本申請(qǐng)是分案申請(qǐng)，其母案申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枺?01480011005.2，申請(qǐng)日：2014.2.27，發(fā)明名稱：細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體、生物親和性高分子塊及它們的制造方法

本發(fā)明涉及細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體、生物親和性高分子塊以及它們的制造方法。詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及在移植后可以抑制細(xì)胞壞死的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體、其制造中使用的生物親和性高分子塊、以及它們的制造方法。

背景技術(shù)：

目前，使陷入功能障礙、功能衰竭的生物體組織、器官實(shí)現(xiàn)再生的再生醫(yī)療的實(shí)用化得到發(fā)展。再生醫(yī)療是使用細(xì)胞、支架及生長(zhǎng)因子這三種因子重新作出僅通過(guò)生物體所具有的自然痊愈能力無(wú)法恢復(fù)的生物體組織并使其具有與原來(lái)的組織相同的形態(tài)、功能的新的醫(yī)療技術(shù)。近年來(lái)，使用細(xì)胞的治療逐漸得到實(shí)現(xiàn)。例如，可以列舉使用自體細(xì)胞的培養(yǎng)表皮、使用自體軟骨細(xì)胞的軟骨治療、使用間充質(zhì)干細(xì)胞的骨再生治療、使用成肌細(xì)胞的心肌細(xì)胞片治療、利用角膜上皮片的角膜再生治療及神經(jīng)再生治療等。這些新的治療不同于以往的利用人造物的替代醫(yī)療(例如，人造骨修復(fù)劑、透明質(zhì)酸注射等)，可實(shí)現(xiàn)生物組織的修復(fù)、再生，能夠得到高治療效果。實(shí)際上，使用自體細(xì)胞的培養(yǎng)表皮、培養(yǎng)軟骨等產(chǎn)品已在市售。

例如，在使用細(xì)胞片的心肌的再生中，為了再生具有厚度的組織，認(rèn)為需要細(xì)胞片的多層結(jié)構(gòu)體。近年來(lái)，岡野等人開(kāi)發(fā)了使用溫度響應(yīng)性培養(yǎng)皿的細(xì)胞片。由于細(xì)胞片不需要胰蛋白酶等的酶處理，因此可保持細(xì)胞與細(xì)胞的結(jié)合及粘附蛋白(非專利文獻(xiàn)1至6)。這種細(xì)胞片制造技術(shù)可期待對(duì)心肌組織的再生有用(非專利文獻(xiàn)7)。另外，為了在細(xì)胞片中形成血管網(wǎng)，岡野等人進(jìn)行了一并引入有血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞片的開(kāi)發(fā)(非專利文獻(xiàn)8)。

此外，專利文獻(xiàn)1中記載了一種細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體，其通過(guò)將具有生物親和性的高分子塊和細(xì)胞三維配置為嵌合狀來(lái)制造。該細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體中，能夠從外部向細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體的內(nèi)部進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)輸送，具有充分的厚度，并且細(xì)胞在結(jié)構(gòu)體中均勻地存在。另外，專利文獻(xiàn)1的實(shí)施例中，使用包含重組明膠、天然明膠材料的高分子塊證實(shí)了高細(xì)胞存活活性。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：國(guó)際公開(kāi)wo2011/108517號(hào)公報(bào)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：shimizu,t.等,circ.res.90,e40-48(2002)

非專利文獻(xiàn)2：kushida,a.等,j.biomed.mater.res.51,216-223(2000)

非專利文獻(xiàn)3：kushida,a.等,j.biomed.mater.res.45,355-362(1999)

非專利文獻(xiàn)4：shimizu,t.,yamato,m.,kikuchi,a.&okano,t.,tissueeng.7,141-151(2001)

非專利文獻(xiàn)5：shimizu,t等,j.biomed.mater.res.60,110-117(2002)

非專利文獻(xiàn)6：harimoto,m.等,j.biomed.mater.res.62,464-470(2002)

非專利文獻(xiàn)7：shimizu,t.,yamato,m.,kikuchi,a.&okano,t.,biomaterials24,2309-2316(2003)

非專利文獻(xiàn)8：inflammationandregenerationvol.25no.32005,p158-159.第26次日本炎癥-再生醫(yī)學(xué)會(huì)、“炎癥學(xué)と再生醫(yī)學(xué)の融合を目指して”、岡野光夫

