本發(fā)明屬于生物技術(shù)和發(fā)酵工程領(lǐng)域，涉及一株生產(chǎn)L-蘋果酸的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，具體涉及一株高效利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法及其生產(chǎn)L-蘋果酸的方法。

背景技術(shù)：

蘋果酸(malic acid)，又名2-羥基丁二酸，是一種重要的四碳化合物。蘋果酸分子中含有一個(gè)不對(duì)稱碳原子，因而可以有三種存在形式，即D-蘋果酸、L-蘋果酸和混合物DL-蘋果酸。L-蘋果酸作為三羧酸循環(huán)的中間體在生物體內(nèi)普遍存在，具有略微刺激性的愉快酸味，能夠被人體直接吸收利用。D-蘋果酸需要經(jīng)過體內(nèi)的消旋酶和氧化還原酶作用轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-蘋果酸之后才能被利用，因此制備具有單一旋光性的L-蘋果酸具有重要的意義。

蘋果酸主要應(yīng)用于藥品、食品和化妝品等領(lǐng)域，具有不可代替性。L-蘋果酸的口感接近天然蘋果的酸味，與檸檬酸相比酸度大、味道柔和、不損害口腔與牙齒，生理代謝上有利于氨基酸吸收、不積累脂肪，屬于新一代的食品酸味劑，被生物界和營(yíng)養(yǎng)界譽(yù)為“最理想的食品酸味劑”，是繼檸檬酸和乳酸之后用量排第3位的食品添加劑，已廣泛用于高檔飲料、調(diào)味品和糖果等食品中。作為蘋果酸天冬氨酸穿梭的重要組成部分，L-蘋果酸對(duì)細(xì)胞質(zhì)和線粒體之間的還原力轉(zhuǎn)移起重要作用，具有重要的生理功能，例如抗疲勞、保護(hù)心臟、促進(jìn)羧酸鹽代謝、促進(jìn)線粒體呼吸、改善記憶能力、增強(qiáng)鈣的活性、降低抗癌藥物毒副作用等，在醫(yī)藥行業(yè)中有許多應(yīng)用。例如，L-蘋果酸可以治療肝功能障礙導(dǎo)致的高血氨癥；L-蘋果酸鉀是良好的鉀補(bǔ)充藥，可以維持體內(nèi)水分平衡，治療水腫和高血壓等；L-蘋果酸鈉具有食鹽的咸味，可以用作腎臟病人的代食鹽?；すI(yè)中，蘋果酸主要作為絡(luò)合劑和酯劑，用于牙膏配方、凈牙片配合和合成香料配方等，還可以用于防臭劑和洗滌劑等。

蘋果酸的獲得方法主要有直接提取法、化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法等。直接提取法的產(chǎn)量有限，僅在早期使用，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)?；瘜W(xué)合成法一般是以石油為原料，主要有反丁烯二酸或順丁烯二酸經(jīng)高溫高壓催化加水等幾種方法，工藝較為成熟，成本相對(duì)較低，但環(huán)境污染大、設(shè)備要求高，所獲得的是混合物DL-蘋果酸，不適于在食品與醫(yī)藥工業(yè)中應(yīng)用。酶轉(zhuǎn)化法主要以富馬酸為底物，經(jīng)過富馬酸酶的催化作用生成蘋果酸，該方法原料依然依賴于高純度化學(xué)合成的富馬酸，存在原料價(jià)格昂貴、生產(chǎn)污染大和副產(chǎn)物含量高等缺點(diǎn)。發(fā)酵法以可再生生物質(zhì)為底物，通過微生物(霉菌、酵母和大腸桿菌等)轉(zhuǎn)化的方法獲得L-蘋果酸，具有原料來源豐富，產(chǎn)品成本低廉、雜酸含量低、食用安全性高等特點(diǎn)，克服了對(duì)石油資源的依賴，具有較好的發(fā)展前景。

目前，蘋果酸發(fā)酵的菌種主要是霉菌，以黃曲霉Aspergillus flavus為主。霉菌發(fā)酵具有產(chǎn)量高、生產(chǎn)強(qiáng)度大等優(yōu)點(diǎn)，但存在副產(chǎn)物多、菌絲易結(jié)球、條件控制復(fù)雜等缺點(diǎn)。大腸桿菌Escherichia coli作為遺傳背景清楚的模式菌株，具有底物范圍廣、生長(zhǎng)迅速、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、基因改造容易等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在琥珀酸和乳酸等有機(jī)酸產(chǎn)品的發(fā)酵中有廣泛應(yīng)用，將其改造用于蘋果酸發(fā)酵，具有較好的可行性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明一個(gè)目的是提供一種構(gòu)建重組菌的方法。

本發(fā)明提供的方法，為提高大腸桿菌中墨角藻糖激酶基因fucK、墨角藻糖-1-磷酸醛縮酶基因fucA、醛脫氫酶基因aldA、乙醇酸氧化酶基因簇(glcD、glcE和glcF)、蘋果酸合酶基因簇(aceB和glcB)的表達(dá)或活性，且使所述大腸桿菌表達(dá)磷酸戊糖異構(gòu)酶基因BurMR1_0153，且抑制或降低所述大腸桿菌基因組中的木酮糖激酶基因xylB、蘋果酸脫氫酶基因簇(mdh、maeA和maeB)和延胡索酸水合酶基因簇(fumA、fumB和fumC)的表達(dá)或活性，得到重組菌。

