本發(fā)明涉及疫苗領(lǐng)域，尤其涉及禽傳染性支氣管炎疫苗株、疫苗及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

禽傳染性支氣管炎(InfectiousBronchitis,IB)是由禽傳染性支氣管炎病毒(InfectiousBronchitis Virus,IBV)引起的高傳染性病毒性疾病。其高致病性、接觸性傳染和全球廣泛分布的特征使其成為除新城疫和高致病性禽流感外被廣泛研究的病毒學(xué)呼吸道疾病。禽傳染性支氣管炎病毒對(duì)于不同日齡的雞只都有感染性，其對(duì)于不同組織的嗜性使得感染部位不局限于呼吸道，胃、腸道、腎臟和輸卵管等部位都會(huì)發(fā)生病變(Cavanagh2007)。禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)致病率高達(dá)100％，感染雛雞的死亡率為25％-30％(Bande,2015)。感染雛雞若與其他細(xì)菌性或病毒性病原一起發(fā)生混合或繼發(fā)感染，會(huì)增加雞只死亡率(Matthijs,2003)。從1931年首次發(fā)現(xiàn)至今(Schalk,1931)，禽傳染性支氣管炎的爆發(fā)在世界各國(guó)多有報(bào)道。20世紀(jì)90年代后至今，該病在國(guó)內(nèi)頻繁爆發(fā)，使得感染雞群肉雞質(zhì)量下降，蛋雞產(chǎn)蛋量下降，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)極大的經(jīng)濟(jì)損失。

禽傳染性支氣管炎病毒屬于尼多病毒目(Nidovirales)，冠狀病毒科(Coronaviridae)，冠狀病毒屬(Coronavirus)。該病毒為帶囊膜，不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒。病毒粒子直徑為80-120nm，囊膜表面均布著約20nm長(zhǎng)的纖突。病毒基因組編碼的主要結(jié)構(gòu)蛋白為纖突蛋白(S,spike)、基質(zhì)蛋白(M,matrix)、核衣殼蛋白(N,nucleocapsid)和囊膜蛋白(E,envelope)(Bande,2015)。S蛋白是高度糖基化跨膜蛋白，大小為150-200kDa。該蛋白在宿主細(xì)胞受體識(shí)別、抗體誘導(dǎo)、致病性和基因分型等方面起著關(guān)鍵作用(Bande,2015)。S蛋白基因轉(zhuǎn)譯后被裂解為S1(520aa)和S2(625aa)兩個(gè)亞基。其中，S1蛋白識(shí)別并結(jié)合宿主細(xì)胞受體，S2蛋白通過(guò)構(gòu)象變化，使病毒囊膜和宿主細(xì)胞膜融合，讓病毒基因組進(jìn)入宿主細(xì)胞中(Belouzard,2012)。S蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體以及免疫反應(yīng)，而在S1、S2兩個(gè)糖蛋白亞基中，S1是主要免疫原性蛋白，具有多個(gè)抗原表位(Ignjatovic,1991；Ignjatovic,2005)。S1蛋白同樣對(duì)受體結(jié)合以及細(xì)胞膜融合起著決定性作用(Belouzard,2012)。

傳統(tǒng)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)例如病毒中和實(shí)驗(yàn)(VN)發(fā)現(xiàn)禽傳染性支氣管炎病毒存在多種血清分型(OIE,2008)，其抗原多樣性使得不同禽傳染性支氣管炎病毒毒株間不能產(chǎn)生有效的交叉保護(hù)(Farsang,2002；Ladman,2006)。因此，針對(duì)禽傳染性支氣管炎病毒不同的血清型，市場(chǎng)上存在各種不同的減毒活疫苗和滅活疫苗(Bijlenga,2004)。目前，減毒活疫苗是廣泛用于禽傳染性支氣管炎防控的手段。減毒活疫苗一般選取抗原性良好的禽傳染性支氣管炎病毒毒株，比如MASS型M41或H52、H120等，是第一代應(yīng)用在禽傳染性支氣管炎疫情防控的產(chǎn)品(Lee,2010)。滅活疫苗一般與減毒活疫苗組合使用，也可以單獨(dú)使用。然而，研究發(fā)現(xiàn)，與減毒活疫苗相比，滅活疫苗單獨(dú)使用時(shí)免疫時(shí)效較短(Ladman,2002)。此外，一些新型疫苗也用于禽傳染支氣管炎的防治，包括病毒載體疫苗，亞基和多肽疫苗以及質(zhì)粒DNA疫苗，這些新型疫苗可以產(chǎn)生明顯的體液以及細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，以達(dá)到免疫保護(hù)效果(Bande,2015)。

研究發(fā)現(xiàn)，個(gè)體間遺傳差異會(huì)影響免疫應(yīng)答效力(Cavanagh,2007)。并且，禽傳染性支氣管炎病毒的S1蛋白氨基酸序列上2-3％的改變(10-15aa)就會(huì)導(dǎo)致血清型的改變，因而產(chǎn)生變異株并可能影響相近血清型間的交叉免疫保護(hù)(Cavanagh,1997)。因此，禽傳染性支氣管炎病毒的S1蛋白序列成為禽傳染性支氣管炎防控的研究熱點(diǎn)?；赟1基因的序列分析，主要分布于世界各地的禽傳染性支氣管炎病毒也被分為經(jīng)典株和變異株(Chang-Won Lee,2003)。其中，經(jīng)典株M41和H120被廣泛用作疫苗株(Sjaak de Wit,2011)。然而，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)提出，禽傳染性支氣管炎病毒血清型分布在疫苗的使用上存在地緣性影響。禽傳染性支氣管炎病毒其他變異株的分布一般限于特定區(qū)域，比如，病毒株M41、Arkansas和Connecticut在美國(guó)廣泛分布，而病毒株4/91(793/B,CR88)和D274則主要存在于歐洲(Sjaak de Wit,2011；Bande,2015)。最近中國(guó)QX變異株在歐洲、亞洲、中東和非洲爆發(fā)的事實(shí)則說(shuō)明了IBV在地理分布上的遷移和該QX基因型病毒的重要性，其分布的廣泛性對(duì)禽傳染性支氣管炎的防控帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)(Jia,1995；Moreno,2016；Zhao,2016)。然而，禽傳染性支氣管炎病毒跨地域傳播的可能性有待進(jìn)一步確認(rèn)(Ducatez,2009)。

