限制增殖型腺病毒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種新型限制增殖型腺病毒及含有其的癌細(xì)胞的檢測(cè)用或癌的診斷用試劑。本發(fā)明提供一種依次含有人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子、E1A基因、IRES序列及E1B基因、且含有第一miRNA的靶序列的多核苷酸。還提供一種在腺病毒基因組的E1區(qū)域中組入有含有所述多核苷酸的復(fù)制盒而成的重組腺病毒。
【專利說(shuō)明】限制增殖型腺病毒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種新型限制增殖型腺病毒及含有其的癌細(xì)胞的檢測(cè)用試劑或癌的診斷用試劑。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，作為癌的診斷方法，主要使用(i)使用MRI等大型檢查設(shè)備的方法和(ii)測(cè)定血液中的腫瘤標(biāo)記等的方法，簡(jiǎn)便且患者負(fù)擔(dān)較少的方法(ii)備受期待。特別是從在癌患者的外周血液中循環(huán)的癌細(xì)胞(循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cells:CTC))顯示與提高全身轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性及確認(rèn)到CTC的患者的預(yù)后顯著低等臨床癥狀密切的關(guān)系的方面考慮，期待開發(fā)一種簡(jiǎn)便且高靈敏度地檢測(cè)作為預(yù)后的預(yù)測(cè)因子或替代標(biāo)記的CTC的方法。
[0003]作為檢測(cè)CTC的方法，使用以EpCAM (上皮細(xì)胞粘附分子)或細(xì)胞角蛋白_8等癌相關(guān)抗原檢測(cè)的方法(細(xì)胞檢驗(yàn)系統(tǒng)等)及RT-PCR等檢測(cè)方法。但是，由于這些癌相關(guān)抗原即使在正常的上皮細(xì)胞中也會(huì)表達(dá)，因此，檢測(cè)出假陽(yáng)性的可能性較高，另外，從在PCR法中在癌細(xì)胞中無(wú)法同時(shí)觀察特征性的細(xì)胞形態(tài)等、靈敏度及簡(jiǎn)便性、準(zhǔn)確性、成本的觀點(diǎn)考慮，尋求新的方法。
[0004]另一方面，本發(fā)明人以前開發(fā)了一種癌細(xì)胞特異性地增殖且表達(dá)GFP的限制增殖型腺病毒(GFP-表達(dá)限制增殖型病毒(GFP-expressing Conditionally ReplicatingAdenovirus):GFP-CRAd)(稱為 TelomeScan (注冊(cè)商標(biāo))、0BP_401 或 Telomelysin-GFP)(專利文獻(xiàn)1:W02006/036004)。而且，開發(fā)了一種使用該TelomeScan的簡(jiǎn)便地檢測(cè)CTC的方法(非專利文獻(xiàn) 1:Kojima T., et al’J.Clin.1nvest.，119; 3172，2009)。
[0005]然而，TelomeScan具有5型腺病毒的纖毛蛋白(7 r 4 一夕、y )'夕質(zhì)，fiberprotein),經(jīng)由祀細(xì)胞的柯薩奇病毒和腺病毒受體(Coxsackievirus and adenovirusreceptor, CAR)感染，因此,有可能`不會(huì)感染未表達(dá)CAR的細(xì)胞。特別是已知滲透、轉(zhuǎn)移及增殖能力較高且惡性度較高的癌細(xì)胞的CAR的表達(dá)降低(非專利文獻(xiàn)2 =Okegawa T.，etal, Cancer Res., 61:6592-6600, 2001),但TelomeScan有可能無(wú)法檢測(cè)這些惡性度較高的癌細(xì)胞。另外，雖然可能性較低，但TelomeScan感染正常的血液細(xì)胞(例如白血球)而增殖，表達(dá)GFP，由此也認(rèn)為會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性。
[0006]因此，尋求檢測(cè)包括CAR陰性的幾乎全部的癌細(xì)胞，且在正常的血液細(xì)胞中不會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性的癌細(xì)胞的檢測(cè)用試劑及癌的診斷用試劑。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0008]專利文獻(xiàn)
[0009]專利文獻(xiàn)1:TO2006/036004
[0010]非專利文獻(xiàn)I =Kojima T.，et al, J.Clin.1nvest.，119:3172, 2009
[0011]非專利文獻(xiàn)2:Okegawa T., et al, Cancer Res., 61:6592-6600, 2001
【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]發(fā)明要解決的問(wèn)題
[0013]本發(fā)明鑒于這樣的狀況進(jìn)行，其所要解決的問(wèn)題在于，提供一種檢測(cè)出包括CAR陰性細(xì)胞的幾乎全部的癌細(xì)胞，且在血液細(xì)胞中不產(chǎn)生假陽(yáng)性癌細(xì)胞的檢測(cè)用試劑及癌的診斷用試劑，以及提供一種作為這樣的試劑有用的限制增殖型重組腺病毒。
[0014]解決問(wèn)題的方法
[0015]本發(fā)明人等為了解決上述問(wèn)題進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將TelomeScan中的5型腺病毒的纖毛置換為與在幾乎全部的人細(xì)胞、特別是全部癌細(xì)胞中高表達(dá)的與CD46結(jié)合的腺病毒的纖毛，不僅可以檢測(cè)CAR陽(yáng)性細(xì)胞，而且可以檢測(cè)CAR陰性細(xì)胞。另外，通過(guò)在TelomeScan中組入利用
[0016]微RNA(miRNA)的基因控制系統(tǒng)，成功地做到在血液細(xì)胞中不會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性，以至完成了本發(fā)明。
[0017]即，本發(fā)明如下所述。
[0018](I) 一種多核苷酸，其依次含有人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子、ElA基因、IRES序列及ElB基因，并且含有第一微RNA的靶序列。
[0019](2)如上述(I)所述的多核苷酸，其中，第一微RNA在非癌細(xì)胞中表達(dá)。
[0020](3)如上述⑴或⑵所述的多核苷酸，其中，第一微RNA為選自由miR-142、miR-15、miR-16、miR-21、miR-126、miR-181、miR-223、miR-296、miR-125、miR-143、miR-145、miR-199及l(fā)et_7構(gòu)成的組中的至少I個(gè)。
[0021](4) 一種重組腺病毒，其中，在腺病毒基因組的El區(qū)域中組入有含有上述(I)~
(3)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的復(fù)制盒。
[0022](5)如上述(4)所述的重組腺病毒，其中，在腺病毒基因組的E3區(qū)域中還組入有標(biāo)記盒，該標(biāo)記盒含有報(bào)告基因及可控制該基因的表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0023](6)如上述(5)所述的重組腺病毒，其中，標(biāo)記盒還含有第二微RNA的靶序列。
[0024](7)如上述(4)所述的重組腺病毒，其中，在腺病毒基因組的E3區(qū)域中還組入有細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒，該細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒含有編碼細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的基因及可控制該基因的表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0025](8)如上述(7)所述的重組腺病毒，其中，細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒還含有第二微RNA的靶序列。
[0026](9)如上述(6)或⑶所述的重組腺病毒，其中，第二微RNA在非癌細(xì)胞中表達(dá)。
[0027](10)如上述(9)所述的重組腺病毒，其中，第二微RNA為選自由miR-142、miR-15、miR-16、miR-21、miR-126、miR-181、miR-223、miR-296、miR-125、miR-143、miR-145、miR-199及l(fā)et-7構(gòu)成的組中的至·少I個(gè)。
[0028](11)如上述(5)或(6)所述的重組腺病毒，其中，報(bào)告基因?yàn)榫幋a發(fā)出熒光的蛋白質(zhì)的基因或編碼通過(guò)酶反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光物質(zhì)或者發(fā)色物質(zhì)的酶蛋白質(zhì)的基因。
[0029](12)如上述(5)~(10)中任一項(xiàng)所述的重組腺病毒，其中，所述啟動(dòng)子為人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子或巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。
[0030](13)如上述⑷~(12)中任一項(xiàng)所述的重組腺病毒，其還含有編碼與⑶46結(jié)合的纖毛蛋白的基因。[0031](14)如上述(13)所述的重組腺病毒，其中，與CD46結(jié)合的纖毛蛋白含有34型或35型腺病毒的纖毛蛋白的至少纖突結(jié)區(qū)域(7 r 4 K一 7 7'領(lǐng)域)。
[0032](15) 一種癌細(xì)胞的檢測(cè)用試劑，其含有上述⑷~(14)中任一項(xiàng)所述的重組腺病毒。
[0033](16) 一種癌的診斷用試劑，其含有上述⑷~(14)中任一項(xiàng)所述的重組腺病毒。
[0034](17)如上述(15)所述的試劑，其中，癌細(xì)胞是源自從受試者中采集的生物試樣的癌細(xì)胞。
[0035](18)如上述(17)所述的試劑，其中，生物試樣為血液。
[0036](19)如上述(15)或(18)所述的試劑，其中，癌細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
[0037](20)如上述(15)及(17)~(19)中任一項(xiàng)所述的試劑，其中，癌細(xì)胞為耐藥性癌細(xì)胞。
[0038](21)如上述(15)及(17)~(20)中任一項(xiàng)所述的試劑，其中，癌細(xì)胞為癌干細(xì)胞。
[0039](22)如上述(15)及(17)~(21)中任一項(xiàng)所述的試劑，其中，癌細(xì)胞為引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化或間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞。
[0040](23) 一種癌細(xì)胞的檢測(cè)方法，其特征在于，使上述(11)所述的重組腺病毒與癌細(xì)胞接觸，檢測(cè)該癌細(xì)胞發(fā)出的熒光或顏色。
[0041](24)如上述(23)所述的方法，其中，癌細(xì)胞是源自從受試者中采集的生物試樣的癌細(xì)胞。`
[0042](25)如上述(24)所述的方法，其中，生物試樣為血液。
[0043](26)如上述(25)所述的方法，其中，癌細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
[0044]發(fā)明效果
[0045]根據(jù)本發(fā)明，可以在不檢測(cè)出正常的血液細(xì)胞(白血球等)的情況下簡(jiǎn)便且高靈敏度地檢測(cè)CAR陰性癌細(xì)胞。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0046]圖1是表示本發(fā)明的重組腺病毒的結(jié)構(gòu)的一個(gè)例子的示意圖；
[0047]圖2是表示利用流式細(xì)胞術(shù)得到的重組腺病毒的活性測(cè)定結(jié)果的圖；
[0048]圖3是表示血液試樣中所含的Hl299細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果的圖；
[0049]圖4是表示血液試樣中所含的A549細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果的圖；
[0050]圖5是表示各種癌細(xì)胞中的本發(fā)明的重組腺病毒的活性測(cè)定結(jié)果的圖；
[0051]圖6是表示引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的癌細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果的圖；
[0052]圖7是表示癌干細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果的圖；
[0053]圖8是表示使用紅色熒光蛋白檢測(cè)血液試樣中所含的H1299細(xì)胞及T24細(xì)胞的結(jié)果的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0054]下面，對(duì)本發(fā)明詳細(xì)地進(jìn)行說(shuō)明。以下的實(shí)施方式為用于說(shuō)明本發(fā)明的例示，并非旨在于將本發(fā)明僅限定于該實(shí)施方式。本發(fā)明只要不背離其主旨就可以以各種方式進(jìn)行實(shí)施。另外，本說(shuō)明書包含成為本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)主張的基礎(chǔ)的2011年8月23日所申請(qǐng)的日本專利申請(qǐng)(日本特愿2011-181414號(hào))的說(shuō)明書及附圖中記載的內(nèi)容。
[0055]1.概要