上述方法中，所述提高大腸桿菌中墨角藻糖激酶基因、墨角藻糖-1-磷酸醛縮酶基因、醛脫氫酶基因、乙醇酸氧化酶基因簇、蘋果酸合酶基因簇的表達(dá)或活性為增加大腸桿菌中墨角藻糖激酶基因、墨角藻糖-1-磷酸醛縮酶基因、醛脫氫酶基因、乙醇酸氧化酶基因簇、蘋果酸合酶基因簇的拷貝數(shù)；

所述抑制或降低所述大腸桿菌基因組中的木酮糖激酶基因、蘋果酸脫氫酶基因簇和延胡索酸水合酶基因簇表達(dá)或活性為敲除所述大腸桿菌基因組中的木酮糖激酶基因、蘋果酸脫氫酶基因簇和延胡索酸水合酶基因簇。

上述方法中，所述增加大腸桿菌中墨角藻糖激酶基因、墨角藻糖-1-磷酸醛縮酶基因、醛脫氫酶基因、乙醇酸氧化酶基因簇、蘋果酸合酶基因簇的拷貝數(shù)為將含有墨角藻糖激酶基因及其啟動(dòng)子的DNA分子、含有墨角藻糖-1-磷酸醛縮酶基因及其啟動(dòng)子的DNA分子、含有醛脫氫酶基因及其啟動(dòng)子的DNA分子、含有乙醇酸氧化酶基因簇及其啟動(dòng)子的DNA分子、含有蘋果酸合酶基因簇中各基因及其各自啟動(dòng)子的DNA分子導(dǎo)入所述大腸桿菌中；

所述使所述大腸桿菌表達(dá)磷酸戊糖異構(gòu)酶基因?yàn)閷⒑辛姿嵛焯钱悩?gòu)酶基因及其啟動(dòng)子的DNA分子導(dǎo)入所述大腸桿菌中。

上述方法中，所述導(dǎo)入是通過重組載體的方式進(jìn)行；

或所述敲除是采用基因組定點(diǎn)編輯或同源重組的方式進(jìn)行；

或所述基因組定點(diǎn)編輯具體為ZFN編輯、TALEN編輯或CRISPR/Cas9編輯；

或所述同源重組具體為λ-red同源重組。

上述方法中，所述乙醇酸氧化酶基因簇由glcD、glcE和glcF組成。

所述蘋果酸合酶基因簇由aceB和glcB組成；

所述蘋果酸脫氫酶基因簇由mdh、maeA和maeB組成；

所述延胡索酸水合酶基因簇由fumA、fumB和fumC組成。

上述方法中，所述磷酸戊糖異構(gòu)酶基因來自于伯克霍爾德氏菌屬Burkholderia。

上述方法中，所述含有磷酸戊糖異構(gòu)酶基因及其啟動(dòng)子的DNA分子的核苷酸序列為序列1；

所述含有墨角藻糖激酶基因及其啟動(dòng)子的DNA分子的核苷酸序列為序列2；

所述含有墨角藻糖-1-磷酸醛縮酶基因及其啟動(dòng)子的DNA分子的核苷酸序列為序列3；

所述含有醛脫氫酶基因及其啟動(dòng)子的DNA分子的核苷酸序列為序列4；

所述含有乙醇酸氧化酶基因簇及其啟動(dòng)子的DNA分子的核苷酸序列為序列5；

所述含有蘋果酸合酶基因aceB及其啟動(dòng)子的DNA分子的核苷酸序列為序列6；

所述含有蘋果酸合酶基因glcB及其啟動(dòng)子的DNA分子的核苷酸序列為序列7；

所述敲除大腸桿菌基因組中的木酮糖激酶基因xylB基因采用λ-red同源重組方式，其中同源重組片段的核苷酸序列為序列8；

所述敲除大腸桿菌基因組中的蘋果酸脫氫酶基因maeA基因采用λ-red同源重組方式，其中同源重組片段的核苷酸序列為序列9；

所述敲除大腸桿菌基因組中的蘋果酸脫氫酶基因maeB基因采用λ-red同源重組方式，其中同源重組片段的核苷酸序列為序列10；

所述敲除大腸桿菌基因組中的蘋果酸脫氫酶基因mdh基因采用λ-red同源重組方式，其中同源重組片段的核苷酸序列為序列11；

所述敲除大腸桿菌基因組中的延胡索酸水合酶基因fumAC基因采用λ-red同源重組方式，其中同源重組片段的核苷酸序列為序列12；

所述敲除大腸桿菌基因組中的延胡索酸水合酶基因fumB基因采用λ-red同源重組方式，其中同源重組片段的核苷酸序列為序列13。

上述方法中，所述大腸桿菌為E.coli MG1655。

由上述方法制備的重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述重組菌在生產(chǎn)蘋果酸中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)蘋果酸的方法，包括如下步驟：發(fā)酵所述重組菌，得到蘋果酸。