對(duì)國(guó)內(nèi)禽傳染性支氣管炎病毒的流行病學(xué)調(diào)查研究數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)我國(guó)在禽傳染性支氣管炎的防控有以下 特點(diǎn)：1.在國(guó)內(nèi)目前廣泛流行的禽傳染性支氣管炎病毒毒株主要為QX基因型；2.目前國(guó)內(nèi)對(duì)禽傳染性支氣管炎的防控一般使用Mass型疫苗株，如H120、H52、Ma5、M41。但是Mass型與國(guó)內(nèi)流行的基因型進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，因此交叉保護(hù)較差；3.防控QX型禽傳染性支氣管炎病毒的商品化疫苗相對(duì)較少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，有必要針對(duì)上述的問(wèn)題，提供一種禽傳染性支氣管炎弱毒疫苗株、疫苗及其應(yīng)用。

一種禽傳染性支氣管炎弱毒疫苗株S，保藏編號(hào)為CCTCC NO：V201647。該弱毒疫苗株S屬于禽傳染性支氣管炎病毒IBV-S，拉丁文學(xué)名：Infectious Bronchitis Virus。弱毒疫苗株S的保藏日為2016年9月16日，保藏單位全稱為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位簡(jiǎn)稱為CCTCC，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)。

一種禽傳染性支氣管炎疫苗組合物，包含弱毒疫苗株S和藥學(xué)上可接受的佐劑或載體。

所述弱毒疫苗株S在制備禽傳染性支氣管炎疫苗中的應(yīng)用。

所述弱毒疫苗株S在制備作為免疫原使用的蛋白質(zhì)或多肽中的應(yīng)用。

所述弱毒疫苗株S在制備作為用于檢測(cè)血清中特異性抗體的蛋白質(zhì)抗原中的應(yīng)用。

一種禽傳染性支氣管炎弱毒疫苗株SU，保藏編號(hào)為CCTCC NO：V201648。該弱毒疫苗株SU屬于禽傳染性支氣管炎病毒IBV-SU，拉丁文學(xué)名：Infectious Bronchitis Virus。弱毒疫苗株SU的保藏日為2016年9月16日，保藏單位全稱為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏單位簡(jiǎn)稱為CCTCC，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)。

一種禽傳染性支氣管炎疫苗組合物，包含弱毒疫苗株SU和藥學(xué)上可接受的佐劑或載體。

所述弱毒疫苗株SU在制備禽傳染性支氣管炎疫苗中的應(yīng)用。

所述弱毒疫苗株SU在制備作為免疫原使用的蛋白質(zhì)或多肽中的應(yīng)用。

所述弱毒疫苗株SU在制備作為用于檢測(cè)血清中特異性抗體的蛋白質(zhì)抗原中的應(yīng)用。

發(fā)明人根據(jù)病料來(lái)源地、來(lái)源年份遠(yuǎn)近，選擇可能出現(xiàn)弱毒株的部分病料重新進(jìn)行病毒分離、動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)及S1基因序列比對(duì)，得到一株QX基因型禽傳染性支氣管炎病毒天然弱毒疫苗株，命名為S(簡(jiǎn)稱為S株)。S株可作為弱毒疫苗直接應(yīng)用于預(yù)防家禽免于禽傳染性支氣管炎的感染及傳播。S株對(duì)SPF雞毒力較弱，感染雞不出現(xiàn)發(fā)病及死亡癥狀，不易傳播且排毒率低，安全性高；S株屬于CHI分支，即QX基因型，可針對(duì)國(guó)內(nèi)優(yōu)勢(shì)IBV種群進(jìn)行免疫保護(hù)，有效性良好。

為進(jìn)一步獲得效果更好的弱毒疫苗株，使用極限稀釋法對(duì)S株進(jìn)行快速純化及雞胚適應(yīng)，獲取可預(yù)防QX基因型禽傳染性支氣管炎的弱毒疫苗株，命名為SU(簡(jiǎn)稱為SU株)。本發(fā)明使用極限稀釋傳代法，在較少代次內(nèi)篩選純化出遺傳單一且在雞胚內(nèi)能高滴度繁殖的SU株。對(duì)SU株進(jìn)行了安全性試驗(yàn)、免疫效力試驗(yàn)，證明SU株對(duì)SPF雞安全，免疫保護(hù)效果與市售LDT3、H120效果相近，具有作為安全疫苗候選株的可能。

附圖說(shuō)明

圖1為S株感染雞胚后病變圖。

圖2為N基因RT-PCR鑒定結(jié)果圖。其中，泳道M為DNA Marker DL1000，泳道1為IBV部分N基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道N為以水為模板的陰性對(duì)照，泳道P為以H120基因組為模板的陽(yáng)性對(duì)照。

圖3為M基因RT-PCR鑒定結(jié)果圖。其中，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道1為IBV部分N基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，泳道N為以水為模板的陰性對(duì)照，泳道P為以H120基因組為模板的陽(yáng)性對(duì)照。

圖4為電鏡下S株病毒粒子形態(tài)圖。

圖5為S1基因RT-PCR鑒定結(jié)果圖。其中，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道1為S1基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，泳道N為以水為模板的陰性對(duì)照，泳道P為以H120基因組為模板的陽(yáng)性對(duì)照。

圖6為陽(yáng)性克隆菌液PCR結(jié)果圖。其中，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道1～3為菌液PCR條帶，泳道N為以水為模板的陰性對(duì)照。

圖7為S株S1基因與34株參考株遺傳進(jìn)化分析結(jié)果圖。

圖8為S株全基因組序列的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果圖。

圖9為SU株尿囊液內(nèi)病毒粒子的Western Blot檢測(cè)結(jié)果圖。其中，泳道M為Marker，泳道N為接 種PBS的雞胚尿囊液，泳道P為含有H120的尿囊液，泳道1為傳代過(guò)程中出現(xiàn)的陽(yáng)性樣品。

圖10為電鏡下SU株病毒粒子形態(tài)圖。

圖11為SU株與S株比對(duì)缺失示意圖。

圖12為3日齡SPF雛雞免疫后第5天腎臟病理切片，200倍放大。其中，圖12a為L(zhǎng)DT3免疫組，圖12b為SU免疫組，圖12c為H120免疫組，圖12d為未免疫組。

圖13為親本毒株SF攻毒5天后排毒率。

圖14為異源毒株M41攻毒5天后排毒率。

具體實(shí)施方式

為了更好的說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式做進(jìn)一步說(shuō)明。本發(fā)明中所用試劑或儀器均可由市場(chǎng)購(gòu)得，使用的檢測(cè)方法等都是本領(lǐng)域所熟知的，在此不再贅述。

實(shí)施例1、S株的分離鑒定

(1)S株的分離培養(yǎng)

選擇來(lái)自2009年湖北、2009年湖南、2009及2010年四川、2009年廣東、2010年廣西病雞氣管、支氣管、肺、腎臟組織作為病料樣品。處理后的病料勻漿上清經(jīng)尿囊腔接種9-11日齡SPF雞胚后連續(xù)盲傳3代，得到含有IBV的尿囊液再接種9-11日齡SPF雞胚，37℃孵育約48h，提取尿囊液，得到分離毒株。