[0056]在本發(fā)明人以前開發(fā)的TelomeScan(在5型腺病毒的El缺失區(qū)域中依次組入有hTERT啟動(dòng)子、ElA基因、IRES序列、及ElB基因，且在E3缺失區(qū)域中依次組入有巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子及GFP的限制增殖型腺病毒)中，存在⑴有可能無(wú)法檢測(cè)CAR的表達(dá)降低的惡性度高的癌細(xì)胞及(ii)有可能將正常的血液細(xì)胞檢測(cè)為假陽(yáng)性的問(wèn)題。本發(fā)明人為了解決這些問(wèn)題進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)將TelomeScan中的5型腺病毒的纖毛置換為與在幾乎全部的人細(xì)胞、特別是全部癌細(xì)胞中高表達(dá)的與CD46結(jié)合的腺病毒的纖毛，可檢測(cè)惡性度高的CAR陰性癌細(xì)胞。另外，發(fā)現(xiàn)通過(guò)將作為miRNA的miR-142-3p的靶序列組入TelomeScan的增殖盒及標(biāo)記盒中，可在正常的血液細(xì)胞中抑制病毒的增殖及標(biāo)記蛋白質(zhì)的表達(dá)，可抑制在正常的血液細(xì)胞中產(chǎn)生假陽(yáng)性。
[0057]即，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的重組腺病毒為在腺病毒基因組的El區(qū)域中組入有含有hTERT啟動(dòng)子、ElA基因、IRES序列、ElB基因及微RNA的靶序列的復(fù)制盒，并且在腺病毒基因組的E3區(qū)域中組入有含有報(bào)告基因、可控制該基因的表達(dá)的啟動(dòng)子及微RNA的靶序列的標(biāo)記盒，且含有編碼與CD46結(jié)合的腺病毒的纖毛蛋白的基因的重組腺病毒(圖1)，其具有以下的特征。
[0058](i)通過(guò)含有編碼與CD46結(jié)合的腺病毒的纖毛蛋白的基因，可以感染包括CAR陰性細(xì)胞的幾乎全部的細(xì)胞。
[0059](ii)通過(guò)含有hTERT啟動(dòng)子，在表達(dá)hTERT的癌細(xì)胞中特異性地增殖，另外，通過(guò)增殖，報(bào)告基因的表達(dá)增加，可以使標(biāo)記蛋白質(zhì)及發(fā)色物質(zhì)等的生成量增加至可檢測(cè)的水平。
[0060](iii)通過(guò)含有m·iRNA的靶序列，即使在病毒暫時(shí)感染具有hTERT啟動(dòng)子活性的正常細(xì)胞的情況下，通過(guò)miRNA的表達(dá)，也可抑制該病毒的增殖，另外，可抑制報(bào)告基因的表達(dá)，因此，可抑制假陽(yáng)性的產(chǎn)生。特別是通過(guò)含有血液細(xì)胞特異性表達(dá)的miRNA的靶序列，即使在病毒暫時(shí)感染具有hTERT啟動(dòng)子活性的正常血液細(xì)胞的情況下，通過(guò)該miRNA的表達(dá)，也可抑制該病毒在血液細(xì)胞中的增殖，另外，可抑制報(bào)告基因的表達(dá)，因此，可抑制假陽(yáng)性的產(chǎn)生。
[0061 ] 本發(fā)明是基于這些見解而完成的。
[0062]2.重組腺病毒
[0063]⑴復(fù)制盒
[0064]本發(fā)明涉及一種依次含有人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子、ElA基因、IRES序列及ElB基因，并且含有微RNA的靶序列的多核苷酸。另外，本發(fā)明涉及一種在腺病毒基因組的El區(qū)域中組入有含有上述多核苷酸的復(fù)制盒的重組腺病毒。
[0065]發(fā)明的重組腺病毒可利用上述多核苷酸(或含有其的復(fù)制盒)的功能在癌細(xì)胞中特異性地增殖，另外，可以在目標(biāo)miRNA表達(dá)的細(xì)胞中抑制病毒的增殖。例如，在本發(fā)明的復(fù)制盒中所含的miRNA的靶序列為在血液細(xì)胞中特異性表達(dá)的miRNA的靶序列的情況下，本發(fā)明的重組腺病毒在表達(dá)hTERT的癌細(xì)胞中特異性地增殖，且可抑制在血液細(xì)胞中增殖。
[0066]人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)啟動(dòng)子為作為人端粒酶的構(gòu)成成分的逆轉(zhuǎn)錄酶的啟動(dòng)子。認(rèn)為hTERT mRNA的剪接及hTERT蛋白質(zhì)的翻譯后修飾等參與到人端粒酶活性的上升中，hTERT基因表達(dá)的增強(qiáng)，即hTERT啟動(dòng)子活性的上升為最重要的分子機(jī)制。人端粒酶在人的癌的85%以上中確認(rèn)到活性的上升，另一方面，在大部分的正常細(xì)胞中未顯示活性，因此，通過(guò)使用hTERT啟動(dòng)子，可以使其下游的基因在癌細(xì)胞中特異性表達(dá)。在本發(fā)明中，通過(guò)在ElA基因、IRES序列及ElB基因的上游配置hTERT啟動(dòng)子，可以使病毒在表達(dá)hTERT的癌細(xì)胞中特異性地增殖。
[0067]hTERT在其5’末端的上游1.4kbp的區(qū)域中確認(rèn)到較多的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列，認(rèn)為該區(qū)域?yàn)閔TERT啟動(dòng)子。其中，翻譯開始部位的上游ISlbp的序列為對(duì)于下游的基因表達(dá)重要的核心區(qū)域。在本發(fā)明中，若為含有該核心區(qū)域的序列，就可以沒有限定地使用，但優(yōu)選將完全含有該核心區(qū)域的上游378bp左右的序列用作hTERT啟動(dòng)子。該378bp左右的序列與181bp的核心區(qū)域單獨(dú)的情況相比，確認(rèn)到其基因表達(dá)效率相同。將455bp長(zhǎng)度的hTERT啟動(dòng)子的堿基序列示于序列號(hào)I中。
[0068]hTERT啟動(dòng)子的堿基序列除序列號(hào)I所示的序列以外，也包括與由相對(duì)于由序列號(hào)I構(gòu)成的DNA互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且具有hTERT啟動(dòng)子活性的多核苷酸的堿基序列。這樣的核苷酸可以以由序列號(hào)I所示的堿基序列構(gòu)成的多核苷酸、或其片段為探針并利用菌落雜交、噬菌斑雜交、印跡雜交等公知的雜交法由cDNA庫(kù)及基因組庫(kù)中得到。
[0069]關(guān)于cDNA庫(kù)的制作方法，可以參照“分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版”(冷泉港出版社(1989))。另外，也可以使用市售的cDNA庫(kù)及基因組庫(kù)。
[0070]作為上述雜交中的嚴(yán)謹(jǐn)條件，例如可以舉出:1XSSC~2XS`SC、0.1%~0.5%SDS及42°C~68°C的條件，更詳細(xì)而言，可以舉出在60~68 V下進(jìn)行30分鐘以上預(yù)雜交后，在2XSSC、0.1%SDS中，在室溫下進(jìn)行4~6次5~15分鐘的清洗的條件。
[0071]關(guān)于雜交法的詳細(xì)的步驟，可以參照“分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)第二版”(冷泉港出版社(1989);特別是9.47-9.58節(jié))等。
[0072]ElA基因及ElB基因?yàn)橄俨《镜腅l基因中所含的基因，該El基因是指涉及病毒所具有的DNA復(fù)制的初期基因(early:E)和后期基因(late:L)中的初期基因之一，編碼有關(guān)控制病毒基因組的轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。利用腺病毒的ElA基因編碼的ElA蛋白質(zhì)活化產(chǎn)生可感染的病毒所需要的基因群(E1B、E2、E4等)的轉(zhuǎn)錄。利用腺病毒的ElB基因編碼的ElB蛋白質(zhì)通過(guò)后期基因(L基因)的mRNA輔助在感染后的宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的積累、阻礙宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成來(lái)促進(jìn)病毒的復(fù)制。將ElA基因、ElB基因的喊基序列分別不于序列號(hào)2及序列號(hào)3中。ElA基因及ElB基因的堿基序列除分別示于序列號(hào)2及序列號(hào)3的堿基序列以外，也包括與由相對(duì)于由序列號(hào)2及序列號(hào)3構(gòu)成的DNA互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼分別具有ElA活性及ElB活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。關(guān)于雜交的方法及嚴(yán)謹(jǐn)條件等與上述hTERT啟動(dòng)子相同。
[0073]IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(Internal Ribosome Entry Site))序列為在小核糖核酸病毒科中特異性的蛋白質(zhì)的合成開始信號(hào)，由于具有與18S核糖體RNA的3’末端互補(bǔ)的序列，因此認(rèn)為發(fā)揮作為核糖體結(jié)合部位的作用。已知源自小核糖核酸病毒科的病毒的mRNA可經(jīng)由該序列翻譯。來(lái)自IRES序列的翻譯效率較高，即使在mRNA的中途也可以不依賴帽結(jié)構(gòu)地進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。因此，在本發(fā)明的病毒中，利用hTERT啟動(dòng)子獨(dú)立地翻譯ElA基因和位于IRES序列的下游的ElB基因兩者。通過(guò)使用IRES序列，hTERT啟動(dòng)子的表達(dá)控制獨(dú)立地涉及ElA基因、ElB基因，因此，與用hTERT啟動(dòng)子控制ElA基因或ElB基因中的任一者的情況相比，可以將病毒的增殖更嚴(yán)格地限定于具有端粒酶活性的細(xì)胞中。另外，通過(guò)將IRES序列插入到ElA基因和ElB基因之間，可以提高宿主細(xì)胞中的病毒的增殖能力。將IRES序列的堿基序列示于序列號(hào)4中。IRES序列的堿基序列除序列號(hào)4所示的堿基序列以外，也包括與由相對(duì)于由序列號(hào)4構(gòu)成的DNA互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有IRES活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。關(guān)于雜交的方法及嚴(yán)謹(jǐn)條件等與上述hTERT啟動(dòng)子相同。
[0074]miRNA通常認(rèn)為是15~25個(gè)堿基左右的較短的單鏈RNA，認(rèn)為通過(guò)與存在于mRNA的靶序列結(jié)合來(lái)進(jìn)行各種基因的翻譯控制。因此，例如在使表達(dá)miRNA的細(xì)胞感染含有目標(biāo)基因和該miRNA的靶序列的重組腺病毒的情況下，可在該細(xì)胞中抑制目標(biāo)基因的表達(dá)。作為miRNA的靶序列的插入位點(diǎn)，只要可以抑制目標(biāo)基因的表達(dá)就沒有特別限制，但優(yōu)選插入到目標(biāo)基因的非翻譯區(qū)域，更優(yōu)選插入到目標(biāo)基因的下游。
[0075]作為本發(fā)明中所使用的miRNA的靶序列，可以舉出在非癌細(xì)胞中表達(dá)的miRNA的靶序列。非癌細(xì)胞是指不是惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞，例如包括正常細(xì)胞、良性腫瘤細(xì)胞等。正常細(xì)胞例如包括正常的血液細(xì)胞、正常的內(nèi)皮細(xì)胞、正常的成纖維細(xì)胞、正常的干細(xì)胞等。另一方面，認(rèn)為循環(huán)腫瘤細(xì)胞為源自惡性腫瘤的細(xì)胞，在本發(fā)明中，包括在惡性腫瘤細(xì)胞中。
[0076]另外，作為本發(fā)明中所使用的miRNA的靶序列，可以舉出在血液細(xì)胞中特異性表達(dá)的miRNA的靶序列。在本發(fā)明中，“血液細(xì)胞”不僅包括正常的血液細(xì)胞，而且也包括癌化的(已癌化的)血液細(xì)胞。即，在本發(fā)明中，“在血液細(xì)胞中特異性表達(dá)的miRNA”可以在正常血液細(xì)胞中特異性表達(dá)，也可以在正常的血液細(xì)胞及癌化的血液細(xì)胞這兩者中特異性表達(dá)。即使在正常的血液細(xì)胞及癌化的血液細(xì)胞這兩者中特異性表達(dá)的情況下，也可以在檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞時(shí)減少正常血液細(xì)胞的假陽(yáng)性，準(zhǔn)確地檢測(cè)從固體癌中游離的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。在本發(fā)明中，作為“在血液細(xì)胞中特異性表達(dá)的miRNA”，更優(yōu)選在正常的血液細(xì)胞中表達(dá)但在癌化的血液細(xì)胞中不表·達(dá)的miRNA。
[0077]在本發(fā)明中，作為血液細(xì)胞，沒有限定，可以舉出:白血球(中性粒細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞及B細(xì)胞)、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞)、CD34陽(yáng)性細(xì)胞、造血細(xì)胞、造血干細(xì)胞、造血前驅(qū)細(xì)胞(造血前體細(xì)胞)、外周血單核細(xì)胞(PBMC)等。另外，作為癌化的血液細(xì)胞，可以舉出:白血病細(xì)胞、淋巴瘤細(xì)胞等。在本發(fā)明中，在某一細(xì)胞中“特異性表達(dá)”不僅指僅在該細(xì)胞中表達(dá)，而且也指與其它的細(xì)胞相比在該細(xì)胞中表達(dá)量高。例如，“在血液細(xì)胞中特異性表達(dá)”不僅指僅在血液細(xì)胞中表達(dá)，而且也指與血液細(xì)胞以外的細(xì)胞相比在血液細(xì)胞中表達(dá)量高。
[0078]作為在血液細(xì)胞中特異性表達(dá)的miRNA，例如可以舉出:miR_142、miR-15、miR-16、miR-21、miR-126、miR-181、miR-223、miR-296 等，但優(yōu)選 miR-142、miR-15 及miR-16。
[0079]miRNA為單鏈RNA，但只要可以抑制提前的(premature)雙鏈RNA中的目標(biāo)基因的表達(dá)就可以使用任一側(cè)的單鏈RNA的靶序列。例如在miR-142中存在miR-142_3p及miR-142-5p，但在本發(fā)明中可以使用任一靶序列。即，在本發(fā)明中，“miR-142”包括miR-142-3p及miR-142_5p兩者，優(yōu)選miR-142_3p。另外，同樣，在本發(fā)明中，“miR-15”包括提前的雙鏈RNA中的有義鏈(記為“miR-15S”)及反義鏈(記為“miR_15AS”)。關(guān)于其它的miRNA也相同。