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的課題

專利文獻(xiàn)1的實(shí)施例記載的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的高分子塊中，為了進(jìn)行高分子的交聯(lián)，使用了對(duì)人體的毒性強(qiáng)的戊二醛。這種使用戊二醛制造而成的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體對(duì)人體的毒性令人擔(dān)憂，因此，為保險(xiǎn)起見(jiàn)，無(wú)法用于細(xì)胞移植治療。因此，尚未提供不含有戊二醛這樣的具有人體毒性的物質(zhì)、且能夠抑制移植后的細(xì)胞壞死的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，期望滿足這些條件的適合于細(xì)胞移植治療用途的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體。

本發(fā)明的課題在于提供不含有戊二醛這樣的具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)、且抑制結(jié)構(gòu)體中的移植后的細(xì)胞壞死(即，細(xì)胞存活率優(yōu)異)的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體。此外，本發(fā)明的課題還在于提供適合制造上述細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的生物親和性高分子塊。此外，本發(fā)明所要解決的課題還在于提供上述細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的制造方法、以及上述生物親和性高分子塊的制造方法。

用于解決課題的手段

本發(fā)明人為了解決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在通過(guò)使用不含戊二醛的生物親和性高分子塊和至少一種細(xì)胞、并在多個(gè)細(xì)胞間的間隙內(nèi)配置多個(gè)生物親和性高分子塊來(lái)制造細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體時(shí)，通過(guò)使用振實(shí)密度為10mg/cm³以上且500mg/cm³以下、或者二維截面像的截面積的平方根÷周長(zhǎng)的值為0.01以上且0.13以下的生物親和性高分子塊，能夠提供解決了上述課題的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，從而完成了本發(fā)明。

即，根據(jù)本發(fā)明，提供一種細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，其為含有不含戊二醛的生物親和性高分子塊和至少一種細(xì)胞、且在多個(gè)細(xì)胞間的間隙內(nèi)配置有多個(gè)生物親和性高分子塊的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，上述生物親和性高分子塊的振實(shí)密度為10mg/cm³以上且500mg/cm³以下、或者上述高分子塊的二維截面像的截面積的平方根÷周長(zhǎng)的值為0.01以上且0.13以下。

此外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種生物親和性高分子塊，其為不含有戊二醛的生物親和性高分子塊，振實(shí)密度為10mg/cm³以上且500mg/cm³以下、或者二維截面像的截面積的平方根÷周長(zhǎng)的值為0.01以上且0.13以下。

優(yōu)選一個(gè)生物親和性高分子塊的大小為20μm以上且200μm以下。

優(yōu)選一個(gè)生物親和性高分子塊的大小為50μm以上且120μm以下。

優(yōu)選生物親和性高分子利用熱、紫外線或酶進(jìn)行了交聯(lián)。

優(yōu)選生物親和性高分子塊的交聯(lián)度為6以上，且上述生物親和性高分子塊的吸水率為300％以上。

優(yōu)選生物親和性高分子塊為通過(guò)將生物親和性高分子的多孔體粉碎而得到的生物親和性高分子塊。

優(yōu)選生物親和性高分子的多孔體通過(guò)包括下述步驟的方法制造而成，

(a)將生物親和性高分子的溶液通過(guò)凍結(jié)處理進(jìn)行凍結(jié)的步驟，該凍結(jié)處理中，溶液內(nèi)液溫最高的部分的液溫(內(nèi)部最高液溫)在未凍結(jié)狀態(tài)下為“溶劑熔點(diǎn)-3℃”以下；和

(b)將上述步驟(a)中得到的凍結(jié)后的生物親和性高分子進(jìn)行冷凍干燥的步驟。

優(yōu)選步驟(a)中，通過(guò)下述凍結(jié)處理進(jìn)行凍結(jié)，該凍結(jié)處理中，溶液內(nèi)液溫最高的部分的液溫(內(nèi)部最高液溫)在未凍結(jié)狀態(tài)下為“溶劑熔點(diǎn)-7℃“以下。

優(yōu)選生物親和性高分子的多孔體具有下述(a)和(b)所述的特性。

(a)具有81％以上且99.99％以下的孔隙率。

(b)尺寸為20～200μm的孔隙所占的空間占有率為85％以上。

優(yōu)選細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的厚度或直徑為400μm以上且3cm以下。

優(yōu)選細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體中，相對(duì)于一個(gè)細(xì)胞含有0.0000001μg以上且1μg以下的生物親和性高分子塊。