(2)IBV的鑒定

a)分離毒株經(jīng)尿囊腔途徑接種9-11日齡SPF雞胚，37℃培養(yǎng)6～7天后，未死亡雞胚出現(xiàn)侏儒胚癥狀，結(jié)果如圖1所示。

b)分離毒株經(jīng)尿囊腔接種9-11日齡SPF雞胚作為試驗(yàn)組，以水經(jīng)尿囊腔接種9-11日齡SPF雞胚作為對(duì)照組。37℃孵化10-12h后，同時(shí)經(jīng)尿囊腔途徑接種100×EID₅₀新城疫病毒(NDV)0.1ml/胚，繼續(xù)孵化48h收毒并測(cè)定尿囊液的血凝效價(jià)(HA)。試驗(yàn)組雞胚(IBV+NDV)的血凝價(jià)為1-5log2，對(duì)照組雞胚(NDV)的血凝價(jià)為8-9log2，存在干擾作用，初步確定病料中含有禽傳染性支氣管炎病毒。

c)抽取盲傳3代后雞胚尿囊液中病毒RNA，使用針對(duì)禽傳染性支氣管炎病毒基因組M基因和N基因的保守區(qū)段設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR鑒定病毒。同時(shí)設(shè)立以水為模板的陰性對(duì)照組和以H120基因組為模板的陽(yáng)性對(duì)照組。針對(duì)N基因保守區(qū)段設(shè)計(jì)的上游引物NpF的具體序列為CGGAGCAATAGCAAGAAAAGC，下游引物NpR的具體序列為GCAGCAACCCACACTATACCATC。針對(duì)M基因保守區(qū)段設(shè)計(jì)的上游引物MpF的具體序列為CCTAAGAACGGTTGGAAT，下游引物MpR的具體序列為T(mén)ACTCTCTACACACACAC。

RT-PCR結(jié)果如圖2和圖3所示。由圖2和圖3可知，試驗(yàn)組(IBV)的N基因和M基因的條帶大小分別約500bp和740bp，和目標(biāo)片段大小一致，進(jìn)一步證明分離毒株為禽傳染性支氣管炎病毒。

(3)病毒粒子形態(tài)

將步驟(1)提取的尿囊液濃縮，使用電鏡觀察病毒粒子形態(tài)(圖4)，發(fā)現(xiàn)S株病毒形態(tài)多為橢圓形或球形，直徑約100nm，有時(shí)呈多形性。病毒表面纖突均勻排列呈放射性。

(4)基于禽傳染性支氣管炎病毒S1基因序列的進(jìn)化分析

針對(duì)S1基因兩端外保守序列設(shè)計(jì)引物，上游引物S1F的具體序列為T(mén)TGAAAACTGAACAAAAGACCG，下游引物S1R的具體序列為T(mén)ACAAAACCTGCCATAACTAACAT。

按Takara公司PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)說(shuō)明合成cDNA。PCR擴(kuò)增參照KOD Plus Neo DNA聚合酶的說(shuō)明書(shū)配成反應(yīng)體系，94℃預(yù)變性1min；94℃30s，55℃30s，68℃54s，30個(gè)循環(huán)；68℃延伸5min；4℃終止。PCR擴(kuò)增S1基因產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)得到約1.7kb的目的條帶，條帶大小與以H120基因組為模板的陽(yáng)性對(duì)照一致(圖5)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)HiPure PCR Pure Micro Kit(Magen)回收純化后，按Takara公司的pMD19simple T Vector的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TA克隆，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(圖6)進(jìn)行測(cè)序。S1基因的核苷酸序列(不含UTR)如SEQ ID NO：1所示。將S1的全基因序列提交NCBI BLAST SERVER進(jìn)行序列的同源性檢索鑒定。BLAST結(jié)果顯示，S株的S1基因與中國(guó)分離毒株的相似度達(dá)99％，與在四川分離的CK/CH/SC/MS11-4、以及在浙江分離的許多不同分離株極為相近，其次評(píng)分稍低的是來(lái)自安徽、江蘇、廣西、廣東的分離株。

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中選取34株中國(guó)及世界各地分離毒株及常用疫苗毒株的S1基因作為參考序列(表1)，與S株的S1基因進(jìn)行序列比對(duì)。使用Clustalx、MEGA6.0分析軟件系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰位相接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)并用Bootstrap值來(lái)評(píng)估進(jìn)化樹(shù)的可靠性(圖7)。結(jié)果顯示，35株IBV S1基因序列分別聚類(lèi)形成8簇，S株與國(guó)內(nèi)典型QX型IBV聚類(lèi)為CHI分支，與LDT3聚類(lèi)于不同分支；國(guó)內(nèi)常用疫苗株H120、H52、W93聚類(lèi)為Mass基因型，與國(guó)內(nèi)分離株聚類(lèi)于不同大分支上，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表1、Genbank 34株IBV參考序列

(5)S株全基因組克隆

參照GenBank中已公布的IBV全基因組序列，選用多個(gè)血清型中經(jīng)典代表毒株進(jìn)行序列比對(duì)分析， 利用IBV基因組中保守度高的區(qū)段，設(shè)計(jì)得到10對(duì)用于擴(kuò)增禽傳染性支氣管炎病毒基因的引物(表2)。

表2、基因組PCR擴(kuò)增引物

病毒RNA提取、cDNA第一鏈合成以及PCR擴(kuò)增方法如前所述。PCR擴(kuò)增參數(shù)為：94℃1min；94℃30s，55-65℃30s，68℃延伸45s-1min，30個(gè)循環(huán)；68℃延伸5min；4℃終止。根據(jù)片段長(zhǎng)度延伸時(shí)間不同，一般為1kb/30s。PCR產(chǎn)物回收純化與連接、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞、陽(yáng)性菌落的鑒定和測(cè)序方法如前所述。應(yīng)用DNASTAR.Lasergene.v7.1分析軟件對(duì)測(cè)序得到的S株的全長(zhǎng)進(jìn)行拼接整理，并將毒株的全基因序列提交NCBI BLAST SERVER進(jìn)行序列同源性檢索鑒定。