上述發(fā)酵的條件為：

搖瓶：37℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)72h，MMX1液體培養(yǎng)基。

發(fā)酵罐：37℃、轉(zhuǎn)速600rpm、通氣量1vvm、6M KOH調(diào)節(jié)pH至7.0條件下發(fā)酵72h，MMX2液體培養(yǎng)基。

上述MMX1液體培養(yǎng)基的配制方法：每升培養(yǎng)基含6g木糖、2g NH₄Cl、5.0g(NH₄)₂SO₄、6.0g KH₂PO₄、8.214g MOPS、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液、0.1g氨芐青霉素和0.05g卡那霉素，其余為水。

上述微量元素溶液的配制方法：3.6g FeCl₂·4H₂O、5g CaCl₂·2H₂O、1.3g MnCl₂·2H₂O、0.38g CuCl₂·2H₂O、0.5g CoCl₂·6H₂O、0.94g ZnCl₂、0.0311g H₃BO₃、0.4g Na₂EDTA·2H₂O、1.01g thiamine-HCl，其余為0.5M HCl。

上述發(fā)酵培養(yǎng)用的培養(yǎng)基為MMX2液體培養(yǎng)基。

上述MMX2液體培養(yǎng)基的配制方法：每升培養(yǎng)基含60g木糖、2g NH₄Cl、5.0g(NH₄)₂SO₄、6.0g KH₂PO₄、8.214g MOPS、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液、0.1g氨芐青霉素和0.05g卡那霉素，其余為水。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過在大腸桿菌中表達(dá)9個(gè)代謝途徑相關(guān)的基因和敲除7個(gè)內(nèi)源基因，獲得了能夠以木糖等簡(jiǎn)單的碳水化合物為單一碳源，發(fā)酵獲得蘋果酸的工程菌株，并且重組菌在搖瓶和發(fā)酵罐培養(yǎng)中的蘋果酸的產(chǎn)量也能達(dá)到較高的水平，具有較好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為pMCS-GA1載體圖譜。

圖2為pMCS-GA2載體圖譜。

圖3為pMCS-GA3載體圖譜。

圖4為pMCS-GA4載體圖譜。

圖5為pUC-MA1載體圖譜。

圖6為pUC-MA2載體圖譜。

圖7為pUC-MA3載體圖譜。

圖8為蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖9為木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所使用的材料和試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中涉及分子生物學(xué)操作所用的酶均購(gòu)于NEB(New England Biolabs)公司；質(zhì)粒提取和DNA片段回收所用的試劑盒購(gòu)自北京博邁德生物技術(shù)公司；實(shí)施例中涉及的DNA合成和測(cè)序工作由北京博邁德生物技術(shù)公司完成。

E.coli MG1655：公眾可以從E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The Coli Genetic Stock Center獲得，編號(hào)CGSC#6300。

質(zhì)粒pKD13：公眾可以從E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The Coli Genetic Stock Center獲得，編號(hào)CGSC#7633。

質(zhì)粒pKD46：公眾可以從E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The Coli Genetic Stock Center獲得，編號(hào)CGSC#7739。

質(zhì)粒pCP20：公眾可以從E.coli Genetic Resources at Yale CGSC，The Coli Genetic Stock Center獲得，編號(hào)CGSC#7637。

質(zhì)粒pBBR1MCS-2：公眾可根據(jù)NCBI accession number U23751.1的序列自行提交DNA合成公司進(jìn)行質(zhì)粒合成；公眾也可從北京化工大學(xué)獲得，該質(zhì)粒記載在如下文獻(xiàn)中：Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS,carrying different antibiotic-resistance cassettes,1995,Gene,166:175-176。

質(zhì)粒pUC19：公眾可以從NEB(New England Biolabs)公司購(gòu)買，貨號(hào)N3041S。

實(shí)施例1、重組菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)的構(gòu)建

一、重組表達(dá)載體pMCS-GA4的構(gòu)建

1、人工合成序列表中序列1所示的DNA，含有BurMR1_0153表達(dá)盒，上游為SacI位點(diǎn)，下游為XbaI位點(diǎn)，其中第9-51位核苷酸為啟動(dòng)子序列，第70-942位核苷酸為BurMR1_0153基因序列。

2、人工合成序列表中序列2所示的DNA，含有fucK表達(dá)盒，上游為XbaI位點(diǎn)，下游為HindIII位點(diǎn)，其中第9-51位核苷酸為啟動(dòng)子序列，第70-1518位核苷酸為fucK基因序列。

3、人工合成序列表中序列3所示的DNA，含有fucA表達(dá)盒，上游為HindIII位點(diǎn)，下游為XhoI位點(diǎn)，其中第9-51位核苷酸為啟動(dòng)子序列，第70-717位核苷酸為fucA基因序列。

4、人工合成序列表中序列4所示的DNA，含有aldA表達(dá)盒，上游為XhoI位點(diǎn)，下游為KpnI位點(diǎn)，其中第9-51位核苷酸為啟動(dòng)子序列，第70-1509位核苷酸為aldA基因序列。