優(yōu)選生物親和性高分子為明膠、膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、基因工程合成人纖連蛋白(pronectin)、層粘連蛋白、肌腱蛋白、纖維蛋白、絲心蛋白、巢蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、重組人纖連蛋白片段(retronectin)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物、透明質(zhì)酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、軟骨素、纖維素、瓊脂糖、羧甲基纖維素、甲殼素或殼聚糖。

優(yōu)選生物親和性高分子為重組明膠。

優(yōu)選重組明膠由式：a-[(gly-x-y)n]m-b表示，

(式中，a表示任意的氨基酸或氨基酸序列，b表示任意的氨基酸或氨基酸序列，n個(gè)x各自獨(dú)立地表示任意一種氨基酸，n個(gè)y各自獨(dú)立地表示任意一種氨基酸，n表示3～100的整數(shù)，m表示2～10的整數(shù)。需要說(shuō)明的是，n個(gè)gly-x-y各自可以相同也可以不同)。

優(yōu)選重組明膠具有(1)序列號(hào)1記載的氨基酸序列、或(2)與序列號(hào)1記載的氨基酸序列具有80％以上的同源性、且具有生物親和性的氨基酸序列。

優(yōu)選細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體含有血管發(fā)生因子。

優(yōu)選細(xì)胞為選自由多潛能細(xì)胞、成體干細(xì)胞、祖細(xì)胞和成熟細(xì)胞組成的組中的細(xì)胞。

優(yōu)選細(xì)胞僅為非血管系細(xì)胞。

優(yōu)選細(xì)胞含有非血管系細(xì)胞和血管系細(xì)胞這兩者。

優(yōu)選細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體中，在細(xì)胞結(jié)構(gòu)體中具有中心部的血管系細(xì)胞的面積大于周邊部的血管系細(xì)胞的面積的區(qū)域。

優(yōu)選細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體具有中心部的血管系細(xì)胞的比例相對(duì)于血管系細(xì)胞的總面積為60％～100％的區(qū)域。

優(yōu)選細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心部的血管系細(xì)胞密度為1.0×10^-4個(gè)細(xì)胞/μm³以上的區(qū)域。

優(yōu)選在細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的內(nèi)部形成有血管。

本發(fā)明的生物親和性高分子塊優(yōu)選為了制造本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體而使用。

根據(jù)本發(fā)明，還提供一種用于制造本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的試劑，其含有本發(fā)明的生物親和性高分子塊。

根據(jù)本發(fā)明，還提供一種用于制造本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的方法，其包括將本發(fā)明的生物親和性高分子塊與至少一種細(xì)胞混合的步驟。

根據(jù)本發(fā)明，還提供一種制造生物親和性高分子的多孔體的方法，其包括：

(a)將生物親和性高分子的溶液通過(guò)凍結(jié)處理進(jìn)行凍結(jié)的步驟，該凍結(jié)處理中，溶液內(nèi)液溫最高的部分的液溫(內(nèi)部最高液溫)在未凍結(jié)狀態(tài)下為“溶劑熔點(diǎn)-3℃“以下；和

(b)將上述步驟(a)中得到的凍結(jié)后的生物親和性高分子進(jìn)行冷凍干燥的步驟。

優(yōu)選步驟(a)中，通過(guò)下述凍結(jié)處理進(jìn)行凍結(jié)，該凍結(jié)處理中，溶液內(nèi)液溫最高的部分的液溫(內(nèi)部最高液溫)在未凍結(jié)狀態(tài)下為“溶劑熔點(diǎn)-7℃”以下。

發(fā)明效果

本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體不含有戊二醛這樣的具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，由此，能夠用于細(xì)胞移植治療，并且可抑制結(jié)構(gòu)體中的移植后的細(xì)胞壞死，細(xì)胞存活率優(yōu)異。