[0080]已知miR-142-3p的基因存在于在B細(xì)胞白血病(侵襲性B細(xì)胞白血病(aggressive B cell leukemia))中產(chǎn)生易位的部位,在造血組織(骨髓、脾臟、胸腺等)中表達(dá)，但在其它的組織中不表達(dá)。另外，miR-142-3p在小鼠胎兒肝臟(胎兒的造血組織)中確認(rèn)到表達(dá)，認(rèn)為參與到造血體系統(tǒng)的分化(Chang-Zheng Chen, et al., Science, 2004)。
[0081]在本方式中，由于利用hTERT啟動(dòng)子的作用進(jìn)行癌細(xì)胞中的特異性基因表達(dá)，利用miRNA的作用抑制血液細(xì)胞中的基因表達(dá)，因此，可進(jìn)行二階段的選擇性的基因表達(dá)控制。
[0082]另外，在另一方式中，作為本發(fā)明中所使用的miRNA的靶序列，可以舉出在癌細(xì)胞中抑制表達(dá)的miRNA的靶序列。作為在癌細(xì)胞中抑制表達(dá)的miRNA，例如可以舉出:miR-125、miR-143、miR-145、miR-199、let_7 等。在本方式中，通過(guò) hTERT 啟動(dòng)子和 miRNA的作用來(lái)雙重抑制癌細(xì)胞中的特異性基因表達(dá)。
[0083]miRNA最初從線蟲、酵母等中發(fā)現(xiàn)，但現(xiàn)在在人及小鼠中發(fā)現(xiàn)幾百個(gè)。這些序列是公知的，通過(guò)訪問(wèn)公共的DB (例如miRBase序列數(shù)據(jù)庫(kù)(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index, shtml, http://www.mirbase.0rg/))，可以獲得序列信息等。
[0084]將miR-142、miRNA-Ι5, miRNA-16、miR-21、miR-126、miR-181、miR-223、miR-296、miR-125、miR-143、miR-145、miR-199、let-7 的各序列示于以下。
[0085]miR-142-3p:5’ -UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA (序列號(hào) 5)
[0086]miR-142-5p:5’ ·-CAUAAAGUAGAAAGCACUACU (序列號(hào) 6)
[0087]miR-15S:5’ -UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG(序列號(hào) 7)
[0088]miR-15AS:5’ -CAGGCCAUAUUGUGCUGCCUCA(序列號(hào) 8)
[0089]miR-16S:5’ -UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG (序列號(hào) 9)
[0090]miR-16AS:5，-CCAGUAUUAACUGUGCUGCUGA (序列號(hào) 10)
[0091 ] miR-21S:5’ -UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA (序列號(hào) 11)
[0092]miR-21AS:5’ -CAACACCAGUCGAUGGGCUGU(序列號(hào) 12)
[0093]miR-126S:5，-UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG(序列號(hào) 13)
[0094]miR-126AS:5’ -CAUUAUUACUUUUGGUACGCG(序列號(hào) 14)
[0095]miR-181:5’ -AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU(序列號(hào) 15)
[0096]miR-223S:5’ -UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA (序列號(hào) 16)
[0097]miR-223AS:5’ -CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU(序列號(hào) 17)
[0098]miR-296-3p:5，-GAGGGUUGGGUGGAGGCUCUCC (序列號(hào) 18)
[0099]miR-296-5p:5’ -AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU (序列號(hào) 19)
[0100]miR-125:5’ -UCCCUGAGACCCUUUAACCUGUGA(序列號(hào) 20)
[0101]miR-143S:5’ -UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC (序列號(hào) 21)
[0102]miR-143AS:5’ -GGUGCAGUGCUGCAUCUCUGGU (序列號(hào) 22)
[0103]miR-145S:5’ -GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU (序列號(hào) 23)
[0104]miR-145AS:5’ -GGAUUCCUGGAAAUACUGUUCU (序列號(hào) 24)[0105]miR-199:5，-CCCAGUGUUCAGACUACCUGUUC (序列號(hào) 25)
[0106]let-7:5，-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU (序列號(hào) 26)
[0107]在本發(fā)明中，miRNA的靶序列I單位由相對(duì)于miRNA的全部或一部分互補(bǔ)的序列構(gòu)成，堿基長(zhǎng)為7~30個(gè)堿基長(zhǎng)，優(yōu)選為19~25個(gè)堿基長(zhǎng)，更優(yōu)選為21~23個(gè)堿基長(zhǎng)。在本發(fā)明中，所謂miRNA的靶序列I單位是指某一 miRNA可作為靶的最低限的長(zhǎng)度的堿基序列。具體而言，是指選自序列號(hào)5~26中任意堿基序列的互補(bǔ)序列中的至少7個(gè)堿基長(zhǎng)的寡核苷酸，在任意處中均可以置換、缺失、附加、刪除I個(gè)或多個(gè)核苷酸。
[0108]作為本發(fā)明的多核苷酸或重組腺病毒中所組入的靶序列整體，為了有效地發(fā)揮miRNA和靶序列的相互作用，可以含有多個(gè)I單位的靶序列。組入于重組腺病毒的靶序列整體的長(zhǎng)度只要為可組入到該病毒基因組中的長(zhǎng)度即可，沒有特別限定。例如可以含有I~10拷貝的I單位的靶序列，優(yōu)選含有2~6拷貝，更優(yōu)選含有2拷貝或4拷貝的I單位的革巴序列(John G.Doench, et al., Genes Dev.200317:438-442)。革巴序列整體中所含的革巴序列I單位的序列和序列之間可以含有適當(dāng)長(zhǎng)度的寡核苷酸。適當(dāng)長(zhǎng)度的寡核苷酸的長(zhǎng)度沒有特別限定，但只要為可作為靶序列整體組入到重組腺病毒基因組中的長(zhǎng)度即可，例如可以為O~8個(gè)堿基長(zhǎng)的寡核苷酸。另外，在含有多個(gè)單位的miRNA的靶序列的情況下，各個(gè)單位的靶序列可以為相對(duì)于相同的miRNA的靶序列，也可以為相對(duì)于不同的miRNA的靶序列。進(jìn)而，在含有相對(duì)于相同的miRNA的靶序列的情況下，各個(gè)單位的靶序列的長(zhǎng)度及靶序列的堿基序列也可以不同。
[0109]關(guān)于本發(fā)明的多核苷酸(或含有其的復(fù)制盒)中所含的miRNA的靶序列，在該多核苷酸被組入到重組腺病毒的情況下，為了區(qū)分存在于重組腺病毒的其它的miRNA的靶序列，也可以稱為“第一微RNA的靶序列”。
[0110]在本發(fā)明中，在使用miR-142-3p作為miRNA的情況下，作為其靶序列，例如可以舉出含有以下序列的序列?！?br> [0111]⑴含有miR-142-3p的靶序列2單位的序列:
[0112]5? -gcggcctccataaagtaggaaacactacacagctccataaagtaggaaacactacattataagcggtac
[0113](序列號(hào)27、下劃線表示miR-142_3p的靶序列I單位。)
[0114](ii)含有miR-142_3p的靶序列4單位的序列:
[0115]5? -ggcctccataaagtaggaaacactacacagctccataaagtaggaaacactacattaattccataaagtaggaaacactacaccactccataaagtaggaaacactacagtac
[0116](序列號(hào)28、下劃線表示miR-142_3p的靶序列I單位。)
[0117]在本發(fā)明中，在hTERT啟動(dòng)子-ElA基因-1RES序列-ElB基因的結(jié)構(gòu)的下游配置miRNA的靶序列，并將依次含有hTERT啟動(dòng)子、ElA基因、IRES序列、ElB基因及miRNA的靶序列的多核苷酸(稱為復(fù)制盒)組入腺病毒基因組，由此可以在表達(dá)該miRNA的細(xì)胞中抑制El基因的表達(dá)，抑制病毒的增殖。
[0118]在本發(fā)明中，通過(guò)在ElB基因或后述的報(bào)告基因的下游組入miRNA的靶序列，可抑制存在于其上游的基因的表達(dá)。該機(jī)制的詳細(xì)情況并未明確，但認(rèn)為是如下所述的機(jī)理。首先，通過(guò)miRNA-RISC(RNA-誘導(dǎo)沉默復(fù)合物)切斷mRNA上的靶序列，可除去mRNA的polyA。由此認(rèn)為mRNA的穩(wěn)定性變低，mRNA被分解，可抑制基因的表達(dá)。或者認(rèn)為miRNA-RISC與通常的miRNA同樣地募集poly A分解酶,poly A被分解,結(jié)果,mRNA的穩(wěn)定性變低,可抑制基因的表達(dá)。
[0119]需要說(shuō)明的是，以往報(bào)告有對(duì)于插入至IRES序列下游的基因的表達(dá)(翻譯)，無(wú)法得到利用 miRNA 的基因表達(dá)的抑制效果(Ramesh S.Pillai et al., Science309, 1573(2005) ;Geraldine Mathonnet, et al., Science317, 1764(2007)),但本發(fā)明人對(duì)本發(fā)明的依次含有hTERT啟動(dòng)子、ElA基因、IRES序列、ElB基因及miRNA的靶序列的重組腺病毒進(jìn)行確認(rèn)基因表達(dá)，結(jié)果，利用miRNA可充分地抑制插入至IRES序列下游的ElB基因的表達(dá)。這為本發(fā)明的新的見解。
[0120]本發(fā)明的復(fù)制盒中所含的基因可以利用通常的基因工程方法得到。例如可以使用使用了作為基因工程方法通常所使用的DNA合成裝置的核酸合成法。另外，可以使用如下方法:在分離或合成作為模板的基因序列后，在各個(gè)基因上設(shè)計(jì)特異性的引物，使用 PCR 裝置擴(kuò)增其基因序列的 PCR 法(Current Protocols in Molecular Biology, JohnWiley&Sons(1987)Section6.1-6.4)或使用了克隆載體的基因擴(kuò)增法。上述方法依據(jù)分子克隆第二版.冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1989)等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地進(jìn)行。得到的PCR產(chǎn)物的精制可以使用公知的方法?？梢愿鶕?jù)需要通過(guò)慣用的序列確定法確認(rèn)得到所期待的基因。例如可以利用雙脫氧鏈終止法(Sanger et al.(1977)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA74:5463)等進(jìn)行。另外，也可以利用適當(dāng)?shù)腄NA測(cè)序器(例如ABI PRISM (Applied Biosystems公司))分析序列。
[0121]在本發(fā)明中，miRNA的靶序列可以通過(guò)以使每靶序列I單位相對(duì)于miRNA的全部或一部分的堿基序列互補(bǔ)的方式設(shè)計(jì)、合成來(lái)獲得。例如，miR-142-3p的靶序列可以通過(guò)以與miR-142-3p的堿基序列互補(bǔ)的方式合成DNA來(lái)獲得。
[0122]然后，使如上得到的各基因以成為給定的順序連結(jié)。首先，以公知的限制酶等切斷上述各基因，依據(jù)公知的方法將切斷的該基因的DNA片段插入到公知的載體中并連結(jié)。作為公知的載體，例如可以使·用PlRES載體。pIRES載體為包括腦心肌炎病毒(ECMV)的IRES (內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))序列，且能夠由I種mRNA翻譯2處開放閱讀框(ORF)的載體。若使用PlRES載體，則通過(guò)在多克隆位點(diǎn)依次插入需要的基因，可以制作“依次含有hTERT啟動(dòng)子、ElA基因、IRES序列及ElB基因，且含有微RNA的靶序列的多核苷酸”。對(duì)于miRNA的靶序列的插入位點(diǎn)沒有特別限制，但更優(yōu)選插入到hTERT啟動(dòng)子-E1A-1RES-E1B的結(jié)構(gòu)的下游。DNA的連結(jié)可以使用DNA連接酶。另外，可以根據(jù)需要利用公知的限制酶去除pShuttle等公知載體中所含的CMV啟動(dòng)子,在該部位中插入使用適當(dāng)?shù)南拗泼笍膆TERT啟動(dòng)子-ElA-1RES-ElB-miRNA靶序列中切出的序列。通過(guò)在hTERT啟動(dòng)子的控制下表達(dá)腺病毒的增殖所需要的El基因，可以使病毒癌細(xì)胞特異性地增殖。
[0123](2)標(biāo)記盒
[0124]另外，在另一方式中，本發(fā)明涉及一種在腺病毒基因組的El區(qū)域中組入有上述復(fù)制盒，還在E3區(qū)域中組入有標(biāo)記盒的重組腺病毒。標(biāo)記盒含有報(bào)告基因及可控制該基因的表達(dá)的啟動(dòng)子，進(jìn)而，也可以含有miRNA的靶序列。
[0125]腺病毒E3區(qū)域中存在11.6kDa的ADP (腺病毒死亡蛋白)，ADP具有促進(jìn)細(xì)胞損壞及病毒的擴(kuò)散的功能。本發(fā)明的重組腺病毒由于可除去編碼含有ADP的E3區(qū)域這樣的具有促進(jìn)細(xì)胞損壞及病毒的擴(kuò)散的功能的蛋白質(zhì)的病毒基因組區(qū)域，因此，細(xì)胞死亡的時(shí)機(jī)較慢，利用GFP等熒光表達(dá)的癌組織的鑒定變得容易。這對(duì)于能夠在長(zhǎng)時(shí)間保持存活的條件下檢測(cè)后述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cells:CTC)方面也有效。