5、用SacI和XbaI雙酶切步驟1中合成的DNA序列，回收大小約為936bp的DNA片段；用SacI和XbaI雙酶切載體pBBR1MCS-2，回收大小約為5124bp的DNA片段；將上述936bp和5124bp的兩個(gè)DNA片段連接，得到連接產(chǎn)物通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coli MG1655中，并涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16h，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用SacI和XbaI進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物大小約為936bp和5124bp的質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒，將此重組質(zhì)粒命名為pMCS-GA1。將得到的重組質(zhì)粒pMCS-GA1進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明：在質(zhì)粒pBBR1MCS-2的SacI和XbaI酶切位點(diǎn)間插入了如序列表中序列1所示的DNA序列，表明質(zhì)粒正確。

6、用XbaI和HindIII雙酶切步驟2中合成的DNA序列，回收大小約為1516bp的DNA片段；用XbaI和HindIII雙酶切步驟5中得到的質(zhì)粒pMCS-GA1，回收大小約為6018bp的DNA片段；將上述1516bp和6018bp的兩個(gè)DNA片段連接，得到連接產(chǎn)物通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coli MG1655中，并涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16h，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用XbaI和HindIII進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物大小約為1516bp和6018bp的質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒，將此重組質(zhì)粒命名為pMCS-GA2。將得到的重組質(zhì)粒pMCS-GA2進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明：在質(zhì)粒pMCS-GA1的XbaI和HindIII酶切位點(diǎn)間插入了如序列表中序列2所示的DNA序列，表明質(zhì)粒正確。

7、用HindIII和XhoI雙酶切步驟3中合成的DNA序列，回收大小約為715bp的DNA片段；用HindIII和XhoI雙酶切步驟6中得到的質(zhì)粒pMCS-GA2，回收大小約為7513bp的DNA片段；將上述715bp和7513bp的兩個(gè)DNA片段連接，得到連接產(chǎn)物通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coli MG1655中，并涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16h，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用HindIII和XhoI進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物大小約為715bp和7513bp的質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒，將此重組質(zhì)粒命名為pMCS-GA3。將得到的重組質(zhì)粒pMCS-GA3進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明：在質(zhì)粒pMCS-GA2的HindIII和XhoI酶切位點(diǎn)間插入了如序列表中序列3所示的DNA序列，表明質(zhì)粒正確。

8、用XhoI和KpnI雙酶切步驟4中合成的DNA序列，回收大小約為1511bp的DNA片段；用XhoI和KpnI雙酶切步驟7中得到的質(zhì)粒pMCS-GA3，回收大小約為8209bp的DNA片段；將上述1511bp和8209bp的兩個(gè)DNA片段連接，得到連接產(chǎn)物通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coli MG1655中，并涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16h，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用XhoI和KpnI進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物大小約為1511bp和8209bp的質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒，將此重組質(zhì)粒命名為pMCS-GA4。將得到的重組質(zhì)粒pMCS-GA4進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明：在質(zhì)粒pMCS-GA3的XhoI和KpnI酶切位點(diǎn)間插入了如序列表中序列4所示的DNA序列，表明質(zhì)粒正確。

二、重組表達(dá)載體pUC-MA3的構(gòu)建

1、人工合成序列表中序列5所示的DNA，含有g(shù)lcD-glcE-glcF表達(dá)盒，上游為SphI位點(diǎn)，下游為PstI位點(diǎn)，其中第9-51位核苷酸為啟動(dòng)子序列，第70-1569位核苷酸為glcD基因序列，第1569-2621位核苷酸為glcE基因序列，第2632-3855位核苷酸為glcF基因序列。

2、人工合成序列表中序列6所示的DNA，含有aceB表達(dá)盒，上游為PstI位點(diǎn)，下游為SacI位點(diǎn)，其中第9-51位核苷酸為啟動(dòng)子序列，第70-1671位核苷酸為aceB基因序列。

3、人工合成序列表中序列7所示的DNA，含有g(shù)lcB表達(dá)盒，上游為SacI位點(diǎn)，下游為EcoRI位點(diǎn)，其中第9-51位核苷酸為啟動(dòng)子序列，第70-2241位核苷酸為glcB基因序列。

4、用SphI和PstI雙酶切步驟1中合成的DNA序列，回收大小約為3853bp的DNA片段；用SphI和PstI雙酶切載體pUC19，回收大小約為2680bp的DNA片段；將上述3853bp和2680bp的兩個(gè)DNA片段連接，得到連接產(chǎn)物通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coli MG1655中，并涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16h，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用SphI和PstI進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物大小約為3853bp和2680bp的質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒，將此重組質(zhì)粒命名為pUC-MA1。將得到的重組質(zhì)粒pUC-MA1進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明：在質(zhì)粒pUC19的SphI和PstI酶切位點(diǎn)間插入了如序列表中序列5所示的DNA序列，表明質(zhì)粒正確。

5、用PstI和SacI雙酶切步驟2中合成的DNA序列，回收大小約為1669bp的DNA片段；用PstI和SacI雙酶切步驟4中得到的質(zhì)粒pUC-MA1，回收大小約為6500bp的DNA片段；將上述1669bp和6500bp的兩個(gè)DNA片段連接，得到連接產(chǎn)物通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coli MG1655中，并涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16h，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用PstI和SacI進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物大小約為1669bp和6500bp的質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒，將此重組質(zhì)粒命名為pUC-MA2。將得到的重組質(zhì)粒pUC-MA2進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明：在質(zhì)粒pUC-MA1的PstI和SacI酶切位點(diǎn)間插入了如序列表中序列6所示的DNA序列，表明質(zhì)粒正確。