S株全基因序列比較分析的參考毒株均來(lái)自GenBank(表3)，應(yīng)用Clustalx軟件分別對(duì)1a、1b、S1、S2、3a、3b、E、M、5a、5b和N 11個(gè)基因進(jìn)行多序列比對(duì)，應(yīng)用MEGA6.0分析軟件進(jìn)行各個(gè)基因的系統(tǒng)發(fā)育分析，鄰位相接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)后用Bootstrap值來(lái)評(píng)估進(jìn)化樹(shù)的可靠性(表圖7)。S株的1a和1b基因序列如SEQ ID NO：3-4所示，S株的S2、3a、3b、E、M、5a、5b和N基因序列分別如5-12所示。結(jié)果顯示S株與國(guó)內(nèi)分離株的親緣關(guān)系非常近。而這些分離毒株的來(lái)源地多分布于四川、山東、黑龍江。S株的原始病料來(lái)源于四川，因此S株的進(jìn)化與四川區(qū)域流行的IBV毒株存在緊密關(guān)系。

表3、全基因組分析Genebank代表毒株

實(shí)施例2、S株雞胚半數(shù)感染量(EID₅₀)、致病力和安全性試驗(yàn)

(1)S株雞胚半數(shù)感染量(EID₅₀)

將實(shí)施例1步驟(1)中的提取的尿囊液(病毒液)進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)x擇合適的稀釋梯度，通過(guò)尿囊腔接種方式無(wú)菌接種6枚SPF雞胚，37℃孵育。每12h觀察一次雞胚，棄去24h內(nèi)死亡的雞胚，連續(xù)觀察144-168h，死亡雞胚馬上放入4℃冷藏，觀察結(jié)束后把所有雞胚取出，死胚、侏儒胚、蜷曲胚都記為感染，記錄各稀釋度的感染胚數(shù)量，使用Reed-Muench方法計(jì)算病毒的EID50為10-5.5/ml。

(2)S株致病力

取5日齡SPF雞組用S株通過(guò)點(diǎn)眼滴鼻攻毒作為試驗(yàn)組，10^5.0EID₅₀/羽，進(jìn)行動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)。使用疫苗株H120、LDT3點(diǎn)眼滴鼻攻毒作為陽(yáng)性對(duì)照，10^3.5EID₅₀/羽。每日觀察，計(jì)算感染、死亡率。在人工感染5天后采集咽拭子、肛拭子進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)排毒情況。7天后將所有活雞剖殺，檢查氣管、肺、腎臟病變情況(表4)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，試驗(yàn)組雞只未出現(xiàn)任何臨床癥狀或一過(guò)性反應(yīng)。雞只采食，精神正常，說(shuō)明S株對(duì)5日齡SPF雞無(wú)明顯致病力。與對(duì)照毒株相比，S株排毒率為50％，發(fā)病率死亡率為0，說(shuō)明S株可能為禽傳染性支氣管炎病毒天然弱毒株。

表4、不同IBV致病力測(cè)定結(jié)果

(3)S株安全性

取5日齡SPF雞用S株尿囊液點(diǎn)眼滴鼻攻毒，劑量為10^5.0EID₅₀。攻毒后每天觀察雞只發(fā)病情況。5天后，剖殺觀察雞只內(nèi)臟病變情況，取腎臟、氣管、肺研磨液4℃8000rpm離心3min，取上清液進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。如RT-PCR檢查為陰性，將上清液接種至9-11日齡SPF雞胚，37℃孵育48h后無(wú)菌收集尿囊液再進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。使用含有IBV的內(nèi)臟勻漿上清液或在雞胚擴(kuò)繁后的尿囊液繼續(xù)進(jìn)行復(fù)壯，對(duì)3-7日齡SPF雞通過(guò)點(diǎn)眼滴鼻進(jìn)行攻毒，重復(fù)以上操作10次。

取3周齡SPF雞20只分3組。一組為陰性組，對(duì)雞只進(jìn)行PBS點(diǎn)眼滴鼻。另一組使用在雞只上傳代5次和10次的S株進(jìn)行攻毒，攻毒劑量為10^5.0EID₅₀。攻毒后觀察雞只狀態(tài)，攻毒后第3天，傳代5次攻毒組(簡(jiǎn)記為S-5)10只雞中只有1只出現(xiàn)聲音沙啞的癥狀，第4天再出現(xiàn)一只有精神萎靡的癥狀，第5天出現(xiàn)1只死雞，但所有雞只剖檢后無(wú)肉眼可見(jiàn)病變。傳代10次攻毒組(簡(jiǎn)記為S-10)出現(xiàn)6只感染雞只，排白色水樣便且聲音沙啞，第5天出現(xiàn)2只死雞，死雞剖檢后發(fā)現(xiàn)腎臟有輕微腫大，活雞則無(wú)明顯變化。攻毒后第5天對(duì)所有雞只進(jìn)行拭子采集、內(nèi)臟采集，檢測(cè)感染率，記錄攻毒后的感染、死亡情況(表5)，說(shuō)明S株的毒力返強(qiáng)，但仍在安全范圍內(nèi)，適合作為弱毒疫苗使用。

表5、S株不同代次毒力測(cè)試

實(shí)施例3、SU株的分離鑒定

(1)極限稀釋傳代法

將S株尿囊液進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)x取與其EID₅₀數(shù)量級(jí)相同的稀釋梯度及比此稀釋度高10倍、100倍的2個(gè)稀釋度的稀釋液接種9-11日齡SPF雞胚，37℃孵化48h后無(wú)菌收集尿囊液。4℃8000rpm速度離心15min后取上清進(jìn)行Western Blot檢測(cè)禽傳染性支氣管炎病毒(圖9)。目的條帶和以H120為陽(yáng)性對(duì)照的條帶大小一致，證明樣品含有禽傳染性支氣管炎病毒。以含有唯一一個(gè)或兩個(gè)出現(xiàn)陽(yáng)性條帶的最高稀釋度內(nèi)的陽(yáng)性尿囊液的稀釋度作為下次的第一個(gè)稀釋度繼續(xù)往下稀釋10倍、100倍，重復(fù)上述雞胚接種及尿囊液收集、Western Blot檢測(cè)操作3-5代。

(2)SU疫苗候選株篩選

對(duì)原始毒株及極限稀釋傳代、普通傳代法傳代后得到的第3、第5代病毒進(jìn)行S1測(cè)序比對(duì)。極限稀釋傳代法在短短傳代第3次及第5次后，得到的毒株S1基因測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，所挑取的10個(gè)克隆中與原代S株的S1基因序列比對(duì)均出現(xiàn)了2個(gè)能引起氨基酸改變的點(diǎn)突變(表6)。使用普通傳代方法傳代5次后的毒株，所挑取的10個(gè)克隆中與原代S株的S1基因序列比對(duì)，8個(gè)S1基因與親本毒株S相同，其余2個(gè)于81位存在T→C的點(diǎn)突變，但該突變并未帶來(lái)氨基酸的突變。選擇極限稀釋傳代法第5代毒株命名為SU，擬作為疫苗候選株。

表6、SU株和S株的S1基因序列比較

(3)病毒粒子形態(tài)