[0126]作為本發(fā)明的重組腺病毒的標(biāo)記盒中所含的報(bào)告基因，沒有限定，例如可以舉出:編碼發(fā)出熒光的蛋白質(zhì)的基因、編碼利用酶反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光物質(zhì)或者發(fā)色物質(zhì)的酶蛋白質(zhì)的基因、編碼抗生素的基因、編碼標(biāo)簽融合蛋白質(zhì)的基因、編碼在細(xì)胞表面表達(dá)且與特定的抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)的基因、編碼膜輸送蛋白質(zhì)的基因等。作為發(fā)出熒光的蛋白質(zhì)(標(biāo)記蛋白質(zhì))，例如可以舉出:源自維多利亞水母(Aequorea victorea)等發(fā)光水母的綠色突光蛋白(green fluorescent protein:GFP)、修飾其而成的 EGFP (Enhanced-humanized GFP)、rsGFP (red-shift GFP)、黃色突光蛋白(yellow fluorescent protein:YFP)、青色突光蛋白(cyan fluorescent protein:CFP)、藍(lán)色突光蛋白(blue fluorescent protein:BFP)、源自海腎(Renilla reniformis)的GFP等，可以將編碼這些的基因用于本發(fā)明。作為上述發(fā)出熒光的蛋白質(zhì)，優(yōu)選GFP或EGFP。
[0127]另外，作為利用酶反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光物質(zhì)或者發(fā)色物質(zhì)的酶蛋白質(zhì)，例如可以舉出半乳糖苷酶、熒光素酶等。半乳糖苷酶利用酶反應(yīng)由5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)產(chǎn)生藍(lán)色的發(fā)色物質(zhì)。另外，熒光素酶與熒光素進(jìn)行酶反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)光物質(zhì)。作為熒光素酶，已知有熒火蟲熒光素酶、細(xì)菌熒光素酶及海腎熒光素酶等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從公知的熒光素酶中適宜選擇。
[0128]另外，所謂可控制上述基因表達(dá)的啟動(dòng)子，只要為能夠與用于表達(dá)作為目標(biāo)的上述基因的病毒對(duì)應(yīng)的適當(dāng)?shù)膯?dòng)子就可以為任意的啟動(dòng)子。例如可以舉出:CMV啟動(dòng)子、hTERT啟動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子、MMTV LTR啟動(dòng)子、RSV LTR啟動(dòng)子、SRa啟動(dòng)子、β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、EF-1a啟動(dòng)子等，但并不限定于此。可優(yōu)選使用CMV啟動(dòng)子或hTERT啟動(dòng)子。
[0129]標(biāo)記盒中所組入的miRNA的靶序列與復(fù)制盒中所組入的miRNA的靶序列可以相同，也可以不同。·
[0130]在本發(fā)明中，通過(guò)將miRNA的靶序列配置在報(bào)告基因的非翻譯區(qū)域、優(yōu)選該基因的下游，可抑制報(bào)告基因的表達(dá)。即，在本發(fā)明中，標(biāo)記盒優(yōu)選依次含有可控制報(bào)告基因的啟動(dòng)子、報(bào)告基因及微RNA的靶序列。為了與復(fù)制盒中所含的miRNA的靶序列相區(qū)別，標(biāo)記盒中所組入的miRNA的靶序列稱為“第二微RNA的靶序列”。涉及miRNA的其它的說(shuō)明與上述相同。
[0131]關(guān)于本發(fā)明的標(biāo)記盒中所含的重組基因的獲得方法、精制方法、序列確定方法等與上述復(fù)制盒的情況相同。
[0132](3)細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒
[0133]進(jìn)而，在另一方式中，本發(fā)明涉及一種在腺病毒基因組的El區(qū)域中組入有上述復(fù)制盒，在E3區(qū)域中組入有細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒的重組腺病毒。細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒含有編碼細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的基因及可控制該基因的表達(dá)的啟動(dòng)子，進(jìn)而，也可以含有微RNA的靶序列。
[0134]本發(fā)明的重組腺病毒中所使用的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒中包含編碼細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的基因和可控制該基因的表達(dá)的啟動(dòng)子。因此，例如若使本發(fā)明的重組腺病毒感染癌細(xì)胞，則病毒在癌細(xì)胞中特異性地增殖，結(jié)果，細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量升高，可以在不損傷其它的正常細(xì)胞的情況下僅在癌細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。
[0135]所謂編碼細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的基因是指編碼與特定的細(xì)胞的細(xì)胞死亡的誘導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因。作為細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)，例如可以舉出作為免疫相關(guān)蛋白質(zhì)的PA28。PA28為活化細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶體的蛋白質(zhì)，為通過(guò)過(guò)量表達(dá)引起免疫反應(yīng)，并且也誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的蛋白質(zhì)。另外，作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)蛋白，可以舉出TRAIL。TRAIL是指通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡細(xì)胞死亡的分子。
[0136]另外，作為編碼細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的基因，可以舉出癌抑制基因。癌抑制基因具有抑制癌細(xì)胞的增殖的功能。作為癌抑制基因，例如可以舉出現(xiàn)有的基因治療中所使用的以下的基因。將各基因的喊基序列的序列號(hào)及GenBank Accession N0.不于以下。
[0137]p53 (序列號(hào) 29 !Accession N0.M14694):多種癌
[0138]pl5 (序列號(hào) 30 !Accession N0.L36844):多種癌
[0139]pl6(序列號(hào) 31 !Accession N0.L27211):多種癌
[0140]APC(序列號(hào) 32 Accession N0.M74088):大腸癌、胃癌、胰腺癌
[0141]BRCA-1 (序列號(hào) 33 !Accession N0.U14680):卵巢癌、乳癌
[0142]DPC-4 (序列號(hào) 34 !Accession N0.U44378):大腸癌、胰腺癌
[0143]FHIT(序列號(hào) 35 ;Accession N0.NM112012):胃癌、肺癌、子宮癌
[0144]p73 (序列號(hào) 36 !Accession N0.Y11416):成神經(jīng)細(xì)胞瘤
[0145]PATCHED (序列號(hào)` 37 !Accession N0.U59464):基底細(xì)胞癌
[0146]Rb pllO (序列號(hào) 38 !Accession N0.M15400):肺癌、骨肉瘤
[0147]DCC (序列號(hào) 39 !Accession N0.X76132):大腸癌
[0148]NFl (序列號(hào) 40 !Accession N0.NM000267):神經(jīng)纖毛瘤病 I 型
[0149]NF2 (序列號(hào) 41 !Accession N0.L11353):神經(jīng)纖毛瘤病 2 型
[0150]WT-1 (序列號(hào) 42 !Accession N0.NM000378):腎母細(xì)胞瘤
[0151]細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒中所含的miRNA的靶序列可以與復(fù)制盒中所組入的miRNA的靶序列相同，也可以不同。在本發(fā)明中，通過(guò)將miRNA的靶序列配置在編碼細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的基因的非翻譯區(qū)域、優(yōu)選該基因的下游，可以抑制該細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)。即，在本發(fā)明中，細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒優(yōu)選依次含有可控制編碼細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子、編碼細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的基因及微RNA的靶序列。涉及miRNA的其它的說(shuō)明與上述相同。
[0152]關(guān)于本發(fā)明的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒中所含的重組基因的獲得方法、精制方法、序列確定方法等與上述復(fù)制盒的情況相同。
[0153]為了判斷是否誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，可以利用以下的形態(tài)學(xué)觀察來(lái)進(jìn)行。即，若使附著于培養(yǎng)容器的底部的細(xì)胞感染本發(fā)明的重組病毒并經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間，則在倒置顯微鏡下細(xì)胞變圓，從底部剝落并作為具有光澤的細(xì)胞游離在培養(yǎng)液中。此時(shí),細(xì)胞在維持其生命的結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生破裂，可以判斷為誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡。另外，使用了四卩生鎮(zhèn)鹽(MTT、XTT等)的市售的
活細(xì)胞檢測(cè)試劑盒也可以確認(rèn)細(xì)胞死亡。
[0154](4)與⑶46結(jié)合的纖毛蛋白
[0155]進(jìn)而，在另一方式中，本發(fā)明的重組腺病毒可以含有編碼與⑶46結(jié)合的腺病毒纖毛蛋白的基因。[0156]現(xiàn)在，通常所使用的腺病毒載體以51種血清型的人腺病毒中屬于C亞類的5型(或者2型)腺病毒為基本骨架來(lái)制作。5型腺病毒由于其優(yōu)異的基因組入特性而被廣泛使用，但由于與靶細(xì)胞的柯薩奇病毒和腺病毒受體(CAR)結(jié)合并感染，因此，存在難以感染CAR的表達(dá)較低的細(xì)胞這樣的問(wèn)題。特別是滲透、轉(zhuǎn)移及增殖能力較高且惡性度較高的癌細(xì)胞由于CAR的表達(dá)降低，因此，具有5型腺病毒的纖毛蛋白的腺病毒有可能無(wú)法感染這樣的惡性度較高的癌細(xì)胞。
[0157]與此相對(duì)，⑶46在人體中在除紅血球以外的幾乎全部的細(xì)胞中表達(dá)，在惡性度較高的癌細(xì)胞中也表達(dá)。因此，含有編碼與CD46結(jié)合的腺病毒纖毛蛋白的基因的重組腺病毒也可以感染CAR陰性且惡性度較高的癌細(xì)胞。例如，34型及35型腺病毒作為受體與⑶46結(jié)合，感染細(xì)胞(Marko Marttila, et al.，J.Virol.2005，79 (22):14429-36)。如上所述，⑶46由于在人體中在除紅血球以外的幾乎全部的細(xì)胞中表達(dá)，因此34型及35型腺病毒可感染包括CAR陰性細(xì)胞在內(nèi)的廣泛的細(xì)胞。另外，腺病毒的纖毛由頭節(jié)區(qū)域()7'領(lǐng)域)、軸區(qū)域及尾部區(qū)域構(gòu)成，腺病毒由于通過(guò)纖突結(jié)區(qū)域(纖毛蛋白頭部、纖毛頭節(jié)區(qū)域)與受體結(jié)合而感染細(xì)胞，因此通過(guò)將纖毛蛋白的至少纖突結(jié)區(qū)域由源自5型腺病毒的物質(zhì)置換為源自34型或35型腺病毒的物質(zhì)，該病毒可以經(jīng)由⑶46感染CAR陰性細(xì)胞。
[0158]本發(fā)明的重組腺病毒通過(guò)含有編碼與CD46結(jié)合的腺病毒的纖毛蛋白的基因，可以感染除紅血球以外的幾乎全部的細(xì)胞，因此，可感染滲透、轉(zhuǎn)移及增殖能力較高且惡性度較高的CAR陰性癌細(xì)胞。在本發(fā)明中，所謂“CAR陰性”細(xì)胞是指CAR的表達(dá)較低的細(xì)胞或完全不表達(dá)的細(xì)胞。
[0159]目前，人腺病毒鑒定有57種血清型，它們分類為A~F組這6個(gè)組。其中，報(bào)告有屬于B組的腺病毒與CD46結(jié)合。作為屬于B組的腺病毒，除34型及35型腺病毒以外,例如可以舉出:3型、7型、11型、16型、21型、50型腺病毒。
[0160]作為本發(fā)明的與CD46結(jié)合的腺病毒的纖毛蛋白，優(yōu)選屬于B組的腺病毒的纖毛蛋白，更優(yōu)選3型、7型、34型、·35型、11型、16型、21型及50型腺病毒的纖毛蛋白，進(jìn)一步優(yōu)選34型及35型腺病毒的纖毛蛋白。