6、用SacI和EcoRI雙酶切步驟3中合成的DNA序列，回收大小約為2235bp的DNA片段；用SacI和EcoRI雙酶切步驟5中得到的質(zhì)粒pUC-MA2，回收大小約為8167bp的DNA片段；將上述2235bp和8167bp的兩個(gè)DNA片段連接，得到連接產(chǎn)物通過化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E.coli MG1655中，并涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)16h，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用SacI和EcoRI進(jìn)行酶切驗(yàn)證，酶切產(chǎn)物大小約為2235bp和8167bp的質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒，將此重組質(zhì)粒命名為pUC-MA3。將得到的重組質(zhì)粒pUC-MA3進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明：在質(zhì)粒pUC-MA2的SacI和EcoRI酶切位點(diǎn)間插入了如序列表中序列7所示的DNA序列，表明質(zhì)粒正確。

三、大腸桿菌E.coli MG1655ΔMA6的構(gòu)建

1、敲除xylB基因

1)合成xylB基因敲除所用的引物xylBF和xylBR，序列如下：

xylBF：

5’-ATGTATATCGGGATAGATCTTGGCACCTCGGGCGTAAAAGTTATTTTGCTCAACGAGCAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；

xylBR：

5’-TTACGCCATTAATGGCAGAAGTTGCTGATAGAGGCGACGGAACGTTTCTCGTCGTGGCTGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’。

2)以質(zhì)粒pKD13為模板，采用引物xylBF和xylBR，PCR擴(kuò)增得到1500bp左右的DNA片段，命名為xylB同源重組片段，瓊脂糖凝膠電泳對(duì)得到的DNA片段進(jìn)行純化。

經(jīng)過測(cè)序，xylB同源重組片段的核苷酸序列為序列8，其中，第1-60位為xylB基因上游同源臂，第61-1364位為FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位為xylB基因下游同源臂。

3)利用電轉(zhuǎn)化的方法將pKD46轉(zhuǎn)化至受體菌株E.coli MG1655中，并涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24h，得到轉(zhuǎn)化子，提質(zhì)粒驗(yàn)證，獲得E.coli MG1655(pKD46)。

4)將E.coli MG1655(pKD46)接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)4h，加入阿拉伯糖至終濃度5g/L，繼續(xù)培養(yǎng)1.5h，接下來制備E.coli MG1655(pKD46)的感受態(tài)細(xì)胞，將步驟2)中獲得的DNA片段轉(zhuǎn)入E.coli MG1655(pKD46)的感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h，得到轉(zhuǎn)化子。

5)利用菌落PCR的方法，以xylBF和xylBR為引物，將PCR產(chǎn)物純化之后測(cè)序，篩選正確的xylB基因已經(jīng)被替換為Kan抗性基因的克隆，得到E.coli MG1655xylB-K(pKD46)。

6)將E.coli MG1655xylB-K(pKD46)接種于LB液體培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)傳代三次，除去pKD46質(zhì)粒，得到E.coli MG1655xylB-K；E.coli MG1655xylB-K是xylB基因被Kan基因替換了的E.coli MG1655。

7)將E.coli MG1655xylB-K接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)接到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)3h，制備E.coli MG1655xylB-K感受態(tài)細(xì)胞。

8)利用電轉(zhuǎn)化的方法將pCP20轉(zhuǎn)化到E.coli MG1655xylB-K感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)48h，得到轉(zhuǎn)化子。

利用菌落PCR的方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子，以xylBF和xylBR為引物，得到202bp片段的為陽性克隆。

將該陽性克隆送去測(cè)序，其為敲除E.coli MG1655基因組上的xylB基因得到的菌，將該菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，42℃?zhèn)鞔?，除去pCP20,命名為突變體E.coliΔMA1。

2、敲除maeA基因

與上述1的方法基本相同，不同的是如下：

maeA敲除引物序列如下：

maeAF：

5’-ATGGAACCAAAAACAAAAAAACAGCGTTCGCTTTATATCCCTTACGCTGGCCCTGTACTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；

maeAR：

5’-TTAGATGGAGGTACGGCGGTAGTCGCGGTATTCGGCTTGCCAGAAATTATCGTCAATGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；

maeA同源重組片段的核苷酸序列為序列9，其中，第1-60位為maeA基因上游同源臂，第61-1364位為FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位為maeA基因下游同源臂。

轉(zhuǎn)化受體菌株為上述1得到的突變體E.coliΔMA1。

利用菌落PCR的方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子，以maeAF和maeAR為引物，得到202bp的片段陽性克隆。

將該陽性克隆送去測(cè)序，其為敲除E.coliΔMA1基因組上的maeA基因得到的菌，將該菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，42℃?zhèn)鞔?，除去pCP20,命名為突變體E.coliΔMA2。

3、敲除maeB基因

與上述1的方法基本相同，不同的是如下：

maeB敲除引物序列如下：

maeBF：

5’-ATGGATGACCAGTTAAAACAAAGTGCACTTGATTTCCATGAATTTCCAGTTCCAGGGAAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；

maeBR：

5’-TTACAGCGGTTGGGTTTGCGCTTCTACCACGGCCAGCGCCACCATGTTGACGATACGACGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；

maeB同源重組片段的核苷酸序列為序列10，其中，第1-60位為maeB基因上游同源臂，第61-1364位為FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位為maeB基因下游同源臂。