將IBV尿囊液濃縮，使用電鏡觀察病毒粒子形態(tài)(圖10)，發(fā)現(xiàn)SU株病毒形態(tài)多為橢圓形或球形，直徑約100nm，有時(shí)呈多形性。病毒表面纖突均勻排列呈放射性。

(4)SU株的全基因組測(cè)序分析

SU株病毒基因組的提取、基因組cDNA的合成、S1基因的引物設(shè)計(jì)、S1基因的PCR擴(kuò)增、S1基因的克隆與序列測(cè)定方法如上所述。

對(duì)SU株進(jìn)行全基因組測(cè)序分析，再將其序列與親本毒株S株進(jìn)行比對(duì)(表7，圖11)。和親本毒株S株進(jìn)行序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，1a、1b基因內(nèi)出現(xiàn)的點(diǎn)突變較多，其余較重要的結(jié)構(gòu)蛋白如S1、S2突變卻較少，M基因核苷酸突變并未引入氨基酸替換，E、N基因未出現(xiàn)任何點(diǎn)突變。表7中雙下劃線標(biāo)記指替換的氨基酸仍保持為極性氨基酸，波浪線標(biāo)記指替換后氨基酸由非極性氨基酸替換為極性氨基酸，點(diǎn)畫(huà)線標(biāo)記指替換后極性氨基酸變?yōu)榉菢O性氨基酸。SU由于核苷酸改變引起的氨基酸替換的次數(shù)是13次，而其中氨基酸極性改變的替換共7次，非極性替換為極性占2/7，極性替換為非極性占5/7，替換為非極性氨基酸的概率更高。SU株的S1基因序列如SEQ ID NO：2所示。SU株S1基因的兩個(gè)點(diǎn)突變都引起了極性氨基酸替換為非極性氨基酸的改變，這個(gè)改變可能引起了S1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。除此之外，對(duì)S株、SU株全基因組進(jìn)行完整比對(duì)，發(fā)現(xiàn)SU株在N基因終止密碼子后的3’UTR出現(xiàn)了110bp的缺失(圖11)。

表7、SU株和S株全基因組序列比較

實(shí)施例4、SU株的雞胚半數(shù)感染量(EID₅₀)、最佳免疫劑量、安全性實(shí)驗(yàn)和有效性實(shí)驗(yàn)

(1)SU株雞胚半數(shù)感染量(EID₅₀)的測(cè)定

采用實(shí)施例2所述的EID₅₀測(cè)定方法，對(duì)SU株進(jìn)行EID₅₀的測(cè)定，其EID₅₀為10^-7.37。

(2)SU株最佳免疫劑量的測(cè)定

取3日齡SPF雞通過(guò)點(diǎn)眼滴鼻途徑進(jìn)行免疫，免疫21天后對(duì)雞只進(jìn)行采血，血清用于ELISA檢測(cè)抗體水平，以血清內(nèi)的抗體水平高低評(píng)估SU株對(duì)雞只免疫系統(tǒng)的刺激，確定最佳免疫劑量為10^5.5EID₅₀。

(3)SU株安全性實(shí)驗(yàn)

取3日齡SPF雞，第1-3組為SU免疫組，免疫劑量分別為10^3.5EID₅₀、10^4.5EID₅₀、10^5.5EID₅₀/羽，免疫途徑為點(diǎn)眼滴鼻。設(shè)商業(yè)疫苗株LDT3、H120陽(yáng)性對(duì)照組，免疫劑量為推薦使用一羽份劑量(10^3.5EID₅₀)。另設(shè)不進(jìn)行免疫的陰性對(duì)照組。免疫3周內(nèi)連續(xù)觀察雞只的精神、采食、飲水、排泄?fàn)顩r。所有SU免疫組與H120、LDT3免疫組均未出現(xiàn)任何IB臨床癥狀，精神、采食、排泄物狀態(tài)均與陰性對(duì)照組的無(wú)差別。免疫5天后取拭子進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)排毒率(表8)，結(jié)果表明SU株排毒率低，證明SU株對(duì)SPF雞的毒力可能比LDT3、H120要弱，直至使用10^5.5EID50的免疫劑量，雞只才有接近100％的排毒率。

表8、3日齡SPF攻毒后排毒率

免疫5天后每組剖殺3只雞并取氣管、肺、腎進(jìn)行病理切片制作(圖12)，觀察疫苗是否會(huì)對(duì)雞只產(chǎn)生病理?yè)p傷。切片觀察發(fā)現(xiàn)，SU組和H120疫苗免疫組別的氣管、肺、腎與不作免疫操作的陰性對(duì)照組相比，均未出現(xiàn)明顯的病理變化，但LDT3免疫組別的腎臟切片形態(tài)與未免疫組出現(xiàn)差別，腎小管結(jié)構(gòu)松散、腎小管管型明顯，腎臟可能出現(xiàn)了一定的損害。因此，SU株對(duì)雞只的器官并無(wú)明顯的損害，與常用的H120疫苗具有相近的安全性。

取1日齡SPF雞，SU組免疫組免疫劑量分別為10^4.5EID₅₀、10^5.5EID₅₀、10^6.5EID₅₀/羽，每日觀察雞只情況(表9)。第3天觀察到除對(duì)照組外，每組雞都有排出水樣糞便，但雞的精神狀態(tài)都較好，沒(méi)有病癥。第5天采拭子，雞的叫聲清亮，沒(méi)有羅音、呼嚕聲、張口呼吸、甩頭、或打噴嚏等，直至到第21天都沒(méi)有出現(xiàn)死雞。

(4)SU株有效性實(shí)驗(yàn)

取3日齡SPF雞，用SU株通過(guò)點(diǎn)眼滴鼻途徑進(jìn)行劑量為10^5.5EID₅₀/羽的免疫。免疫21日后，所有組別使用相應(yīng)攻毒毒株(親本毒株SF或異源毒株M41)以10^5.0EID₅₀/羽的攻毒劑量點(diǎn)眼滴鼻攻毒，每日觀察雞只狀態(tài)，并于攻毒后第5天取咽拭子、肛拭子進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)排毒率。同時(shí)設(shè)置LDT3、H120陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組。其中，親本毒株SF是S株經(jīng)常規(guī)傳代方法傳至第14帶獲得的毒力返強(qiáng)毒株。

對(duì)親本毒株SF的攻毒保護(hù)(圖13)。觀察期，陰性對(duì)照組出現(xiàn)張口呼吸和精神萎靡的疑似IB臨床癥狀，其他雞只并未出現(xiàn)明顯癥狀。攻毒5日后拭子排毒率顯示，24日齡SPF雞在SF株10^5.0EID₅₀/羽攻毒5天后，陰性對(duì)照組咽拭子和肛拭子排毒率達(dá)100％；SU免疫組咽拭子排毒率為81.25％，肛拭子排毒率為35％，對(duì)SF株有較好的免疫保護(hù)效果。