[0161]編碼34型、35型、3型、7型、11型、16型、21型或50型腺病毒的纖毛蛋白的基因的堿基序列可以分別從NCBI (國(guó)家生物技術(shù)信息中心)的GenBank等公知的基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得。另外，在本發(fā)明中，編碼34型、35型、3型、7型、11型、16型、21型或50型腺病毒的纖毛蛋白的基因的喊基序列中，除從上述數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的各基因的喊基序列以外，也包括與由相對(duì)于由該堿基序列構(gòu)成的DNA互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有與CD46的結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。
[0162]與⑶46的結(jié)合活性可以通過(guò)測(cè)定具有含有該堿基序列的DNA的重組腺病毒對(duì)于CD46表達(dá)細(xì)胞的感染性來(lái)評(píng)價(jià)。重組腺病毒的感染性的測(cè)定例如可以使用用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)感染了 CD46表達(dá)細(xì)胞的病毒表達(dá)的GFP等公知的方法來(lái)進(jìn)行。關(guān)于雜交的方法及嚴(yán)謹(jǐn)條件等與上述相同。
[0163]本發(fā)明的重組腺病毒可以含有與CD46結(jié)合的腺病毒的纖毛蛋白的全部或一部分的區(qū)域，只要該纖毛蛋白的至少纖突結(jié)區(qū)域與CD46結(jié)合即可。即，在本發(fā)明中，與CD46結(jié)合的腺病毒的纖毛蛋白只要含有屬于B組的腺病毒的纖毛蛋白的至少纖突結(jié)區(qū)域即可，更優(yōu)選含有選自由34型、35型、3型、7型、11型、16型、21型及50型構(gòu)成的組中的類型的腺病毒的纖毛蛋白的至少纖突結(jié)區(qū)域，進(jìn)一步優(yōu)選含有34型或35型腺病毒的纖毛蛋白的至少纖突結(jié)區(qū)域。另外，本發(fā)明的技術(shù)思想為只要與CD46結(jié)合就不限定于纖毛蛋白，擴(kuò)及可與CD46結(jié)合的各種蛋白質(zhì)及具有可與CD46結(jié)合的基序(模體)的蛋白質(zhì)。
[0164]另外，在本發(fā)明中，與CD46結(jié)合的纖毛蛋白可以含有由屬于B組的腺病毒的纖毛蛋白的纖突結(jié)區(qū)域及纖毛軸區(qū)域構(gòu)成的區(qū)域，更優(yōu)選含有由選自由34型、35型、3型、7型、11型、16型、21型及50型構(gòu)成的組中的類型的腺病毒的纖毛蛋白的纖突結(jié)區(qū)域及纖毛軸區(qū)域構(gòu)成的區(qū)域，進(jìn)一步優(yōu)選含有由34型或35型腺病毒的纖毛蛋白的纖突結(jié)區(qū)域及纖毛軸區(qū)域構(gòu)成的區(qū)域。
[0165]在本發(fā)明中，與CD46結(jié)合的纖毛蛋白可以含有屬于B組的腺病毒的纖毛蛋白的至少纖突結(jié)區(qū)域，也可以含有上述類型以外的類型(例如2型、5型)的腺病毒的纖毛蛋白的纖毛軸區(qū)域或纖毛尾部區(qū)域。
[0166]作為這樣的纖毛蛋白，例如可以舉出:含有由選自由34型、35型、3型、7型、11型、16型、21型及50型構(gòu)成的組中的類型的腺病毒的纖毛蛋白的纖突結(jié)區(qū)域及纖毛軸區(qū)域以及5型腺病毒的纖毛蛋白的纖毛尾部區(qū)域構(gòu)成的區(qū)域的纖毛蛋白，但并不限定于此。
[0167]將編碼34型腺病毒的纖毛蛋白的纖突結(jié)區(qū)域的基因、編碼纖毛軸區(qū)域的基因、以及編碼由纖突結(jié)區(qū)域及纖毛軸區(qū)域構(gòu)成的區(qū)域的基因的堿基序列分別以序列號(hào)47、48及49表示。
[0168]另外，將編碼由34型腺病毒的纖毛蛋白的纖突結(jié)區(qū)域及纖毛軸區(qū)域以及5型腺病毒的纖毛蛋白的纖毛尾部區(qū)域構(gòu)成的區(qū)域的基因的堿基序列以序列號(hào)50表示。在本發(fā)明中，上述基因的喊基序列中，除序列號(hào)50所不的喊基序列以外，也包括與由相對(duì)于由該喊基序列構(gòu)成的DNA互補(bǔ)的堿基序列構(gòu)成的DNA在嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交、且編碼具有與CD46的結(jié)合活性的蛋白質(zhì)的堿基序列。關(guān)于與CD46的結(jié)合活性的評(píng)價(jià)方法、雜交的方法及嚴(yán)謹(jǐn)條件等與上述相同?！?br> [0169]本發(fā)明的重組腺病毒可以通過(guò)使用適當(dāng)?shù)南拗泼盖谐龊袕?fù)制盒、標(biāo)記盒和/或細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒的多核苷酸并插入于適當(dāng)?shù)牟《颈磉_(dá)載體中來(lái)制作。作為病毒表達(dá)載體，優(yōu)選腺病毒載體，更優(yōu)選5型腺病毒載體,特別優(yōu)選含有編碼與CD46結(jié)合的腺病毒的纖毛蛋白(例如34型或35型腺病毒的纖毛蛋白)的基因的5型腺病毒載體。
[0170]需要說(shuō)明的是，如后述的實(shí)施例2所示，在復(fù)制盒的下游插入miRNA靶序列的情況及在標(biāo)記盒的下游插入miRNA靶序列的情況下，可分別充分地抑制血液細(xì)胞中的GFP的表達(dá)，但在同時(shí)插入于復(fù)制盒的下游及標(biāo)記盒的下游兩者的情況下，可顯著抑制血液細(xì)胞中的GFP的表達(dá)至出乎意料的程度。這為本發(fā)明中的新的見解。
[0171]在本發(fā)明中，重組腺病毒例如可以利用以下的方法獲得。
[0172]首先，對(duì)pHMCMV5 (Mizuguchi H.e t a 1., Human GeneTherapy, 10; 2013-2017, 1999)進(jìn)行限制酶處理并插入miRNA的靶序列，制作具有miRNA的靶序列的載體。接著，對(duì)含有hTERT啟動(dòng)子-E1A-1RES-E1B的結(jié)構(gòu)的pSh-hAIB (W02006/036004)進(jìn)行限制酶處理，將得到的含有hTERT啟動(dòng)子-E1A-1RES-E1B的結(jié)構(gòu)的片段插入到上述具有miRNA的靶序列的載體中，得到含有hTERT啟動(dòng)子-ElA-1RES-ElB-miRNA靶序列的載體。另一方面,對(duì)pHMCMVGFP-Ι (插入有EGFP基因的PHMCMV5)進(jìn)行限制酶處理，獲得含有CMV啟動(dòng)子及EGFP基因的片段，將該片段插入到上述具有miRNA的靶序列的載體中，得到含有CMV-EGFP-miRNA靶序列的結(jié)構(gòu)的載體。然后，分別對(duì)含有hTERT啟動(dòng)子-ElA-1RES-ElB-miRNA靶序列的載體和含有CMV-EGFP-miRNA靶序列的載體進(jìn)行限制酶處理、連接，由此可得到在腺病毒基因組的El缺失區(qū)域中組入有hTERT啟動(dòng)子-ElA-1RES-ElB-miRNA靶序列，且在E3缺失區(qū)域中組入有CMV-EGFP-miRNA靶序列的載體。另外，通過(guò)使用含有編碼與CD46結(jié)合的腺病毒的纖毛蛋白的基因的載體作為插入含有結(jié)構(gòu)的DNA片段的載體，可以得到在腺病毒基因組的El缺失區(qū)域中組入有hTERT啟動(dòng)子-ElA-1RES-ElB-miRNA靶序列，并且在E3缺失區(qū)域中組入有CMV-EGFP-miRNA靶序列，且含有編碼與CD46結(jié)合的腺病毒的纖毛蛋白的基因的載體。然后，以公知的限制酶將該載體線性化后，通過(guò)轉(zhuǎn)染于293細(xì)胞等培養(yǎng)細(xì)胞，可以制作具有感染性的重組腺病毒。需要說(shuō)明的是，若為本領(lǐng)域技術(shù)人員，則可以通過(guò)稍微改變上述制造方法來(lái)容易地制作本發(fā)明涉及的全部的病毒。
[0173]3.癌細(xì)胞的檢測(cè)用試劑或癌的診斷用試劑
[0174]如上所述，本發(fā)明的重組腺病毒具有以下的特征。
[0175](i)感染除紅血球以外的幾乎全部的細(xì)胞，也可感染惡性度高的CAR陰性癌細(xì)胞；
[0176](ii)在表達(dá)hTERT的癌細(xì)胞中特異性地增殖，另外，可以通過(guò)增殖使報(bào)告基因的表達(dá)量增加，使標(biāo)記蛋白質(zhì)及發(fā)色物質(zhì)等的生成量增加至可檢測(cè)的水平；
[0177](iii)即使在暫時(shí)感染具有hTERT啟動(dòng)子活性的正常細(xì)胞的情況下，通過(guò)miRNA的表達(dá)，也可抑制該病毒的增殖，另外，可抑制報(bào)告基因的表達(dá)，因此，可以抑制假陽(yáng)性的產(chǎn)生。特別是在通過(guò)含有血液細(xì)胞特異性表達(dá)的miRNA的靶序列，即使病毒暫時(shí)感染具有hTERT啟動(dòng)子活性的正常血液細(xì)胞的情況下，通過(guò)該miRNA的表達(dá)，也可抑制該病毒在血液細(xì)胞中的增殖，另外，可抑制報(bào)告基因的表達(dá)，因此可抑制假陽(yáng)性的產(chǎn)生。
·[0178]因此，本發(fā)明的重組腺病毒可以用作癌細(xì)胞的檢測(cè)用試劑或癌的診斷用試劑。特別是本發(fā)明的重組病毒具有如上所述的特征，因此，對(duì)存在于血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cells:CTC))的檢測(cè)極有效。
[0179]因此，在2004 年在新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志(New England Journal of Medicine)(Cristofanilli M.et al., The New EnglandJournal of Medicine, 2004，781-791)中報(bào)告有使作為存在于血液中的癌細(xì)胞的CTC成為術(shù)后乳癌患者的預(yù)后因子以來(lái)，在歐美已經(jīng)在大量的臨床試驗(yàn)中測(cè)定CTC作為生物標(biāo)記，特別是證明在乳癌、前列腺癌及皮膚癌中CTC為確定其預(yù)后的獨(dú)立的因子。另外，在歐洲，在前列腺癌的輔助治療的臨床試驗(yàn)(SUCCESS)中，將所統(tǒng)計(jì)的CTC的個(gè)數(shù)放入入選標(biāo)準(zhǔn)，僅納入檢測(cè)到I個(gè)以上的患者。該試驗(yàn)為納入2000例以上的大規(guī)模臨床試驗(yàn)，其結(jié)果備受關(guān)注。另外，CTC的增減本身也存在成為臨床終點(diǎn)之一的臨床試驗(yàn)(MDV3100)。
[0180]近年來(lái)，由美國(guó)的FDA發(fā)表涉及分子靶抗癌劑的許可的指導(dǎo)方針，癌的診斷中的CTC檢查的重要性進(jìn)一步提高。由FDA發(fā)表的指導(dǎo)方針中規(guī)定，在選擇分子靶向抗癌劑時(shí)，需要檢查腫瘤中的分子靶的基因變化等。若要以現(xiàn)有的技術(shù)實(shí)現(xiàn)該指導(dǎo)方針，則外科上需要由患者的腫瘤組織進(jìn)行活檢(Biopsy)并進(jìn)行基因檢查，迫使患者承擔(dān)非常強(qiáng)的負(fù)擔(dān)。為了解決該問(wèn)題，研究對(duì)從血液中采集的CTC進(jìn)行基因檢查，相對(duì)于現(xiàn)有的“活檢”稱為“液體活檢(liquid biopsy)”。若實(shí)現(xiàn)該研究，可以僅通過(guò)采集血液來(lái)進(jìn)行腫瘤組織的基因檢查，可大幅減輕對(duì)患者的負(fù)擔(dān)，因此，CTC檢查為有用性非常高的檢查技術(shù)，在臨床現(xiàn)場(chǎng)備受關(guān)注。
[0181]目前，在CTC檢測(cè)設(shè)備中受到FDA承認(rèn)的僅為Ver i dex公司的細(xì)胞檢驗(yàn)系統(tǒng)(CellSearch System),臨床試驗(yàn)中所使用的CTC檢測(cè)方法幾乎均利用細(xì)胞檢驗(yàn)系統(tǒng)。細(xì)胞檢驗(yàn)系統(tǒng)將用EpCAM抗體及細(xì)胞角蛋白抗體檢測(cè)癌細(xì)胞作為基本技術(shù)。
[0182]然而，CTC檢測(cè)技術(shù)為從10億個(gè)血液細(xì)胞中檢測(cè)幾個(gè)~幾十個(gè)細(xì)胞的方法，因此，提高靈敏度及精度極其困難，在利用細(xì)胞檢驗(yàn)系統(tǒng)的CTC檢測(cè)方法中也指出幾個(gè)問(wèn)題。例如指出在利用細(xì)胞檢驗(yàn)系統(tǒng)的CTC檢查中，陰性癌細(xì)胞在另一檢查中檢測(cè)為陽(yáng)性，靈敏度及精度因癌種的不同具有較大的差異等(Allard ff.J.et al., ClinicalCancer Research, 2004, 6897-6904)。另外，對(duì)細(xì)胞檢驗(yàn)系統(tǒng)而言，在臨床現(xiàn)場(chǎng)中肺癌的CTC檢測(cè)率較低也作為問(wèn)題被舉出(Allard ff.J.et al., Clinical CancerResearch, 2004, 6897-6904)。
[0183]另外，對(duì)細(xì)胞檢驗(yàn)系統(tǒng)而言，在引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT:Epithelial-MesenchymalTransition)的癌細(xì)胞中，含有EpCAM的細(xì)胞表面抗原的表達(dá)降低，因此，CTC檢測(cè)率降低也作為問(wèn)題被舉出(Anieta M.et.al., J Natl Cancer Inst, 101，2009，61-66、Janice Luet.al., Int J Cancer, 126 (3), 2010, 669-683)。
[0184]進(jìn)而，為了進(jìn)行上述“液體活檢”，需要濃縮CTC且進(jìn)行表型及基因分型的工序，因此，要求比僅統(tǒng)計(jì)CTC數(shù)更高的靈敏度及高精度的CTC檢測(cè)技術(shù)。
[0185]與此相對(duì)，本發(fā)明的重組腺病毒具有上述(i)~(iii)的特征，因此，可在未檢測(cè)出白血球等正常血液細(xì)胞的情況下簡(jiǎn)便、高靈敏度且高精度地檢測(cè)出血液中的CTC。進(jìn)而，本發(fā)明的試劑由于可在CTC保持存活的狀態(tài)下檢測(cè)，因此，通過(guò)分析存在于CTC的細(xì)胞表面上的表面抗原等，可以明確所檢測(cè)的CTC源自哪一個(gè)臟器等。因此，本發(fā)明的重組腺病毒對(duì)CTC的檢測(cè)及癌的診斷有用·。