轉(zhuǎn)化受體菌株為上述2得到的突變體E.coliΔMA2。

利用菌落PCR的方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子，以maeBF和maeBR為引物，得到202bp的片段陽性克隆。

將該陽性克隆送去測(cè)序，其為敲除E.coliΔMA2基因組上的maeB基因得到的菌，將該菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，42℃?zhèn)鞔?，除去pCP20,命名為突變體E.coliΔMA3。

4、敲除mdh基因

與上述1的方法基本相同，不同的是如下：

mdh敲除引物序列如下：

mdhF：

5’-ATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGCTGCTGGCGGTATTGGCCAGGCGCTTGCACTACTGTTAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；

mdhR：

5’-TTACTTATTAACGAACTCTTCGCCCAGGGCGATATCTTTCTTCAGCGTATCCAGCATACCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；

mdh同源重組片段的核苷酸序列為序列11，其中，第1-60位為mdh基因上游同源臂，第61-1364位為FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位為mdh基因下游同源臂。

轉(zhuǎn)化受體菌株為上述3得到的突變體E.coliΔMA3。

利用菌落PCR的方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子，以mdhF和mdhR為引物，得到202bp的片段陽性克隆。

將該陽性克隆送去測(cè)序，其為敲除E.coliΔMA3基因組上的mdh基因得到的菌，將該菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，42℃?zhèn)鞔危CP20,命名為突變體E.coliΔMA4。

5、敲除fumAC基因

與上述1的方法基本相同，不同的是如下：

fumAC敲除引物序列如下：

fumAC-F：

5’-ATGTCAAACAAACCCTTTCATTATCAGGCTCCTTTTCCACTCAAAAAAGATGATACTGAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；

fumACR：

5’-TTAACGCCCGGCTTTCATACTGCCGACCATCTGTTCTGGCCGTACCCAGCTGTCAAACTCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’；

fumAC同源重組片段的核苷酸序列為序列12，其中，第1-60位為fumAC基因上游同源臂，第61-1364位為FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位為fumAC基因下游同源臂。

轉(zhuǎn)化受體菌株為上述4得到的突變體E.coliΔMA4。

利用菌落PCR的方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子，以fumACF和fumACR為引物，得到202bp的片段陽性克隆。

將該陽性克隆送去測(cè)序，其為敲除E.coliΔMA4基因組上的fumAC基因得到的菌，將該菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，42℃?zhèn)鞔危CP20,命名為突變體E.coliΔMA5。

6、敲除fumB基因

與上述1的方法基本相同，不同的是如下：

fumB敲除引物序列如下：

fumBF：

5’-ATGTCAAACAAACCCTTTATCTACCAGGCACCTTTCCCGATGGGGAAAGACAATACCGAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’；

fumB-R：

5’-TTACTTAGTGCAGTTCGCGCACTGTTTGTTGACGATTTGCTGGAAGAAGTCGTTACCTTTATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’。

fumB同源重組片段的核苷酸序列為序列13，其中，第1-60位為fumB基因上游同源臂，第61-1364位為FRT序列和Kan抗性基因，第1365-1424位為fumB基因下游同源臂。

轉(zhuǎn)化受體菌株為上述5得到的突變體E.coliΔMA5。

利用菌落PCR的方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子，以fumBF和fumBR為引物，得到202bp的片段陽性克隆。

將該陽性克隆送去測(cè)序，其為敲除E.coliΔMA5基因組上的fumB基因得到的菌，將該菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，42℃?zhèn)鞔?，除去pCP20,命名為突變體E.coliΔMA6。

突變體E.coliΔMA6為敲除E.coli MG1655基因組上的xylB、maeA、maeB、mdh、fumA、fumB和fumC得到的重組菌。

四、重組菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)的構(gòu)建

1、將上述一得到的重組質(zhì)粒pMCS-GA4和上述二得到的重組質(zhì)粒pUC-MA3通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到上述三得到的大腸桿菌E.coli MG1655ΔMA6，并涂布于含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。

2、挑取單克隆于含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。

3、提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化的正確性，得到含有兩個(gè)質(zhì)粒的重組菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)。

E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)為將BurMR1_0153、fucK、fucA、aldA、glcD、glcE、glcF、aceB、glcB轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli MG1655中，且將敲除E.coli MG1655的基因組中的木酮糖激酶基因xylB、蘋果酸脫氫酶基因mdh、maeA、maeB、延胡索酸水合酶基因fumA、fumB、fumC得到的重組菌。

五、對(duì)照重組菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4)的構(gòu)建

1、將上述一得到的重組質(zhì)粒pMCS-GA4通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到上述三得到的大腸桿菌E.coli MG1655ΔMA6，并涂布于含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。

2、挑取單克隆于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。

3、提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化的正確性，得到含有質(zhì)粒的重組菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4)。

E.coliΔMA6(pMCS-GA4)為將BurMR1_0153、fucK、fucA、aldA轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli MG1655中，且將敲除E.coli MG1655的基因組中的木酮糖激酶基因xylB、蘋果酸脫氫酶基因mdh、maeA、maeB、延胡索酸水合酶基因fumA、fumB、fumC得到的重組菌。

