果表明，CPHB03株毒力較強(qiáng)，可作為疫苗效力檢驗(yàn)時(shí)的攻毒用強(qiáng)毒使用。實(shí)施例3血清4型的Ⅰ群禽腺病毒CPHB03株的免疫原性評(píng)價(jià)向病毒含量為107.5TCID50/0.1mL的CPHB03株病毒液中加入終濃度0.1％(v/v)的甲醛溶液，37℃滅活24小時(shí)。取0.5mL滅活后的抗原接種培養(yǎng)了16-24小時(shí)的雞胚肝細(xì)胞，作為F1代；F1代培養(yǎng)72小時(shí)如無(wú)細(xì)胞病變?cè)俳臃N培養(yǎng)了24小時(shí)的雞胚肝細(xì)胞，作為F2代；F2代培養(yǎng)168小時(shí)未見(jiàn)細(xì)胞病變說(shuō)明為被檢抗原滅活完全。滅活的抗原中加入吐溫80使吐溫80占總體積的4％，混勻即為水相；白油中加入司本80和硬脂酸鋁，使司本80占總體積的6％、硬脂酸鋁與白油的質(zhì)量體積比為1.5％，混合加熱溶解，滅菌后即為油相。水相:油相(體積比)＝1:2的比例以剪切機(jī)高速剪切，使成為油乳劑疫苗。取21日齡SPF雞40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，1、3組頸部皮下注射疫苗，每只0.3mL，2、4組為不免疫對(duì)照組。接種后第21日，檢測(cè)免疫雞血清中和抗體效價(jià)，血清中和抗體效價(jià)幾何平均值10000左右(表3)。“幾何平均值10000左右”是一次免疫能夠獲得的較高的抗體效價(jià)，從而反映CPHB03株毒株具有較好的免疫原性。表3.血清中和抗體效價(jià)中和抗體效價(jià)(log10)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差1組4.4、4.4、3.6、4.0、4.5、4.0、4.5、3.5、4.4、3.64.1±0.43組4.0、4.5、4.4、4.0、3.6、3.4、4.25、4.0、5.4、4.54.2±0.6接種后第21日，1、2組雞肌肉注射CPHB03株病毒液106.0TCID50/0.1mL，每只0.2mL；3、4組雞肌肉注射CPHB03株病毒液102.0TCID50/0.1mL，每只0.2mL。觀察14日，攻毒后第1、3、5、7、10日，采集喉頭、泄殖腔棉拭子，檢測(cè)喉頭、泄殖腔排毒情況。死亡、排毒情況見(jiàn)表4。結(jié)果說(shuō)明，CPHB03株制備的疫苗能夠使易感動(dòng)物產(chǎn)生較高效價(jià)的中和抗體、能抵御本病的致死性攻擊，能明顯降低感染后的排毒率。表4.死亡、排毒情況組別死亡比例攻毒后第5日排毒比例攻毒后10日內(nèi)排毒比例10/101/101/1025/109/1010/1030/101/101/1045/1010/1010/10上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>武漢中博生物股份有限公司<120>一種血清4型的Ⅰ群禽腺病毒毒株及其應(yīng)用<130>1<160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>26<212>DNA<213>Artificial<220><223>A片段上游引物<400>1gggcgcctgaagctgcaacaagatct26<210>2<211>28<212>DNA<213>Artificial<220><223>A片段下游引物<400>2cgcggcggtgttgttggtgtagagttta28<210>3<211>23<212>DNA<213>Artificial<220><223>B片段上游引物<400>3cgggcatgaacgtggtggtcgag23<210>4<211>26<212>DNA<213>Artificial<220><223>B片段下游引物<400>4ccgctgttgtccgtggtaggggtgta26<210>5<211>28<212>DNA<213>Artificial<220><223>C片段上游引物<400>5cgacggcgccagcatcatctacaacgag28<210>6<211>30<212>DNA<213>Artificial<220><223>C片段下游引物<400>6ggccggtttgtacatattctcgtggttgac30當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3