[0186]另外，通過(guò)使用本發(fā)明的重組腺病毒或癌細(xì)胞的檢測(cè)用試劑，可以檢測(cè)出引起EMT或間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET:Mesenchymal-Epithelial Transition)的癌細(xì)胞。EMT為癌細(xì)胞喪失作為上皮的特性，獲得容易移動(dòng)到周邊組織的作為間質(zhì)系細(xì)胞的特征的現(xiàn)象，也參與到癌細(xì)胞的滲透及轉(zhuǎn)移中。另一方面，間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(MET)是指間質(zhì)化的細(xì)胞獲得作為上皮的特征的現(xiàn)象。如上所述,相對(duì)于在CellSerch系統(tǒng)等公知的方法中難以檢測(cè)出引起EMT的癌細(xì)胞，在本發(fā)明中可以檢測(cè)出引起EMT或MET的癌細(xì)胞，因此，本發(fā)明的重組腺病毒對(duì)于癌細(xì)胞的檢測(cè)及癌的診斷有用。
[0187]進(jìn)而，通過(guò)使用本發(fā)明的重組腺病毒，可以檢測(cè)耐藥性癌細(xì)胞。在本發(fā)明中，所謂藥物是指癌的化學(xué)療法中所使用的藥物。作為這樣的藥物，例如可以舉出:阿霉素、卡鉬、順鉬、5-氟尿嘧啶、絲裂霉素、博來(lái)霉素、多柔比星、柔紅霉素、甲氨蝶呤、紫杉醇、多西紫杉醇及放線菌素D等，但不限定于這些。另外，通過(guò)使用本發(fā)明的重組病毒，可以檢測(cè)癌干細(xì)胞(cancer stem cells)。在本發(fā)明中，癌干細(xì)胞是指作為癌細(xì)胞的起源的細(xì)胞(干細(xì)胞)。癌干細(xì)胞也包括具有耐藥性的細(xì)胞。
[0188]在本發(fā)明中成為檢測(cè)或診斷的對(duì)象的癌或腫瘤的種類沒有限定，可以使用所有種類的癌的細(xì)胞。例如可以舉出固體癌或血液腫瘤，具體而言，可以舉出:腦腫瘤、頸癌、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、胰腺癌、胃癌、小腸癌、十二指腸癌、大腸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巢癌、甲狀腺癌、膽囊癌、鼻咽癌、肉瘤、黑素瘤、白血病、淋巴瘤及多發(fā)性骨髓瘤(MM)。源自人的組織的癌細(xì)胞幾乎(85%以上)顯示端粒酶活性的上升，本發(fā)明可全部檢測(cè)出表達(dá)這樣的端粒酶的癌細(xì)胞。
[0189]另外，在本發(fā)明中，CTC只要為存在于血液中的癌細(xì)胞就沒有限定，不僅包括從固體癌中游離的癌細(xì)胞，而且也包括上述白血病細(xì)胞或淋巴瘤細(xì)胞等血液腫瘤細(xì)胞。但是，在CTC為血液腫瘤細(xì)胞的情況下，作為本發(fā)明的腺病毒中所含的miRNA靶序列，優(yōu)選為正常血液細(xì)胞特異性表達(dá)的miRNA的靶序列。
[0190]本發(fā)明的試劑可以通過(guò)在利用例如凍結(jié)等方法使重組腺病毒容易處理后，直接或者與賦形劑、增量劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑等公知的藥學(xué)上所容許的載體、公知的添加劑(包括緩沖劑、張度劑、螯合劑、著色劑、保存劑、香料、風(fēng)味劑、甜味劑等)等混合來(lái)制造。
[0191]4.癌細(xì)胞的檢測(cè)方法或癌的診斷方法
[0192]進(jìn)而，通過(guò)使本發(fā)明的重組腺病毒與癌細(xì)胞接觸來(lái)檢測(cè)該癌細(xì)胞發(fā)出的熒光或顏色，可以進(jìn)行癌細(xì)胞的檢測(cè)或癌的診斷。
[0193]在本發(fā)明中，所謂“接觸”是指使癌細(xì)胞和本發(fā)明的重組腺病毒存在于同一反應(yīng)體系中，例如可以舉出:在含有癌細(xì)胞的試樣中添加本發(fā)明的重組腺病毒、混合癌細(xì)胞和該重組腺病毒、在重組腺病毒的存在下培養(yǎng)癌細(xì)胞等，包括使該重組腺病毒感染癌細(xì)胞。另外，在本發(fā)明中，“熒光或顏色”只要為由從報(bào)告基因中表達(dá)的蛋白質(zhì)產(chǎn)生的光或顏色就沒有特別限定，例如可以舉出=GFP等標(biāo)記蛋白質(zhì)發(fā)出的熒光、通過(guò)利用熒光素酶的酶反應(yīng)而生成的發(fā)光物質(zhì)發(fā)出的光、通過(guò)β_半乳糖苷酶和X-gal的酶反應(yīng)而生成的發(fā)色物質(zhì)發(fā)出的藍(lán)色等。
[0194]用于癌細(xì)胞的檢測(cè)方法或癌的診斷方法的癌細(xì)胞可以源自從受試者中采集的生物試樣。從受試者中所提取的生物試樣只要為含有癌細(xì)胞的組織就沒有限定，例如可以舉出:血液、腫瘤組織、淋巴組織等。另外，癌細(xì)胞可以為血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)，關(guān)于CTC的說(shuō)明與上述相同?！?br> [0195]使用本發(fā)明的試劑的癌細(xì)胞的檢測(cè)及癌的診斷例如可以如下所述進(jìn)行。
[0196]在從受試者中采集的生物試樣為血液的情況下，添加紅血球溶血試劑從其血液試樣中除去紅血球，在試管內(nèi)，將一定的比率(0.01~1000M0I (感染復(fù)數(shù))、優(yōu)選0.1~100M01、更優(yōu)選I~10M0I)的本發(fā)明的試劑混合于其它的細(xì)胞懸浮液中。在室溫或37°C下放置或回轉(zhuǎn)培養(yǎng)一定的時(shí)間(例如4~96小時(shí)、優(yōu)選12~72小時(shí)、更優(yōu)選18~36小時(shí))，促進(jìn)病毒在癌細(xì)胞中的感染及增殖。以流式細(xì)胞術(shù)定量分析其細(xì)胞組分中的GFP熒光表達(dá)?；蛞詿晒怙@微鏡觀察GFP表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)分析。使用該系統(tǒng)可高靈敏度地檢測(cè)存在于外周血液中的CTC。該方法可用于檢測(cè)僅極微量存在于外周血液中的CTC。
[0197]在CTC的檢測(cè)中使用流式細(xì)胞術(shù)的情況下，例如可以利用以下的基準(zhǔn)判定GFP的陽(yáng)性或陰性，檢測(cè)CTC。
[0198]首先，分析未感染病毒的樣品中的細(xì)胞群，得到背景熒光值。相對(duì)于其熒光最大值設(shè)定閾值，接著，分析感染了本發(fā)明的病毒的樣品中的細(xì)胞群，將顯示閾值以上的熒光值的樣品中的細(xì)胞群判定為GFP陽(yáng)性。在使用從受試者中采集的血液試樣的情況下，GFP陽(yáng)性細(xì)胞可以檢測(cè)為CTC。進(jìn)而，也可以濃縮GFP陽(yáng)性細(xì)胞(CTC)并進(jìn)行表型或基因分型。
[0199]在本發(fā)明中，作為受試者，例如可以舉出:人、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠、貓、狗、山羊、豬、綿羊、牛、馬、猴等哺乳動(dòng)物。[0200]本發(fā)明的試劑的使用量可根據(jù)用于檢測(cè)的生物試樣的狀態(tài)及量以及使用的檢測(cè)方法等適宜選擇。例如，在血液試樣的情況下，可以在相對(duì)于血液試樣I~50ml、優(yōu)選3~25ml、更優(yōu)選5~15ml為約0.01~1000M01、優(yōu)選0.1~100M01、更優(yōu)選I~10M0I的范圍內(nèi)使用。所謂MOI是指使一定量的培養(yǎng)細(xì)胞感染一定量的病毒粒子時(shí)的病毒量(感染單位)和細(xì)胞數(shù)之比，可用作使細(xì)胞感染病毒時(shí)的指標(biāo)。
[0201]為了使重組病毒感染細(xì)胞，例如有以下的方法。首先，將細(xì)胞接種于裝有適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液的培養(yǎng)板中，在二氧化碳存在下在37°C下培養(yǎng)。培養(yǎng)液米用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中通常所使用的DMEM、MEM、RPM1-1640等，可以根據(jù)需要添加血清、抗生素、維生素等。通過(guò)接種一定量的病毒，例如0.1~10M0I，感染培養(yǎng)的細(xì)胞。
[0202]為了確認(rèn)病毒增殖，可以回收病毒感染細(xì)胞，提取DNA，以本發(fā)明的病毒所具有的適當(dāng)?shù)幕蜃鳛榘惺褂靡镞M(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，由此進(jìn)行定量分析。
[0203]在使用GFP基因作為報(bào)告基因的情況下，關(guān)于所標(biāo)記的細(xì)胞的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)病毒增殖的細(xì)胞可以通過(guò)照射激發(fā)光來(lái)發(fā)出規(guī)定的熒光(例如在GFP的情況下為綠色熒光)，由此使癌細(xì)胞可見。例如，若在熒光顯微鏡下觀察病毒感染細(xì)胞，則可在細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)GFP熒光表達(dá)。另外，為了經(jīng)時(shí)觀察病毒感染細(xì)胞，可以使用CXD照相機(jī)經(jīng)時(shí)觀察GFP熒光表達(dá)。
[0204]另外，本發(fā)明的試劑也可以實(shí)時(shí)檢測(cè)存在于生物體內(nèi)的癌細(xì)胞。為了在生物體內(nèi)實(shí)時(shí)標(biāo)記及檢測(cè)細(xì)胞，只要將本發(fā)明的重組腺病毒給藥到生物體內(nèi)即可。
[0205]本發(fā)明的試劑也可以直接應(yīng)用于患部，也可以利用所有公知的方法，例如向靜脈、肌肉、腹腔內(nèi)或皮下等的注射、由鼻腔、口腔或肺的吸入、經(jīng)口給藥、使用導(dǎo)管等的血管內(nèi)給藥等組入到生物體(成為對(duì)象的細(xì)胞及臟器)中。優(yōu)選可例示:向肌肉、腹腔等中的局部注射、向靜脈的注射等。
[0206]在對(duì)受試者給藥本·發(fā)明的試劑的情況下，其給藥量可根據(jù)有效成分的種類、給藥徑路、給藥對(duì)象、患者的年齡、體重、性別、癥狀及其它的條件適宜選擇，作為一天給藥量，通常優(yōu)選將作為有效成分的本發(fā)明病毒的量設(shè)為IO6~IO11PFU(蝕斑形成單位(plaqueforming units))左右,優(yōu)選設(shè)為IO9~IO11PFU左右，也可以I天給藥I次，也可以分多次給藥。
[0207]在生物體內(nèi)實(shí)時(shí)觀察癌細(xì)胞的熒光具有用于體內(nèi)診斷劑的優(yōu)點(diǎn)。其對(duì)于所謂的導(dǎo)航手術(shù)等有用。關(guān)于導(dǎo)航手術(shù)的詳細(xì)情況記載于國(guó)際公開公報(bào)W02006/036004。
[0208]進(jìn)而，本發(fā)明的試劑由于對(duì)于作為生物標(biāo)記的CTC的檢測(cè)有用，因此，可以通過(guò)使用本發(fā)明的試劑進(jìn)行預(yù)后的判定。
[0209]例如，在本發(fā)明的病毒中使用GFP作為標(biāo)記蛋白質(zhì)的情況下，首先，使本發(fā)明的病毒分別感染從以任意的癌治療方法(例如化學(xué)療法、放射線療法、外科手術(shù)等)治療癌患者之前的患者中采集的生物試樣和在治療經(jīng)過(guò)一定時(shí)間(例如I~90天)后的時(shí)刻采集的生物試樣。接著，在同一條件下比較治療前采集的試樣中所含的GFP陽(yáng)性細(xì)胞和在治療后的某一時(shí)刻采集的試樣中所含的GFP陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。其結(jié)果，若治療后的GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比治療前減少，則可以判定為預(yù)后提高。
[0210]下面，利用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明詳細(xì)地進(jìn)行說(shuō)明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
[0211]實(shí)施例1
[0212]Ad34 纖毛(Ad34f iber) 142~3pT 的制作[0213](I) pHMCMV5-miR-142-3pT 的制作
[0214]對(duì)pHMCMV5(MizuguchiH.et al., Human Gene Therapy, 10;2013-2017，1999)進(jìn)行Notl/KPnl處理，得到片段，將該片段與通過(guò)對(duì)下述的合成寡DNA進(jìn)行退火而制作的雙股寡(夕' 7'卟 7 卜 9 > K 才 V 3' )連接，由此制作 pHMCMV5-miR-142-3pT(pre)。
[0215]miR-142-3pT-Sl:
[0216]5' -GGCCTCCATAAAGTAGGAAACACTACACAGCTCCATAAAGTAGGAAACACTACATTAATTAAGCGGTAC-3'(序列號(hào)43、下劃線為miR-142-3p靶序列)
[0217]miR-142-3pT-ASl:
[0218]5' ~CGCTTAATTAATGTAGTGTTTCCTACTTTATGGAGCTGTGTAGTGTTTCCTACTTTATGGA~3/
(序列號(hào)44、下劃線為miR-142-3p靶序列)
[0219]接著，對(duì)pHMCMV5-miR-142-3pT(pre)進(jìn)行Pacl/Kpnl處理，得到片段，將該片段與通過(guò)對(duì)以下的合成寡DNA進(jìn)行退火而制作的雙股寡連接，得到具有miR-142-3p靶序列的4次重復(fù)序列的 pHMCMV5-miR-142-3pT。
[0220]miR-142-3pT-S2:
[0221]5, -TCCATAAAGTAGGAAACACTACAGGACTCCATAAAGTAGGAAACACTACAGTAC-3'(序列號(hào)45、下劃線為miR-142-3p靶序列)
[0222]miR-142-3pT-AS2:·[0223]5' -TGTAGTGTTTCCTACTTTATGGAGTCCTGTAGTGTTTCCTACTTTATGGAAT-3'(序列號(hào)46、下劃線為miR-142-3p靶序列)
[0224](2)作為 El 穿梭質(zhì)粒(Elshuttle plasmid)的 pHM5-hAIB-miR-142_3pT 的制作
[0225]用1-Ceul/Pmel 消化 pSh_hAIB (W02006/036004)，使用瓊脂糖凝膠對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行電泳。從凝膠中切出約4.5kbp (hAIB盒(hAIB cassette))的帶，使用GENECLEANII (Q-Biogene公司)精制回收DNA片段。用NheI消化精制后的DNA片段(hAIB盒)和pHMCMV5-miR-142-3pT后，用克列諾片段處理，進(jìn)而用1-CeuI消化，將得到的片段連接，得到具有hTERT啟動(dòng)子、ElA基因、IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))序列、ElB基因及miR-142-3pT 靶序列的 pHM5-hAIB-miR-142_3pT。