六、對(duì)照重組菌E.coliΔMA6(pUC-MA3)的構(gòu)建

1、將上述二得到的重組質(zhì)粒pUC-MA3通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到上述三得到的大腸桿菌E.coli MG1655ΔMA6，并涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。

2、挑取單克隆于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。

3、提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化的正確性，得到含有質(zhì)粒的重組菌E.coliΔMA6(pUC-MA3)。

E.coliΔMA6(pUC-MA3)為將glcD、glcE、glcF、aceB、glcB轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli MG1655中，且將敲除E.coli MG1655的基因組中的木酮糖激酶基因xylB、蘋果酸脫氫酶基因mdh、maeA、maeB、延胡索酸水合酶基因fumA、fumB、fumC得到的重組菌。

七、對(duì)照重組菌E.coli MG1655(pMCS-GA4+pUC-MA3)的構(gòu)建

1、將上述一得到的重組質(zhì)粒pMCS-GA4和上述二得到的重組質(zhì)粒pUC-MA3通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coli MG1655，并涂布于含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。

2、挑取單克隆于含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24h。

3、提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化的正確性，得到含有兩個(gè)質(zhì)粒的重組菌E.coli MG1655(pMCS-GA4+pUC-MA3)。

E.coli MG1655(pMCS-GA4+pUC-MA3)為將BurMR1_0153、fucK、fucA、aldA、glcD、glcE、glcF、aceB、glcB轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli MG1655中。

實(shí)施例2、E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)在生產(chǎn)蘋果酸中的應(yīng)用

一、搖瓶培養(yǎng)重組菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)生產(chǎn)蘋果酸

1、將實(shí)施例1制備的重組菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)在含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)16h，作為種子液。

2、按體積比4％的接種量，將種子液接種到MMX1液體培養(yǎng)基中，500ml搖瓶中裝液量為50ml，于37℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)72h，期間收集發(fā)酵液。

MMX1液體培養(yǎng)基的配制方法：每升培養(yǎng)基含6g木糖、2g NH₄Cl、5.0g(NH₄)₂SO₄、6.0g KH₂PO₄、8.214g MOPS、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液、0.1g氨芐青霉素和0.05g卡那霉素，其余為水。

微量元素溶液的配制方法：3.6g FeCl₂·4H₂O、5g CaCl₂·2H₂O、1.3g MnCl₂·2H₂O、0.38g CuCl₂·2H₂O、0.5g CoCl₂·6H₂O、0.94g ZnCl₂、0.0311g H₃BO₃、0.4g Na₂EDTA·2H₂O、1.01g thiamine-HCl，其余為0.5M HCl。

3、通過高效液相色譜對(duì)基因工程菌產(chǎn)生的蘋果酸和消耗的木糖進(jìn)行定量檢測(cè)。具體條件如下：

儀器：美國(guó)tsp公司Spectra系列HPLC儀，配有SCM1000型脫氣泵，P2000型兩臺(tái)泵，AS3000型自動(dòng)進(jìn)樣器，RI-150檢測(cè)器。

色譜條件：Bio-RadHPX-87H(7.8×300mm)；流速0.50mL/min；柱溫37度；流動(dòng)相為7mM硫酸水溶液。

檢測(cè)方法：

取0、2、4、6、8、10g/L的蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)品水溶液(Sigma-Aldrich，產(chǎn)品編號(hào)02288)，用0.22μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣10μL，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，用不同濃度的蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，不同濃度濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖8)。蘋果酸的出峰時(shí)間為9.040min。取0、4、8、12、16、20g/L的木糖標(biāo)準(zhǔn)品水溶液(Sigma-Aldrich，產(chǎn)品編號(hào)X1500)，用0.22μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣10μL，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，用不同濃度的蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，不同濃度濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖9)。木糖的出峰時(shí)間為9.687min。

取2mL的發(fā)酵液，于12000rpm離心10min，將其發(fā)酵上清液轉(zhuǎn)移到新Eppendorf管內(nèi)，用0.22μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣10μL，進(jìn)行HPLC檢測(cè)。

將待測(cè)樣品發(fā)酵上清液的蘋果酸色譜峰面積代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得到待測(cè)樣品發(fā)酵上清液的蘋果酸含量。將待測(cè)樣品發(fā)酵上清液的木糖色譜峰面積代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算得到待測(cè)樣品發(fā)酵上清液的殘留木糖含量，將接種后初始的木糖含量減去發(fā)酵上清液中的殘留木糖含量得到重組菌消耗的木糖量。

E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)在搖瓶培養(yǎng)中獲得的蘋果酸產(chǎn)量和消耗的木糖的結(jié)果如表1所示：

表1、重組菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)在搖瓶中的蘋果酸的產(chǎn)量和木糖消耗情況

木糖轉(zhuǎn)化率＝蘋果酸產(chǎn)量/木糖消耗量(g/g)

由表1中的結(jié)果可以看出，本發(fā)明構(gòu)建的重組菌株能夠在添加木糖為碳源的簡(jiǎn)單礦物鹽培養(yǎng)基中，發(fā)酵獲得蘋果酸，最終72h的蘋果酸產(chǎn)量為3.26g/L，木糖轉(zhuǎn)化率為0.54g/g。