對(duì)異源毒株M41的交叉保護(hù)(圖14)。觀察期，陰性對(duì)照組出現(xiàn)甩頭和精神萎靡的疑似IB臨床癥狀，其余雞只未表現(xiàn)明顯癥狀。攻毒5日后SU免疫組別在咽拭子排毒率為40％，對(duì)異源毒株M41的保護(hù)效果較LDT3組好，但仍較H120組差。

另取1日齡SPF雞，用SU株通過(guò)點(diǎn)眼滴鼻途徑進(jìn)行劑量為10^4.5EID₅₀/羽，10^5.5EID₅₀/羽和10^6.5EID₅₀/羽的免疫。第3天觀察到除對(duì)照組外，每組雞都有排出水樣糞便，但雞的精神狀態(tài)都較好，沒(méi)有病癥。第5天采拭子，雞的叫聲清亮，沒(méi)有羅音、呼嚕聲、張口呼吸、甩頭、或打噴嚏等，直至到第21天都沒(méi)有出現(xiàn)死雞。免疫21日后，所有組別使用相應(yīng)攻毒毒株SF以10^5.0EID₅₀/羽的攻毒劑量點(diǎn)眼滴鼻攻毒，每日觀察雞只狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)死亡率(表9)。同時(shí)設(shè)置H120陽(yáng)性對(duì)照組及陰性對(duì)照組。

表9、1日齡SPF雞攻毒后觀察結(jié)果

本發(fā)明分離鑒定了一株禽傳染性支氣管炎弱毒毒株S和SU對(duì)S株的S1基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，證實(shí)S株屬于QX型禽傳染性支氣管炎病毒，可針對(duì)國(guó)內(nèi)優(yōu)勢(shì)IBV種群進(jìn)行免疫保護(hù)。對(duì)S株除兩端UTR之外的基因組全長(zhǎng)與GenBank上25株禽傳染性支氣管炎病毒參考毒進(jìn)行比對(duì)分析，S株的進(jìn)化受?chē)?guó)內(nèi)分離株影響較大，與Mass型疫苗株及國(guó)外分離株親緣關(guān)系遠(yuǎn)，且S很可能為重組毒株。S株可作為天然弱毒疫苗直接應(yīng)用于預(yù)防家禽免于禽傳染性支氣管炎的感染及傳播，對(duì)SPF雞毒力較弱，感染雞不出現(xiàn)發(fā)病及死亡癥狀，不易傳播且排毒率低。

使用極限稀釋傳代法，在較少代次內(nèi)篩選純化出遺傳單一且在雞胚內(nèi)能高滴度繁殖的禽傳染性支氣管炎病毒毒株SU株。對(duì)SU株進(jìn)行了安全性試驗(yàn)、免疫效力試驗(yàn)，證明SU株對(duì)SPF雞安全，免疫保護(hù)效果與市售LDT3、H120效果相近，具有作為安全疫苗候選株的可能。

因此，可以通過(guò)常規(guī)方法將S株和SU株結(jié)合藥學(xué)上可接受的佐劑或載體制成相應(yīng)疫苗，該疫苗能夠誘導(dǎo)靶動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)QX型雞傳染性支氣管炎的特異性免疫應(yīng)答，預(yù)防該型雞傳染性支氣管炎的發(fā)生。所述疫苗可以采用以下方法制備，如將S株或SU株作為生產(chǎn)用毒種，接種9-11日齡SPF雞胚，每胚尿囊腔接種0.2mL，置于37℃，繼續(xù)孵育；接種后48小時(shí)照胚，棄去死胚；將活胚置于2-8℃冷卻后，收獲含毒雞胚尿囊液，混合后與加入常用的凍干保護(hù)劑混勻，分裝后進(jìn)行冷凍真空干燥，即制成雞傳染性支氣管炎活疫苗。此外，也可以將S株和SU株作為免疫原使用的蛋白質(zhì)或多肽、作為檢測(cè)血清中特異性抗體的蛋白質(zhì)抗原。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專(zhuān)利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專(zhuān)利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

<110> 中山大學(xué)

<120> 禽傳染性支氣管炎弱毒疫苗株、疫苗及其應(yīng)用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

<213> 禽傳染性支氣管炎病毒(InfectiousBronchitis Virus)

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ggttcttgtc ctataacagg catgattgca cgtgatcata ttcgtatttc tgcaatgaaa 420

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aacaaaactg ctgatgttac gtcagcaggt gtgtattata aagcaggtgg acccgtaaat 600

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tatcgtgaaa gtagtgtcaa tactactttg acgttaacta atttcacttt tactaatgta 840

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gctcagagtg gttattataa ttttaatttg tcatttctga gtcagtttgt gtataaggca 960

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atggcttcaa gcctaaaaca gggagcatct tcccaaaacc agaggagtgt cgttcttgtt 60

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gatggaaaga actatatgtt cttccgtttc aagaaggatg agaacattta ttatacacca 1980

atgtcacaac ttggtgctat taatgttatt tgcaaagcgg gtggcaagac tgtcacgttt 2040

ggtgaaacaa ctgtaaagga aataccacca cctgatgttg tgcctattag ggtaagcatt 2100

gagtgttgtg gtgaaccatg gaatacaatc ttcaagaagg cttataaaga gcccattgaa 2160

gttgagacag acctcacagt agaacaactg ctcactgtga tctatgataa aatgtgtgaa 2220

gatctcaaac tgtttccaga ggcaccagaa cctccaccat ttgagaatgt tgcacttgtt 2280

gataaaaacg gtaaagatct ggattgcata aaatcatgcc atctcatcta ccgtgattat 2340

gagagcgatg atgacatcga ggaagaagat gctgaggagt gtgatacaga tccagctgat 2400

gctgaggaat gtgatactgc ttcagagtgt gaagaagaag atgaagatac aaaggtgctg 2460

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gtctataatg gatgtattgt tcataaggac gctcttgatg ttgttaactt accatctggt 2580

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gttgttgatg tccttggaga ttggggagag gccgttgatg cacaagaaca attgtgtgaa 2700