附圖說(shuō)明

圖1示出了體外atp分析中的不同塊的差異。

圖2示出了使用本發(fā)明的塊或比較用塊的hmsc嵌合細(xì)胞塊中的細(xì)胞的存活狀態(tài)的差異(2周后)。

圖3示出了本發(fā)明的塊群中的移植細(xì)胞的存活狀態(tài)。該圖示出了hmsc嵌合細(xì)胞塊中的存活和塊尺寸所帶來(lái)的差異。

圖4示出了移植2周后的hmsc嵌合細(xì)胞塊中的血管形成。

圖5示出了移植2周后的hmsc+hecfc嵌合細(xì)胞塊中的血管形成。

圖6示出了多孔體中的各孔隙尺寸的空間占有率。

圖7示出了cbe3多孔體的he截面圖像、孔形狀和內(nèi)部最高液溫。

圖8示出了擱板溫度-40℃(玻璃板2.2mm)下的內(nèi)部最高液溫的時(shí)間變化。

具體實(shí)施方式

以下，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體為含有不含戊二醛的生物親和性高分子塊和至少一種細(xì)胞、且在多個(gè)細(xì)胞間的間隙內(nèi)配置有多個(gè)生物親和性高分子塊的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，上述生物親和性高分子塊的振實(shí)密度為10mg/cm³以上且500mg/cm³以下、或者上述高分子塊的二維截面像的截面積的平方根÷周長(zhǎng)的值為0.01以上且0.13以下。

(1)生物親和性高分子塊

(1-1)生物親和性高分子

本發(fā)明中使用的生物親和性高分子只要對(duì)生物體具有親和性，則對(duì)于是否在生物體內(nèi)分解沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選由生物分解性材料構(gòu)成。作為非生物分解性材料，具體而言為選自聚四氟乙烯(ptfe)、聚氨酯、聚丙烯、聚酯、氯乙烯、聚碳酸酯、丙烯酸、不銹鋼、鈦、有機(jī)硅和mpc(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰膽堿)的組中的至少一種材料。作為生物分解性材料，具體而言為選自多肽(例如，以下說(shuō)明的明膠等)、聚乳酸、聚乙醇酸、乳酸-乙醇酸共聚物(plga)、透明質(zhì)酸、糖胺聚糖、蛋白聚糖、軟骨素、纖維素、瓊脂糖、羧甲基纖維素、甲殼素和殼聚糖的組中的至少一種材料。上述中，特別優(yōu)選多肽。需要說(shuō)明的是，這些高分子材料可以進(jìn)行了用于提高細(xì)胞粘附性的設(shè)計(jì)，作為具體的方法，可以利用如下方法：1.“利用細(xì)胞粘附基質(zhì)(纖連蛋白、玻連蛋白、層粘連蛋白)、細(xì)胞粘附序列(利用氨基酸單字母表示法表示的rgd序列、ldv序列、redv序列、yigsr序列、pdsgr序列、ryvvlpr序列、lgtipg序列、rniaeiikdi序列、ikvav序列、lre序列、dgea序列及hav序列)肽對(duì)基材表面進(jìn)行包覆”、2.“基材表面的氨基化、陽(yáng)離子化”、3.“利用等離子體處理、電暈放電對(duì)基材表面進(jìn)行親水性處理”。

關(guān)于多肽的種類，只要具有生物親和性則沒(méi)有特別限定，例如，優(yōu)選為明膠、膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、基因工程合成人纖連蛋白、層粘連蛋白、肌腱蛋白、纖維蛋白、絲心蛋白、巢蛋白、血小板反應(yīng)蛋白、重組人纖連蛋白片段，最優(yōu)選為明膠、膠原蛋白、去端膠原蛋白(atelocollagen)。作為本發(fā)明中使用的明膠，優(yōu)選天然明膠或重組明膠。進(jìn)一步優(yōu)選為重組明膠。在此所述的天然明膠是指利用來(lái)自于天然的膠原蛋白制作的明膠。關(guān)于重組明膠，在本說(shuō)明書(shū)中如后所述。

本發(fā)明中使用的生物親和性高分子的親水性值“1/iob”值優(yōu)選為0～1.0。更優(yōu)選為0～0.6，進(jìn)一步優(yōu)選為0～0.4。iob是以藤田穆提出的表示有機(jī)化合物的極性/非極性的有機(jī)概念圖為基礎(chǔ)的親疏水性的指標(biāo)，其詳細(xì)內(nèi)容例如在“pharmaceuticalbulletin”,vol.2,2,pp.163-173(1954)；“化學(xué)的領(lǐng)域”vol.11,10,pp.719-725(1957)；“fragrancejournal”,vol.50,pp.79-82(1981)等中進(jìn)行了說(shuō)明。簡(jiǎn)言之，是將甲烷(ch4)作為所有有機(jī)化合物的根源，將其他化合物全部視為甲烷的衍生物，對(duì)其碳原子數(shù)、取代基、修飾部、環(huán)等分別設(shè)定一定的數(shù)值，將其得分相加，求出有機(jī)性值(ov)、無(wú)機(jī)性值(iv)，將該值繪制在以有機(jī)性值為x軸、無(wú)機(jī)性值為y軸的圖上而得到的圖。有機(jī)概念圖中的iob是指有機(jī)概念圖中的無(wú)機(jī)性值(iv)與有機(jī)性值(ov)之比、即“無(wú)機(jī)性值(iv)/有機(jī)性值(ov)”。關(guān)于有機(jī)概念圖的詳細(xì)內(nèi)容，請(qǐng)參照《新版有機(jī)概念圖-基礎(chǔ)與應(yīng)用》(甲田善生等著、三共出版、2008)。本說(shuō)明書(shū)中，使用取iob的倒數(shù)而得到的“1/iob”值來(lái)表示親疏水性?！?/iob”值越小(越接近于0)，表示越為親水性。