二、對(duì)照菌株E.coliΔMA6(pMCS-GA4)的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

1、將實(shí)施例1制備的重組菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4)在含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)16h，作為種子液。

2、按體積比4％的接種量，將種子液接種到MMX1液體培養(yǎng)基(含卡那霉素，不含氨芐青霉素)中，500ml搖瓶中裝液量為50ml，于37℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)72h，期間收集發(fā)酵液。

3、經(jīng)過HPLC檢測(cè)，具體條件上述一的3所述，沒有發(fā)現(xiàn)蘋果酸的積累，表明僅將BurMR1_0153、fucK、fucA、aldA轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，同時(shí)敲除xylB、mdh、maeA、maeB、fumA、fumB、fumC，所得到的重組菌以木糖為底物，不能合成蘋果酸。

三、對(duì)照菌株E.coliΔMA6(pUC-MA3)的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

1、將實(shí)施例1制備的重組菌E.coliΔMA6(pUC-MA3)在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)16h，作為種子液。

2、按體積比4％的接種量，將種子液接種到MMX1液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素，不含卡那霉素)中，500ml搖瓶中裝液量為50ml，于37℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)72h，期間收集發(fā)酵液。

3、經(jīng)過HPLC檢測(cè)，具體條件上述一的3所述，沒有發(fā)現(xiàn)蘋果酸的積累，表明僅將glcD、glcE、glcF、aceB、glcB轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，同時(shí)敲除xylB、mdh、maeA、maeB、fumA、fumB、fumC，所得的重組菌以木糖為底物，不能合成蘋果酸。

四、對(duì)照菌株E.coli MG1655(pMCS-GA4+pUC-MA3)的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

1、將實(shí)施例1制備的重組菌E.coli MG1655(pMCS-GA4+pUC-MA3)在含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)16h，作為種子液。

2、按體積比4％的接種量，將種子液接種到MMX1液體培養(yǎng)基(含氨芐青霉素和卡那霉素)中，500ml搖瓶中裝液量為50ml，于37℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)72h，期間收集發(fā)酵液。

3、經(jīng)過HPLC檢測(cè)，具體條件上述一的3所述，沒有發(fā)現(xiàn)蘋果酸的積累，表明將BurMR1_0153、fucK、fucA、aldA、glcD、glcE、glcF、aceB、glcB轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，如果不對(duì)內(nèi)源的xylB、mdh、maeA、maeB、fumA、fumB、fumC等基因進(jìn)行敲除，以木糖為底物，不能合成蘋果酸。

五、發(fā)酵罐培養(yǎng)重組菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)生產(chǎn)蘋果酸

1、將實(shí)施例1制備的重組菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)在含有氨芐青霉素和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)16h，作為一級(jí)種子液。

2、按體積比4％的接種量，將一級(jí)種子液接種到MMX1液體培養(yǎng)基中，500ml搖瓶中裝液量為50ml，于37℃、轉(zhuǎn)速200rpm條件下培養(yǎng)24h，作為二級(jí)種子液。

3、按體積比8％的接種量，將二級(jí)種子液接種到MMX2液體培養(yǎng)基中，在3L的發(fā)酵罐中，于37℃、轉(zhuǎn)速600rpm、通氣量1vvm、6M KOH調(diào)節(jié)pH至7.0條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間為72h，期間收集發(fā)酵液上清。

MMX2液體培養(yǎng)基的配制方法：每升培養(yǎng)基含60g木糖、2g NH₄Cl、5.0g(NH₄)₂SO₄、6.0g KH₂PO₄、8.214g MOPS、0.5g NaCl，1mL微量元素溶液、0.1g氨芐青霉素和0.05g卡那霉素，其余為水。

微量元素溶液的配制方法：3.6g FeCl₂·4H₂O、5g CaCl₂·2H₂O、1.3g MnCl₂·2H₂O、0.38g CuCl₂·2H₂O、0.5g CoCl₂·6H₂O、0.94g ZnCl₂、0.0311g H₃BO₃、0.4g Na₂EDTA·2H₂O、1.01g thiamine-HCl，其余為0.5M HCl。

4、通過高效液相色譜的對(duì)基因工程菌產(chǎn)生的蘋果酸和消耗的木糖進(jìn)行定量檢測(cè)。具體條件上述一的3所述。

E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)在發(fā)酵罐培養(yǎng)中獲得的蘋果酸產(chǎn)量和消耗的木糖的結(jié)果如表2所示：

表2、重組菌E.coliΔMA6(pMCS-GA4+pUC-MA3)在發(fā)酵罐中的蘋果酸的產(chǎn)量和木糖消耗情況

由表2中的結(jié)果可以看出，本發(fā)明構(gòu)建的重組菌株能夠在添加木糖為碳源的簡(jiǎn)單礦物鹽培養(yǎng)基中，發(fā)酵獲得蘋果酸，最終72h的蘋果酸產(chǎn)量為25.17g/L，木糖轉(zhuǎn)化率為0.42g/g。

本發(fā)明以木糖為底物，通過代謝途徑的理性設(shè)計(jì)，獲得新的發(fā)酵生產(chǎn)蘋果酸的工程菌株，為蘋果酸的生物法合成提供了新的思路。