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gtagttgttt ttacgcctgc tgatttagaa gttgctaaag aaacatcaga ggatgtcgac 2880

gagtttgttc ttgttgctga tgttcttaca gaaaaagttg tgcttcaaga aaaagaagag 2940

ccacaagtag aacaggagcc tattcaagtt gtcaaaccac aacgtgagaa aaaggctaaa 3000

aagtttaaag tcaggcaaac cacatgtgaa aaacccaaat tcttggagta cacaacatgt 3060

gtaggtgatt tgactgttgt aattgccaaa gcattggatg aatttaaaga gttctgcgtt 3120

gttaacgccg caaatgagca tatgtctcat ggtggtggcg ttgcgaaggc aattgctgac 3180

ttttgtggac ctgattttgt ggaatattgt gaggactatg ttaagaaaca tgggccacaa 3240

caaagacttg tcacaccttc gtatgtcaaa ggcattcaat gtgtgaataa tgttgtagga 3300

ccccgccatg gcgacaaaga tttggaagaa aaacttgtcg ctgcctacaa gagtgttctt 3360

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tttaaaactt caatagacgc gatgcgtaag gcttttgaag ggcttaacat acgcgtgctt 3480

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aaagttggtg atttttcaga ctgcaattgg cttttggcta acttggcaga acactttgat 4020

gcagattaca caaatgcact gcttaagaag cgtgtgtcgt gtaactgtgg tgttaagagt 4080

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tttaagacgc aatattcaaa ttgtccaact tgtggtgcaa atagtatgga tgaagttgtt 4200

gaagcatcac tcccgtactt gttgcttgtt gctactgatg gtcctgctgc agttgattgt 4260

gatgaaaatg ctgcaggaaa tgttgttttt attgggtcca ccaacagtgg acactgttat 4320

acacaagctg ttggaaaagc ttttgataat ttggctcaag ataggaaatt tggaaagaga 4380

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gttgacttta agtcaaagga tggctttact tataagttga cacctgacac tgacgaaaat 4740

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gacggtactg ctaattttgt tgttggacac cccaactata atagtagagc tctacgtatc 4860

cccacattct gggaatgcgc agagaccttt gtaaaaatag gcgaaaaagt tgatggtgta 4920

actatgggcc tttggcgtgc agaacacctt aatagaccta atttggaaag gattttcaac 4980

gtcgttaaga agacgatggt tggaactagt gttgttacta cacaatgtgg taaattaatt 5040

agtaaagcag ctacattcgt tgccgataaa gtaggagatg gtgtagttcg taatgttact 5100

gatagaatta aagggtgttt tgggtttact agggattact ttgaaagaag agtgtctaca 5160

cagttcctta aaaccctctt tttcttcttt ttctgtctct tgaaggctag tgttaagagt 5220

ttaatttcta gctacaagag tgtgttatgt aaagtggtat ttactgcttt atttatacta 5280

tggtttgtct acacaagcaa cccagttata tttactggaa tacgtgtgtc agacttttta 5340

tttgaaggtt cattctgtag tccttatgta gactacggta aagagtcttt tgatatttta 5400

cgctattgtg gaagtgattt cacttgtcgt gtctgtttac atggtaagga ttcgctccat 5460

ttgtataaac atgcctatag cgtagaacag ttttataaag atgcagttaa tggcattagt 5520

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tttgtcatta tttgctactg tataagatat ttggttttga gcacaactgt tttacaaact 5640

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tttatgtctc ctgaagttgc tggcgagctt tctgaaaagc ttaagcgcca tgttaaacct 6000

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attgctaact tgaaagtgaa aaattcaccg ccagtagtgt ggaagtactc tgatcttgtt 6660

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gtggaaaaga aggctggtgg tgttgttagt agcactgtta gttggtttaa gagttgttgt 6840

aaatggctct tagtgtttta tttacttttt acagtgtgtt gtttgggtta ttatcaatgg 6900

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tgggttttgt ttaatgatga atacacaatt aaaccaggcg tgttttgtgg ttctactgtt 7620

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cactgttggc tcgtttttac ttttggttta atagtaccta tgtggatagc ttgttgttat 7980

cttgcgtttg tactttacat gtatacacca ctatttttct ggtgttatgg tactactaaa 8040

aattctcgta agctttatga tggcaacgag tttgttggta attatgatct tgccgcgaag 8100

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tcttatagag gcaataatct taatggattg tggttgggtg attccatcta ctgtccacga 8460

catgtattag gtaagtttag tggtgaccaa tggagtgatg tacttagcct tgctaataat 8520

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aagggtgcag tactgatttt acagactgca gtagccaatg ctgatacacc gaagtataaa 8640

tttttgaaag caaattgtgg tgatagtttc acaatagctt gctcttatgg tggtacagtt 8700

ataggactct accccgttac tatgcgttct aatggaacta ttagagcatc gtttcttgct 8760

ggagcatgtg gttcagtagg ttttaatata gaaaagggtg tagtaaattt ttactacatg 8820

caccatctag agttacctaa tgcattacac acaggaactg acctaatggg tgagttttat 8880

ggtggttata tagatgaaga ggttgctcag aaagttcaac ccgataaatt agttactaat 8940

aatattttgg catggcttta tgcagcaatt attagtgtta aagagagtag tttttcaaca 9000

ccaaaatggc ttgaaagtac tactatcagt attgatgatt ataataagtg ggcaggtgat 9060

aatggtttta catcatttgt aagctgcact gctattacta agttaagtgc tataacagga 9120

gtagatgttt gtaaactcct tcgtactatt atggtaaaaa gtgcacaatg gggtagtgac 9180

cctattttgg gacaatataa ttttgaggat gaaatgacac cggaatctgt ttttaatcag 9240

gtgggtggtg ttaggttaca atcttctgtt gtaaagagag ccgcatcttg gttttggagt 9300

agatgtgtgc tagcttgttt cttgtttgtc ttgtgttcta tagttctgtt tacagctata 9360

ccatatagat attatttata tggtgctgtt gttttatttg caactgtgct ctttgtgtcg 9420

tttactgtga aacatgttat ggcatatatg gacactttcc ttttgccgac attgattacg 9480

gttattatag gagtttgtgc tgaagtacct ttcatctaca atactctaat tagtcaaatt 9540

gttattttct ttagccaatg gtatgatcca gtagtctttg acactgtagt accgtggatg 9600

tttctaccat tagtcttgta cacagctttt aaatgtatac aaggttgtta tagtgtaaat 9660

tcctttaata cttctctgtt agtgttgtat cagtttatga agttgggttt tgttatatat 9720

acctcttcta atacccttac agcctactca gaaggtaatt gggagttatt ttttgagtta 9780

gtgcacacaa ctgtgttggc taatgttagt agtaattcct taattggttt aattgtgttt 9840

aaatttgcta agtggatgct gtattattgt aatgcctcat accttaataa ttatgtccta 9900

atggctgtta ttgttaatgg cataggttgg atgtttactt gttactttgg attctattgg 9960

tggattaata aggtttttgg tttaacctta ggtaaatata gtttcaaagt ttcagtagat 10020

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gtttggaata ttgataatgt cattgatgca gatggcactg aattgcaacc aatttctaca 10920