通過(guò)使本發(fā)明中使用的高分子的“1/iob”值為上述范圍，親水性升高，且吸水性升高，因此，推測(cè)其對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的保持產(chǎn)生有效作用，結(jié)果，有助于本發(fā)明的細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體(嵌合細(xì)胞塊)中的細(xì)胞的穩(wěn)定化、易存活性。

在本發(fā)明中使用的生物親和性高分子為多肽的情況下，對(duì)于以總平均親水性(grandaverageofhydropathicity，gravy)值表示的親疏水性指標(biāo)而言，優(yōu)選為0.3以下且-9.0以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.0以下且-7.0以上。總平均親水性(gravy)值可以通過(guò)“gasteigere.,hooglandc.,gattikera.,duvauds.,wilkinsm.r.,appelr.d.,bairocha.；proteinidentificationandanalysistoolsontheexpasyserver；(in)johnm.walker(ed):theproteomicsprotocolshandbook,humanapress(2005).pp.571-607”及“gasteigere.,gattikera.,hooglandc.,ivanyii.,appelr.d.,bairocha.；expasy:theproteomicsserverforin-depthproteinknowledgeandanalysis.；nucleicacidsres.31:3784-3788(2003).”的方法得到。

通過(guò)使本發(fā)明中使用的高分子的gravy值為上述范圍，親水性升高，且吸水性升高，因此，推測(cè)其對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的保持產(chǎn)生有效作用，結(jié)果，有助于本發(fā)明的細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體(嵌合細(xì)胞塊；形成嵌合狀的細(xì)胞塊)中的細(xì)胞的穩(wěn)定化、易存活性。

(1-2)交聯(lián)

本發(fā)明中使用的生物親和性高分子可以進(jìn)行了交聯(lián)，也可以未進(jìn)行交聯(lián)，但優(yōu)選進(jìn)行了交聯(lián)。作為一般的交聯(lián)方法，已知有熱交聯(lián)、利用醛類(例如，甲醛、戊二醛等)的交聯(lián)、利用縮合劑(碳二亞胺、氨基氰等)的交聯(lián)、酶交聯(lián)、光交聯(lián)、紫外線交聯(lián)、疏水性相互作用、氫鍵、離子性相互作用等，本發(fā)明中使用不使用戊二醛的交聯(lián)方法。本發(fā)明中，優(yōu)選使用不使用醛類或縮合劑的交聯(lián)方法。作為本發(fā)明中使用的交聯(lián)方法，進(jìn)一步優(yōu)選為熱交聯(lián)、紫外線交聯(lián)或酶交聯(lián)，特別優(yōu)選為熱交聯(lián)。

在利用酶進(jìn)行交聯(lián)的情況下，作為酶，只要具有高分子材料間的交聯(lián)作用則沒(méi)有特別限定，可以優(yōu)選使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和漆酶、最優(yōu)選使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進(jìn)行交聯(lián)。作為使用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進(jìn)行酶交聯(lián)的蛋白質(zhì)的具體例，只要是具有賴氨酸殘基和谷氨酰胺殘基的蛋白質(zhì)，則沒(méi)有特別限制。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶可以來(lái)源于哺乳類，也可以來(lái)源于微生物，具體而言，可以列舉味之素株式會(huì)社制造的activa系列；以試劑形式銷售的來(lái)源于哺乳類的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶，例如東方酵母工業(yè)株式會(huì)社、upstateusainc.、biodesigninternational等制造的來(lái)源于豚鼠肝臟的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、來(lái)源于山羊的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、來(lái)源于兔的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶等；來(lái)源于人的凝血因子(xiiia因子、haematologictechnologies,inc.)等。