[0226](3)作為 E3 穿梭質(zhì)粒(E3shuttle plasmid)的 pHM13CMV-EGFP-miR-142_3pT 的制作
[0227]用ApaI及NotI消化pEGFP-Nl (Clontech公司)，將得到的消化產(chǎn)物插入到PHMCMV5 的 Apal/Notl 位點(diǎn)中，得到 pHMCMVGFP-1。用 Pmel/Hindlll 消化 pHMCMVGFP-1，使用瓊脂糖凝膠對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行電泳。從凝膠中切出約750bp (EGFP)的帶，使用GENECLEANII精制回收DNA片段。用HincII/Hindlll消化精制后的DNA片段(EGFP)和pBluescriptllKS+,將得到的片段連接，制作pBSKS-EGFP。用Apal/Xbal消化pBSKS_EGFP，使用瓊脂糖凝膠對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行電泳。從凝膠中切出約750bp (EGFP)的帶，使用GENECLEANII精制回收DNA片段。用Apal/Xbal消化精制后的DNA片段(EGFP)和pHMCMV5-miR-142-3pT，將得到的片段連接，獲得 pHMCMV5-EGFP-miR-142-3pT。用 BglII 消化pHMCMV5-EGFP-miR-142_3pT，使用瓊脂糖凝膠對(duì)消化產(chǎn)物進(jìn)行電泳。從凝膠中切出約2kbp (CMV-EGFP-miR-142-3pT)的帶，使用GENECLEANII精制回收DNA片段。用BamHI消化精制后的DNA片段(CMV-EGFP-miR-142_3pT)和 pHM13 (Mizuguchi et al., Biotechniques, 30; 1112-1116, 2001)后，將用 CIP (AlkalinePhosphatase, Calf Intest)處理了的片段連接，由此得到 pHM13CMV-EGFP-miR-142_3pT。
[0228](4) pAdHM49-hAIB142-3pT-CG142-3pT 的制作
[0229]通過(guò)將對(duì)pAdHM49 (Mizuguchi et al, J.Controlled ReleasellO; 202-211，2005)進(jìn)行1-CeuI/P1-Scel處理而得到的片段和同樣地進(jìn)行1-CeuI/P1-Scel處理而得到的pHM5-hAIB-miR-142-3pT連接，制作在Ad載體的El缺失區(qū)域中組入有hTERT啟動(dòng)子、ElA基因、IRES 序列、ElB 基因及 miR-142-3pT 靶序列的 pAdHM49-hAIB142_3pT。pAdHM49 為將含有編碼5型腺病毒纖毛的纖突結(jié)及纖毛軸的基因的區(qū)域置換為含有編碼34型腺病毒纖毛的纖突結(jié)及纖毛軸的基因的區(qū)域的重組腺病毒，含有編碼由34型腺病毒的纖毛蛋白的纖突結(jié)區(qū)域及纖毛軸區(qū)域構(gòu)成的區(qū)域的基因的堿基序列(序列號(hào)49)。用序列號(hào)50表示編碼pAdHM49的纖毛蛋白(34型腺病毒纖毛的纖突結(jié)區(qū)域及纖毛軸區(qū)域以及5型腺病毒纖毛的纖毛尾部區(qū)域)的基因的堿基序列。在序列號(hào)50所示的堿基序列中，編碼5型腺病毒纖毛的纖毛尾部區(qū)域的基因的堿基序列為第I~第132的堿基序列，編碼34型腺病毒纖毛的纖毛軸區(qū)域的基因的堿基序列為第133~第402的堿基序列，編碼34型腺病毒纖毛的纖突結(jié)區(qū)域的基因的喊基序列為第403~第975的喊基序列。即，在序列號(hào)50所不的喊基序列中，源自5型腺病毒纖毛的區(qū)域的堿基序列為第I~第132的堿基序列，源自34型腺病毒纖毛的區(qū)域的堿基序列為第133~第975的堿基序列。
[0230]接著，將用Csp45I消化pAdHM49-hAIB142_3pT而得到的片段和用ClaI消化pHM13CMV-EGFP-miR-142-3pT而得到的片段連接。由此，得到在腺病毒載體的El缺失區(qū)域中組入有hTERT啟動(dòng)子、ElA基因、IRES序列、ElB基因及miR-142_3pT靶序列，在E3缺失區(qū)域中組入有CMV啟動(dòng)子、EGFP及miR-142-3pT靶序列，還含有編碼34型腺病毒的纖毛蛋白的基因的 pAdHM49-hAIB142-3pT-CG142-3pT。
[0231](5)Ad34 纖毛 142-3ρΤ(Ε1，Ε3)的制作
[0232]通過(guò)用在pAdHM49-`hAIB142-3pT-CG142-3pT中的腺病毒基因組兩末端存在識(shí)別部位的限制酶PacI切斷而形成線狀，使用Lipofectamine2000 (Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染在60mm培養(yǎng)組織中接種而得到的293細(xì)胞中。約2周后，獲得重組腺病毒Ad34纖毛142-3ρΤ(Ε1，Ε3)(圖1)。
[0233]實(shí)施例2
[0234]Ad34 纖毛 142_3dT(E1,E3)的活件測(cè)定
[0235](I)細(xì)胞
[0236]作為CAR陽(yáng)性細(xì)胞，使用HeLa (源自人子宮癌細(xì)胞)、LN319 (源自人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞)，作為CAR陰性細(xì)胞，使用LNZ308 (源自人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞)、LN444 (源自人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞)、K562(源自人骨髓性白血病細(xì)胞)。Κ562表達(dá)miR-142-3p。HeLa、LN319、LNZ308、LN444使用DMEM(10%FCS、含抗生素)，K562使用RPM1-1640培養(yǎng)基(10%FCS、含抗生素)，在37°C、飽和蒸汽壓、5%C02存在下培養(yǎng)。
[0237](2)使用了流式細(xì)胞術(shù)的Ad34纖毛142_3pT (El, E3)的活性測(cè)定
[0238]將各細(xì)胞以5 X IO4細(xì)胞/500ul/孔接種于24孔板，以10M0I使Ad34纖毛142-3ρΤ(Ε1，Ε3)作用。作為對(duì)照，使用TelomeScan(在5型腺病毒的El缺失部位中依次組入有hTERT啟動(dòng)子、ElA基因、IRES序列、ElB基因，且在E3缺失部位中依次組入有CMV啟動(dòng)子、GFP的限制增殖型腺病毒)。培養(yǎng)24小時(shí)后，回收細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀MACSQuant (Miltenyi Biotec)測(cè)定 GFP 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。
[0239]將其結(jié)果示于圖2。在本說(shuō)明書及圖2中，“TelomeScann(Ad5纖毛)”表示TelomeScan，“Ad34纖毛”表示在腺病毒基因組的El缺失部位中依次組入有hTERT啟動(dòng)子、ElA基因、IRES序列及ElB基因，并且在E3缺失部位中依次組入有CMV啟動(dòng)子、GFP，且含有編碼源自34型腺病毒的纖毛蛋白的基因的重組腺病毒。另外，“Ad34纖毛142-3ρΤ(Ε1)”表示在上述Ad34纖毛的El缺失區(qū)域(ElB基因的下游)中還組入有miR-142_3p的靶序列的重組腺病毒，“Ad34纖毛142-3pT(E3) ”表示在上述Ad34纖毛的E3缺失區(qū)域(GFP基因的下游)中還組入有miR-142-3p的靶序列的重組腺病毒。另外，“Ad34纖毛142_3pT (El, E3) ”表示在上述Ad34纖毛的El及E3缺失區(qū)域(分別為ElB基因的下游及GFP基因的下游)中還組入有miR-142-3p的靶序列的重組腺病毒。另外,在圖2以后的附圖中，(含有GFP)是指在各病毒基因組中插入有GFP基因。
[0240]活性測(cè)定的結(jié)果，在使TelomeScann (Ad5纖毛)感染作為CAR陰性細(xì)胞的LNZ308、LN444、K562的情況下，無(wú)法檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞(圖2，panel k、p及u)，與此相對(duì)，在使其感染Ad34纖毛的情況下，可檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞(在LNZ308中85.5%陽(yáng)性，在LN444中58.4%陽(yáng)性，在 K562 中 63.7% 陽(yáng)性)(panel 1、q、V)。
[0241]由該結(jié)果顯示，具有編碼34型腺病毒的纖毛蛋白的基因的本發(fā)明的重組腺病毒可顯著地檢測(cè)CAR陰性細(xì)胞。
[0242]另外，在用CAR陰性表達(dá)miR-142_3p的K562細(xì)胞中，在使其感染Ad34纖毛的情況下，GFP陽(yáng)性細(xì)胞為63.7%(panel v)，與此相對(duì)，在使其感染Ad34纖毛142_3ρΤ(Ε1)的情況下為12.2%，在使其感染Ad34纖毛142-3pT(E3)的情況下為34.8%，在使其感染Ad34纖毛142-3ρΤ(Ε1, E3)的情況下無(wú)法檢測(cè)(panel W、x、y)。即,在使用在腺病毒基因組的El或E3缺失區(qū)域的任意中組入有miR-142-3p的靶序列的腺病毒的情況下，K562細(xì)胞的檢測(cè)率顯著降低，進(jìn)而在使 用在El及E3缺失區(qū)域這兩者中組入有miR-142-3p的靶序列的腺病毒的情況下，無(wú)法檢測(cè)K562細(xì)胞。
[0243]由該結(jié)果顯示，含有miR-142_3p的靶序列的本發(fā)明的重組病毒未檢測(cè)出高表達(dá)miR-142-3p的細(xì)胞，例如正常的血液細(xì)胞。
[0244]實(shí)施例3
[0245]使用了 Ad34纖毛142-3ρΤ(Ε1，E3)的血液試樣中的癌細(xì)胞的檢測(cè)
[0246]將5X IO4個(gè)H1299細(xì)胞(CAR陽(yáng)性)懸浮于5mL的血液中，使紅血球溶血并回收PBMC0 在其中添加 I X 109、1X 101° 或 IX IO11VP(病毒顆粒(virus particle))量的病毒，一邊用旋轉(zhuǎn)器使其旋轉(zhuǎn)一邊使其在37°C下感染24小時(shí)?；厥占?xì)胞并用抗CD45抗體進(jìn)行免疫染色，在熒光顯微鏡下觀察GFP陽(yáng)性細(xì)胞。已知⑶45為源自除紅血球及血小板以外的血球系的細(xì)胞的表面抗原。圖3及圖4的縱軸中記載的“GFP陽(yáng)性癌細(xì)胞(%) ”表示“GFP陽(yáng)性細(xì)胞中所含的GFP陽(yáng)性且CD45陰性的細(xì)胞數(shù)(%) ”。
[0247]其結(jié)果，在TelomeScann (Ad5纖毛)的感染中觀察到大量的假陽(yáng)性細(xì)胞(GFP陽(yáng)性且⑶45陽(yáng)性)，但在Ad34纖毛142-3ρΤ(Ε1，E3)的感染中假陽(yáng)性非常少，且可以特異性地檢測(cè)癌細(xì)胞。
[0248]另外，進(jìn)行了 H1299細(xì)胞的檢測(cè)特異性的定量分析,結(jié)果,在TelomeScann (Ad5纖毛)中在IX IO9VP量的病毒感染中檢測(cè)出多個(gè)假陽(yáng)性細(xì)胞，但在Ad34纖毛142-3ρΤ(Ε1，E3)中即使增加病毒感染量，檢測(cè)特異性也顯示90%以上，根據(jù)樣品的不同，顯示100%(圖3)。另外，關(guān)于A549細(xì)胞(CAR陽(yáng)性)，也利用同樣的方法進(jìn)行了定量分析，結(jié)果，在I X IO9VP量的病毒感染中檢測(cè)特異性顯示100%(圖4)。由這些結(jié)果顯示，通過(guò)使用本發(fā)明的重組病毒，可以特異性地檢測(cè)PBMC組分中所含的癌細(xì)胞。
[0249]由以上結(jié)果顯示，本發(fā)明的檢測(cè)用試劑及診斷用試劑可以檢測(cè)惡性度較高的CAR陰性的癌細(xì)胞，另一方面，未將高表達(dá)miR-142-3p的正常的血液細(xì)胞(白血球等)等檢測(cè)為假陽(yáng)性，顯示對(duì)于血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Ciculating Tumor Cells:CTC)的檢測(cè)極其有效。
[0250]實(shí)施例4
[0251]各種人癌細(xì)胞株中的Ad34纖毛142-3ρΤ(Ε1，Ε3)的活性測(cè)定
[0252](I)細(xì)胞
[0253]在本實(shí)施例中，作為癌細(xì)胞，使用源自人肺非小細(xì)胞癌的H1299細(xì)胞、源自人肺癌的A549細(xì)胞、源自人乳癌的MCF7細(xì)胞、源自人乳癌的MDA-MB-231細(xì)胞、源自人膀胱癌的KK47細(xì)胞、源自人胃癌的MKN45細(xì)胞、源自人大腸癌的SW620、源自人肝癌的Huh7細(xì)胞、源自人胰腺癌的Panel細(xì)胞、源自人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的LN319細(xì)胞、源自人膀胱癌的T24細(xì)胞、源自人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的LNZ308細(xì)胞、及源自人神經(jīng)膠質(zhì)瘤的LN444細(xì)胞。
[0254](2)使用了流式細(xì)胞術(shù)的Ad34纖毛142_3pT (El, E3)的活性測(cè)定
[0255]將5X IO4個(gè)各種癌細(xì)胞懸浮于500 μ I的培養(yǎng)基中，在其中添加100 μ I調(diào)整為5X IO5或者5Χ 106pfu/ml的限制增殖型Ad懸浮液。將細(xì)胞和限制增殖型Ad的混合液接種于24孔板中，在37°C下培·養(yǎng)24小時(shí)?；厥占?xì)胞，以1500rpm離心5分鐘，除去培養(yǎng)基后，懸浮在含有2%FCS的PBS300y I中，使用流式細(xì)胞儀(MACS Quant Analyzer;MiltenyiBiotec)測(cè)定GFP陽(yáng)性率。數(shù)據(jù)利用FCS多色數(shù)據(jù)分析軟件(Flowjo)分析。