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tctaaatgtt attatactaa tattagtggt aattcagtag tggctgctat tacctcttca 11160

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tcactttgtt cttttgcagt agatccggct gacacgtata ttaaatatgt ggctgcaggt 11460

aaccaacctt taggtaactg cgtaaaaatg ttgacagttc ataatggtag tggctttgct 11520

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caatttaaag gttcttttgt acaaatacct actacggaga aagaccctgt gggattctgt 11700

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aattatttaa acgggtacgg ggtagcagtg aggctcggct ga 11862

<210> 4

<211> 7959

<212> DNA

<213> 禽傳染性支氣管炎病毒(InfectiousBronchitis Virus)

<400> 4

atgtttaaaa atttgaagcg taactgtgct cgattccaag aagtgtgtgg tactgaagat 60

ggaaatcttg agtatcgtga ctcttatttt gtggttaaac aaaccactcc tagtaattat 120

gaacatgaga aagtctgtta tgaggactta aagtcagaag taacggctga tcatgatttc 180

tttgtgttca ataagaacat ttataatatt agtaggcaac gacttactaa gtatactatg 240

atggactttt gttatgcttt gaggcatttt gacccaaagg attgcgaagt tcttaaggaa 300

atacttgtca cttatggttg tatagaagat taccatccta agtggttcga agaaaataag 360

gattggtacg atccaataga aaacccaaaa tattatgcca tgttggctaa aatgggacct 420

attgttcgtc gtgcattgtt gaatgctgtt gagtttggga acctaatggt tgagaagggt 480

tatgtaggtg tagttacact agacaaccag gacctcaatg gcaaatttta tgattttggt 540

gattttcaga aaacagcacc tggtgctggt gttcctgttt ttgatacata ttattcctac 600

atgatgccca tcatagccat gacggatgcg ttagcacctg aaaggtattt tgaatatgat 660

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gaactgtttc aaaaatactt taagtactgg gatcaagaat accaccctaa ttgtcgagat 780

tgtttcgacg acaggtgttt gatacattgt gcaaacttca acgtactttt ctctacacta 840

ataccacaaa cttcttttgg taacttatgt agaaaagtgt tcgttgatgg tgtaccattt 900

atagctactt gtggctatca ctctaaagaa ctcggtgtta ttatgaatca agataacacc 960

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ttagtaggaa cttctaacaa tttagttgat cttagaactt cttgctttag tgtctgtgct 1080

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gattttgctg aaaaagcagg tatgtttaag gaaggatcat caattccact taaacatttc 1200

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ctaagaaacc tagttcaagg tgtggaagac ccaatgctta tgggttggga ctatcctaag 1740

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gtattgtctg aaactgtatt agctacaggt ggtatatatg tgaaacctgg tggtactagc 1920

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gctaatgttg cgcgtttact tagtgttata acgcgtgata tagtatatga tgacattaaa 2040

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gttgaaaagt tttattctta catgtgtaag aatttttcat taatgatctt gtctgatgat 2160

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tttagagaaa ttctctacta ccaaaacaat gtttatatgg ccgattctaa gtgttgggtt 2280

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gactattcct ttgttatgga tatagataag ggtagcaaat tttgggagca ggagttctat 2640

gaaaatatgt atagggctcc tacaacttta caatcttgtg gtgtttgtgt agtttgtaat 2700

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tgctctcaac ctggttgtgg tgaagctgat gttactaaac tttacctcgg aggtatgtct 2880

tatttctgtg gtaatcataa acctaaatta tcaataccgt tagtatctaa tggtactgtt 2940

tttggaattt acagagccaa ttgtgtgggt agcgaaaacg ttgatgattt taatcaacta 3000

gctactacta attggtctac tgttgaacct tatatattag caaatcgctg tagcgactcg 3060

ttaagacgct ttgctgctga gacagtcaaa gcaacagaag agttgcataa acagcaattt 3120

gctagtgcag aagtcagaga ggttatttct gaccgtgaat taattctatc atgggaacct 3180

ggtaagacaa ggcctccatt gaatagaaat tatgtgttta ctggctatca ctttaccagg 3240

acaagtaagg tacagctagg tgattttact tttgagaaag gtgaaggtag agatgttgtc 3300

tattataggg cgacgtctac agctaaattg tctcctggag acatttttgt cctaacatca 3360

cacaatgttg tttctcttgt agcaccaact ttgtgtcctc aacaaacttt ttccaggttt 3420

gttaatttaa gacctaatgt aatggtacca gagtgttttg ttaataacat tccattatac 3480

catttagtag gtaaacaaaa gcgtactaca gtacaaggcc ctcctggcag tggtaagtca 3540

cactttgcca taggccttgc tgcgtacttt agtaatgctc gtgtggtttt tacagcatgt 3600

tctcatgctg cagtagatgc gctttgtgaa aaagcgttta aatttcttaa agttgatgat 3660

tgcactcgca tagtacctca aaggactact gttgactgct tctcaaaatt taaagctaat 3720

gacacaggca aaaagtacat ttttagtact attaatgcct tgccagaagt tagttgtgac 3780

attctgttgg tagatgaggt tagtatgttg accaattatg aattgtcatt tattaatggt 3840

aagataaatt accagtatgt tgtgtatgta ggtgatcctg ctcaattacc ggcacctcgt 3900

actttgctca atggttcact ttcacccaag gattataatg tcatcacaaa tcttatggtt 3960

tgtgttaaac ctgacatttt ccttgcgaag tgttaccgtt gtcctaaaga aattgtagac 4020

actgtgtcta ctcttgttta tgatggaaag tttgttgcaa acaacccaga atcacgcgag 4080

tgcttcaagg ttgtagttaa taatggtaat tctgatgtag gtcacgagag tggttcagcc 4140

tacaacacaa cacaattgga atttgtgaaa gattttgttt gtcgcaataa acaatggcga 4200

gaagcaacat tcatttcacc ttataatgca atgaaccaga gagcctatcg catgcttgga 4260

cttaatgtcc agacggtaga ctcttcacaa ggttcagagt atgattatgt tatattctgt 4320

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tacaaggtta atgatgagct agctgcacta gttaatgtag aagctggttc agaaataact 4620

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aacatgttta taacacgtga tgaggcaatt cgcaatgtaa gaggttgggt tggttttgat 4740

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aataattttg agcctgtgaa ctctaaagca cctccaggtg aacaatttaa ccacttgaga 4920

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ctacaacgca tgtatcttaa tgcgtgtgtt gatgctctta aagttaatgt tgtctatgac 5460

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<210> 5

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