關(guān)于進(jìn)行不使用交聯(lián)劑的交聯(lián)(例如，熱交聯(lián))時(shí)的反應(yīng)溫度，只要能夠交聯(lián)則沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為-100℃～500℃，更優(yōu)選為0℃～300℃，進(jìn)一步優(yōu)選為50℃～300℃，進(jìn)一步優(yōu)選為100℃～250℃，進(jìn)一步優(yōu)選為120℃～200℃。

(1-3)重組明膠

本發(fā)明涉及的重組明膠是指利用基因重組技術(shù)制作的具有類似于明膠的氨基酸序列的多肽或蛋白樣物質(zhì)。本發(fā)明中可以使用的重組明膠優(yōu)選具有特征性地見(jiàn)于膠原蛋白的由gly-x-y表示的序列(x和y各自獨(dú)立地表示任意一種氨基酸)的重復(fù)(多個(gè)gly-x-y各自可以相同也可以不同)。優(yōu)選在一分子中含有2個(gè)序列以上的細(xì)胞粘附信號(hào)。作為本發(fā)明中使用的重組明膠，可以使用具有來(lái)源于膠原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重組明膠，例如可以使用ep1014176、us6992172、wo2004/85473、wo2008/103041等記載的重組明膠，但并不限定于這些。作為本發(fā)明中使用的重組明膠，優(yōu)選為下述方式的重組明膠。

本發(fā)明中使用的重組明膠具有天然明膠本來(lái)的性能，因此生物適合性優(yōu)異，且由于其并非天然來(lái)源，因此不存在牛海綿狀腦病(bse)等的擔(dān)憂，非感染性優(yōu)異。另外，本發(fā)明中使用的重組明膠比天然明膠更均勻，且序列是確定的，因此，在強(qiáng)度、分解性方面，也可以通過(guò)后述的交聯(lián)等而偏差小地進(jìn)行精密設(shè)計(jì)。

重組明膠的分子量?jī)?yōu)選為2kda以上且100kda以下。更優(yōu)選為2.5kda以上且95kda以下。更優(yōu)選為5kda以上且90kda以下。最優(yōu)選為10kda以上且90kda以下。

重組明膠具有特征性地見(jiàn)于膠原蛋白的由gly-x-y表示的序列的重復(fù)。在此，多個(gè)gly-x-y各自可以相同也可以不同。gly-x-y中，gly表示甘氨酸，x和y表示任意的氨基酸(優(yōu)選為甘氨酸以外的任意氨基酸)。特征性地見(jiàn)于膠原蛋白的gxy序列是明膠/膠原蛋白的氨基酸組成和序列中的、與其他蛋白質(zhì)相比非常特異的部分結(jié)構(gòu)。該部分中，甘氨酸約占全體的三分之一，在氨基酸序列中在每3個(gè)氨基酸中重復(fù)出現(xiàn)1個(gè)甘氨酸。甘氨酸是最簡(jiǎn)單的氨基酸，對(duì)分子鏈配置的約束也少，大大有助于凝膠化時(shí)的螺旋結(jié)構(gòu)的再生。由x、y表示的氨基酸多含有亞氨酸(脯氨酸、羥脯氨酸)，優(yōu)選占全體的10％～45％。優(yōu)選其序列的80％以上、更優(yōu)選95％以上、最優(yōu)選99％以上的氨基酸為gxy的重復(fù)結(jié)構(gòu)。

通常的明膠中，極性氨基酸中的帶有電荷的極性氨基酸與無(wú)電荷的極性氨基酸以1:1的比例存在。在此，極性氨基酸具體是指半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、精氨酸，其中，極性無(wú)電荷氨基酸是指半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。本發(fā)明中使用的重組肽中，構(gòu)成的全部氨基酸中的極性氨基酸的比例為10～40％，優(yōu)選為20～30％。并且，優(yōu)選該極性氨基酸中的無(wú)電荷氨基酸的比例為5％以上且小于20％，優(yōu)選小于10％。此外，優(yōu)選在序列中不含有絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、半胱氨酸中的任意一種氨基酸、優(yōu)選兩種以上的氨基酸。