[0256]其結(jié)果，Ad34纖毛142_3ρΤ(Ε1，Ε3)高效地感染幾乎全部的癌細(xì)胞，60%以上為GFP陽(yáng)性。特別是關(guān)于CAR陰性細(xì)胞(T24、LNZ308、LN444)，與現(xiàn)有的TelomeScan相比GFP陽(yáng)性率大幅提聞(圖5)。
[0257]該結(jié)果顯示，通過(guò)使用本發(fā)明的重組病毒，不僅可高效檢測(cè)CAR陽(yáng)性細(xì)胞，而且可高效檢測(cè)CAR陰性細(xì)胞。
[0258]實(shí)施例5
[0259]引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的癌細(xì)胞的檢測(cè)
[0260]通過(guò)將人胰腺癌Panel細(xì)胞在10ng/mL的重組TGF- β I存在下培養(yǎng)6天，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。誘導(dǎo)EMT后，以實(shí)時(shí)RT-PCR測(cè)定編碼E-鈣粘著蛋白、EpCAM, hTERT、N-1丐粘著蛋白、Slug及Snail的mRNA的相對(duì)表達(dá)。進(jìn)而，利用流式細(xì)胞術(shù)分析Panc I細(xì)胞中的CAR及CD46表達(dá)。本發(fā)明的病毒對(duì)細(xì)胞的感染通過(guò)與實(shí)施例4同樣的方法進(jìn)行。
[0261]其結(jié)果顯示，通過(guò)在含有TGF-β的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，作為EMT的標(biāo)記基因的Slug、Snail及N-鈣粘著蛋白的表達(dá)上升，并且作為上皮系的標(biāo)記的E-鈣粘著蛋白、EpCAM的表達(dá)減少，顯示出誘導(dǎo)了 EMT(圖6A)。另外，隨著誘導(dǎo)EMT，CAR的表達(dá)減少，但⑶46的表達(dá)完全未減少(圖6B)。進(jìn)而，在相對(duì)于引起EMT的Panel細(xì)胞使用現(xiàn)有的TelomeScan的情況下，僅約35%為GFP陽(yáng)性，與此相對(duì)，在Ad34纖毛142_3pT (El, E3)中大約90%以上為GFP陽(yáng)性(圖6C)。[0262]由這些結(jié)果顯示，通過(guò)使用本發(fā)明的重組病毒，可高靈敏度地檢測(cè)引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的癌細(xì)胞。
[0263]實(shí)施例6
[0264]癌干細(xì)胞的檢測(cè)
[0265]將MCF7細(xì)胞及MCF7_ADR(對(duì)作為抗癌劑的阿霉素具有耐性的癌細(xì)胞)分別以I X IO3個(gè)/孔接種于96孔板中，第二天，以0.2、1、5、25、125 μ g/mL添加阿霉素。在阿霉素添加24小時(shí)后，使用AlamarBlue (注冊(cè)商標(biāo))細(xì)胞活性試劑測(cè)定細(xì)胞生存率(值:平均土 S.D.(n=6))。
[0266]另外，利用流式細(xì)胞術(shù)分析MCF7細(xì)胞及MCF7-ADR細(xì)胞的CAR、CD46、P-糖蛋白(MDR)、CD24及CD44的表達(dá)。將5 X IO5個(gè)MCF7-ADR細(xì)胞懸浮于含有2%FCS的PBS100 μ I中，加入I μ I FITC標(biāo)記小鼠抗人⑶24抗體、PE標(biāo)記小鼠抗人⑶44抗體，使其在冰上在遮光下反應(yīng)I小時(shí)。用4ml含有2%FCS的PBS清洗后，以1500rpm離心5分鐘，抽吸除去上清液。再次將細(xì)胞懸浮于含有2%FCS的PBSlOOy I中，使用細(xì)胞分選儀(FACS Aria II細(xì)胞分選儀；BD生物科學(xué))分類CD24陰性CD44陽(yáng)性細(xì)胞組分。數(shù)據(jù)利用FCS多色數(shù)據(jù)分析軟件(Flowjo)分析。已知在人乳癌細(xì)胞中具有CD24陰性CD44陽(yáng)性細(xì)胞的特征的組分為癌干細(xì)胞(Al-Hajj M., et al., Proc Natl Acad Sci USA, 100; 3983-3988，(2003))，另外，本發(fā)明的病毒對(duì)細(xì)胞的感染利用與實(shí)施例4同樣的方法進(jìn)行。
[0267]其結(jié)果顯示，MCF7-ADR細(xì)胞與MCF7細(xì)胞相比，在阿霉素存在下也顯著地顯示較高的生存率，具有耐藥性能(圖7A)。另外，MCF7-ADR細(xì)胞與MCF7細(xì)胞，同樣地高表達(dá)CAR及⑶46。另外，高表達(dá)作為承擔(dān)藥物排泄功能的膜蛋白質(zhì)的MDR(圖7B)。進(jìn)而，使MCF-ADR細(xì)胞中的CD24陰性CD44陽(yáng)性細(xì)胞與Ad34纖毛142_3ρΤ(Ε1，E3)作用，結(jié)果，80%以上為GFP陽(yáng)性。另一方面，在現(xiàn)有的TelomeScan中，約70%為GFP陽(yáng)性(圖7C)。
·[0268]由這些結(jié)果顯示，通過(guò)使用本發(fā)明的重組病毒，可檢測(cè)出耐藥性的癌細(xì)胞。另外，顯示，通過(guò)使用本發(fā)明的重組病毒，可檢測(cè)出癌干細(xì)胞。
[0269]實(shí)施例7
[0270]使用了 Ad34纖毛142-3ρΤ(Ε1，Ε3)的血 液試樣中的癌細(xì)胞的檢測(cè)
[0271]使H1299細(xì)胞、T24細(xì)胞以100M0I與表達(dá)紅色熒光蛋白(單體紅色熒光蛋白；RFP)慢性病毒載體作用并培養(yǎng)。然后，為了獲得克隆細(xì)胞，在96孔板中以0.lcells/well的方式接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)直到形成菌落。用熒光顯微鏡選擇表達(dá)RFP的細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后，使用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定RFP表達(dá)強(qiáng)度。而且，將RFP的表達(dá)強(qiáng)度較強(qiáng)的細(xì)胞作為RFP表達(dá)細(xì)胞。
[0272]將由1.0mL的人外周血液得到的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(hPBMC)懸浮于800 μ L的RPM1-1640培養(yǎng)基(10%FCS、含抗生素)中。在hPBMC懸浮液中添加100 μ L調(diào)整為1.0XlO5或者5.0X 105cells/mL的癌細(xì)胞(圖8中，“錐形癌細(xì)胞(spiked cancer cells) ”表示在hPBMC懸浮液中添加的癌細(xì)胞的個(gè)數(shù))。進(jìn)而，添加100 μ L調(diào)整為2Χ 108pfu/mL的限制增殖型Ad懸浮液，形成合計(jì)ImL的懸浮液后，用旋轉(zhuǎn)器使其緩慢旋轉(zhuǎn)，同時(shí)在37°C下培養(yǎng)24小時(shí)。
[0273]以300x g離心病毒感染后培養(yǎng)24小時(shí)的細(xì)胞懸浮液5分鐘，除去上清液。加入細(xì)胞固定液200 μ L，使其在4°C下在遮光狀態(tài)下反應(yīng)15分鐘。加入ImL的PBS，以300xg離心5分鐘，除去上清液。懸浮于含有2%FCS的PBS中，使用流式細(xì)胞儀(MACS QuantAnalyzer ;Miltenyi Biotec)測(cè)定GFP陽(yáng)性率。數(shù)據(jù)利用FCS多色數(shù)據(jù)分析軟件(Flowjo)分析。
[0274]在本研究中，將用RFP (紅色熒光蛋白)標(biāo)記的癌細(xì)胞混入hPBMC中，研究是否可檢測(cè)出hPBMC中的癌細(xì)胞。其結(jié)果，在CAR陽(yáng)性癌細(xì)胞(H1299)的情況下，TelomeScann(Ad5纖毛)、Ad34纖毛143-3ρΤ(Ε1，E3)均可檢測(cè)出80%以上的癌細(xì)胞。另一方面，在CAR陰性癌細(xì)胞(T24)的情況下，在TelomeScann (Ad5纖毛)中，約10%為GFP陽(yáng)性，檢測(cè)效率極低，但在Ad34纖毛143-3ρΤ(Ε1，Ε3)中可檢測(cè)出80%以上的癌細(xì)胞(圖8)。
[0275]由該結(jié)果顯示，通過(guò)使用本發(fā)明的重組腺病毒，不僅可高效檢測(cè)CAR陽(yáng)性癌細(xì)胞，而且也可高效檢測(cè)CAR陰性癌細(xì)胞。
[0276]工業(yè)實(shí)用性
[0277]含有本發(fā)明的重組腺病毒的試劑可在不檢測(cè)出正常的血液細(xì)胞(白血球等)的情況下簡(jiǎn)便且高靈敏度地檢測(cè)CAR陰性癌細(xì)胞。
[0278]序列表 Freetext
[0279]序列號(hào)4:合成DNA
[0280]序列號(hào)5~26:合成RNA
[0281]序列號(hào)27~28:合成DNA
[0282]序列號(hào)43~46:合成DNA
[0283]序列號(hào)50:合成D NA
【權(quán)利要求】
1.一種多核苷酸，其依次含有人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子、ElA基因、IRES序列及ElB基因，并且含有第一微RNA的靶序列。
2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其中，第一微RNA在非癌細(xì)胞中表達(dá)。
3.如權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸，其中，第一微RNA為選自由miR-142、miR-15、miR-16、miR-21、miR-126、miR-181、miR-223、miR-296、miR-125、miR-143、miR-145、miR-199及l(fā)et-7構(gòu)成的組中的至少I個(gè)。
4.一種重組腺病毒，其中，在腺病毒基因組的El區(qū)域中組入有含有權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的多核苷酸的復(fù)制盒。
5.如權(quán)利要求4所述的重組腺病毒，其中，在腺病毒基因組的E3區(qū)域中還組入有標(biāo)記盒，該標(biāo)記盒含有報(bào)告基因及可控制該基因的表達(dá)的啟動(dòng)子。
6.如權(quán)利要求5所述的重組腺病毒，其中，標(biāo)記盒還含有第二微RNA的靶序列。
7.如權(quán)利要求4所述的重組腺病毒，其中，在腺病毒基因組的E3區(qū)域中還組入有細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒，該細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒含有編碼細(xì)胞死亡誘導(dǎo)相關(guān)蛋白質(zhì)的基因及可控制該基因的表達(dá)的啟動(dòng)子。
8.如權(quán)利要求7所述的重組腺病毒，其中，細(xì)胞死亡誘導(dǎo)盒還含有第二微RNA的靶序列。
9.如權(quán)利要求6或8所述的重組腺病毒，其中，第二微RNA在非癌細(xì)胞中表達(dá)。
10.如權(quán)利要求9所述的重組腺病毒，其中，第二微RNA為選自由miR-142、miR-15、miR-16、miR-21、miR-126、miR-181、miR-223、miR-296、miR-125、miR-143、miR-145、miR-199及l(fā)et-7構(gòu)成的組中的至少I個(gè)。`
11.如權(quán)利要求5或6所述的重組腺病毒，其中，報(bào)告基因?yàn)榫幋a發(fā)出熒光的蛋白質(zhì)的基因或編碼通過(guò)酶反應(yīng)產(chǎn)生發(fā)光物質(zhì)或者發(fā)色物質(zhì)的酶蛋白質(zhì)的基因。
12.如權(quán)利要求5~10中任一項(xiàng)所述的重組腺病毒，其中，所述啟動(dòng)子為人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子或巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子。
13.如權(quán)利要求4~12中任一項(xiàng)所述的重組腺病毒，其還含有編碼與⑶46結(jié)合的纖毛蛋白的基因。
14.如權(quán)利要求13所述的重組腺病毒，其中，與⑶46結(jié)合的纖毛蛋白含有34型或35型腺病毒的纖毛蛋白的至少纖突結(jié)區(qū)域。
15.—種癌細(xì)胞的檢測(cè)用試劑,其含有權(quán)利要求4~14中任一項(xiàng)所述的重組腺病毒。
16.一種癌的診斷用試劑，其含有權(quán)利要求4~14中任一項(xiàng)所述的重組腺病毒。
17.如權(quán)利要求15所述的試劑，其中，癌細(xì)胞是源自從受試者中采集的生物試樣的癌細(xì)胞。
18.如權(quán)利要求17所述的試劑，其中，生物試樣為血液。
19.如權(quán)利要求15或18所述的試劑，其中，癌細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
20.如權(quán)利要求15及17~19中任一項(xiàng)所述的試劑，其中，癌細(xì)胞為耐藥性癌細(xì)胞。
21.如權(quán)利要求15及17~20中任一項(xiàng)所述的試劑，其中，癌細(xì)胞為癌干細(xì)胞。
22.如權(quán)利要求15及17~21中任一項(xiàng)所述的試劑，其中，癌細(xì)胞為引起上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化或間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化的癌細(xì)胞。
23.—種癌細(xì)胞的檢測(cè)方法，其特征在于，使權(quán)利要求11所述的重組腺病毒與癌細(xì)胞接觸，檢測(cè)該癌細(xì)胞發(fā)出的熒光或顏色。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中，癌細(xì)胞是源自從受試者中采集的生物試樣的癌細(xì)胞。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其中，生物試樣為血液。
26.如權(quán)利要求25所述的·方法，其中，癌細(xì)胞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK103857795SQ201280040617
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2012年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月23日
【發(fā)明者】水口裕之, 櫻井文教 申請(qǐng)人:獨(dú)立行政法人醫(yī)藥基盤研究所