通常，在多肽中，已知有作為細(xì)胞粘附信號(hào)起作用的最小氨基酸序列(例如，株式會(huì)社永井出版發(fā)行的“病態(tài)生理”vol.9、no.7(1990年)527頁(yè))。本發(fā)明中使用的重組明膠優(yōu)選在一分子中具有2個(gè)以上這樣的細(xì)胞粘附信號(hào)。作為具體的序列，從所粘附的細(xì)胞的種類多的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為由氨基酸單字母表示法表示的rgd序列、ldv序列、redv序列、yigsr序列、pdsgr序列、ryvvlpr序列、lgtipg序列、rniaeiikdi序列、ikvav序列、lre序列、dgea序列及hav序列的序列，進(jìn)一步優(yōu)選為rgd序列、yigsr序列、pdsgr序列、lgtipg序列、ikvav序列及hav序列，特別優(yōu)選為rgd序列。rgd序列中，優(yōu)選為ergd序列。通過(guò)使用具有細(xì)胞粘附信號(hào)的重組明膠，能夠提高細(xì)胞的基質(zhì)產(chǎn)生量。例如，在使用間充質(zhì)干細(xì)胞作為細(xì)胞的軟骨分化的情況下，能夠提高糖胺聚糖(gag)的產(chǎn)生。

作為本發(fā)明中使用的重組明膠中的rgd序列的配置，優(yōu)選rgd間的氨基酸數(shù)在0～100之間、優(yōu)選在25～60之間不均一。

從細(xì)胞粘附、增殖性的觀點(diǎn)出發(fā)，該最小氨基酸序列的含量在1分子蛋白質(zhì)中優(yōu)選為3～50個(gè)，進(jìn)一步優(yōu)選為4～30個(gè)，特別優(yōu)選為5～20個(gè)。最優(yōu)選為12個(gè)。

本發(fā)明中使用的重組明膠中，rgd基序相對(duì)于氨基酸總數(shù)的比例優(yōu)選為至少0.4％，在重組明膠含有350個(gè)以上氨基酸的情況下，優(yōu)選350個(gè)氨基酸的各段(stretch)含有至少1個(gè)rgd基序。rgd基序相對(duì)于氨基酸總數(shù)的比例更優(yōu)選為至少0.6％，更優(yōu)選為至少0.8％，更優(yōu)選為至少1.0％，更優(yōu)選為至少1.2％，最優(yōu)選為至少1.5％。重組肽內(nèi)的rgd基序的數(shù)量在每250個(gè)氨基酸中優(yōu)選至少為4，更優(yōu)選為6，更優(yōu)選為8，更優(yōu)選為12以上且16以下。rgd基序的0.4％這樣的比例對(duì)應(yīng)于每250個(gè)氨基酸中至少存在1個(gè)rgd序列。由于rgd基序的數(shù)量為整數(shù)，因此為了滿足0.4％的特征，由251個(gè)氨基酸構(gòu)成的明膠必須至少含有2個(gè)rgd序列。優(yōu)選本發(fā)明的重組明膠在每250個(gè)氨基酸中至少含有2個(gè)rgd序列，更優(yōu)選在每250個(gè)氨基酸中至少含有3個(gè)rgd序列，進(jìn)一步優(yōu)選在每250個(gè)氨基酸中至少含有4個(gè)rgd序列。作為本發(fā)明的重組明膠的進(jìn)一步的方式，含有至少4個(gè)rgd基序，優(yōu)選含有6個(gè)、更優(yōu)選含有8個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選含有12個(gè)以上且16個(gè)以下的rgd基序。

另外，重組明膠可以部分發(fā)生了水解。

優(yōu)選本發(fā)明中使用的重組明膠由式：a-[(gly-x-y)n]m-b表示。n個(gè)x各自獨(dú)立地表示任意一種氨基酸，n個(gè)y各自獨(dú)立地表示任意一種氨基酸。作為m，優(yōu)選為2～10，優(yōu)選為3～5。n優(yōu)選為3～100，進(jìn)一步優(yōu)選為15～70，最優(yōu)選為50～65。a表示任意的氨基酸或氨基酸序列，b表示任意的氨基酸或氨基酸序列，n個(gè)x各自獨(dú)立地表示任意一種氨基酸，n個(gè)y各自獨(dú)立地表示任意一種氨基酸。

更優(yōu)選本發(fā)明中使用的重組明膠由式：gly-ala-pro-[(gly-x-y)63]3-gly(式中，63個(gè)x各自獨(dú)立地表示任意一種氨基酸，63個(gè)y各自獨(dú)立地表示任意一種氨基酸。需要說(shuō)明的是，63個(gè)gly-x-y各自可以相同也可以不同)表示。

重復(fù)單元優(yōu)選結(jié)合天然存在的膠原蛋白的多個(gè)序列單元。在此所述的天然存在的膠原蛋白只要是天然存在的膠原蛋白，則可以為任意一種膠原蛋白，但優(yōu)選為i型、ii型、iii型、iv型和v型。更優(yōu)選為i型、ii型、iii型。根據(jù)另一方式，該膠原蛋白的來(lái)源優(yōu)選為人、牛、豬、小鼠、大鼠。更優(yōu)選為人。

本發(fā)明中使用的重組明膠的等電點(diǎn)優(yōu)選為5～10，更優(yōu)選為6～10，進(jìn)一步優(yōu)選為7～9.5。

優(yōu)選重組明膠未進(jìn)行去氨基化。

優(yōu)選重組明膠不具有端肽。

優(yōu)選重組明膠為利用編碼天然膠原蛋白的核酸制備而成的實(shí)質(zhì)上為純的膠原蛋白用材料。

作為本發(fā)明中使用的重組明膠，特別優(yōu)選為具有如下序列的重組明膠，

(1)序列號(hào)1記載的氨基酸序列；或

(2)與序列號(hào)1記載的氨基酸序列具有80％以上(進(jìn)一步優(yōu)選為90％以上、最優(yōu)選為95％以上)的同源性、且具有生物親和性的氨基酸序列。

本發(fā)明中使用的重組明膠可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的基因重組技術(shù)來(lái)制造，例如可以依照ep1014176a2、us6992172、wo2004-85473、wo2008/103041等記載的方法來(lái)制造。具體而言，獲得編碼規(guī)定的重組明膠的氨基酸序列的基因，將該基因整合到表達(dá)載體中，制作重組表達(dá)載體，將該載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗髦?，制作轉(zhuǎn)化體。將所得到的轉(zhuǎn)化體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)，由此產(chǎn)生重組明膠，因此從培養(yǎng)物中回收所產(chǎn)生的重組明膠，由此能夠制備本發(fā)明中使用的重組明膠。

(1-4)生物親和性高分子塊

本發(fā)明中，使用含有上述生物親和性高分子的塊。

本發(fā)明中的生物親和性高分子塊的形狀沒(méi)有特別限定，其滿足振實(shí)密度為10mg/cm³以上且500mg/cm³以下、或者上述生物親和性高分子塊的二維截面像的截面積的平方根÷周長(zhǎng)的值為0.01以上且0.13以下中的一個(gè)以上的條件。

本發(fā)明中的生物親和性高分子塊的振實(shí)密度為10mg/cm³以上且500mg/cm³以下，優(yōu)選為20mg/cm³以上且400mg/cm³以下，更優(yōu)選為40mg/cm³以上且220mg/cm³以下，進(jìn)一步優(yōu)選為50mg/cm³以上且150mg/cm³以下。

振實(shí)密度是表示在一定的體積內(nèi)能夠密實(shí)地填充多少數(shù)量的塊的值，值越小，可知越無(wú)法密實(shí)地填充，即塊的結(jié)構(gòu)越復(fù)雜。認(rèn)為生物親和性高分子塊的振實(shí)密度表示生物親和性高分子塊的表面結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、以及將生物親和性高分子塊集聚為集合體時(shí)所形成的空隙的量。振實(shí)密度越小，高分子塊間的空隙越多，細(xì)胞的成活區(qū)域越多。另外，通過(guò)不使振實(shí)密度過(guò)小，能夠在細(xì)胞彼此之間適度地存在生物親和性高分子塊，在形成細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體時(shí)能夠?qū)I(yíng)養(yǎng)成分送達(dá)該結(jié)構(gòu)體內(nèi)部，因此認(rèn)為限制在上述范圍內(nèi)是適當(dāng)?shù)摹?/p>

本說(shuō)明書(shū)中所述的振實(shí)密度可以如下測(cè)定。準(zhǔn)備用于測(cè)定的(直徑6mm、長(zhǎng)度21.8mm的圓筒狀，容量0.616cm³)容器(以下記載為蓋)。首先，僅測(cè)定蓋的質(zhì)量。然后，在蓋上安裝漏斗，從漏斗倒入塊使得塊存留在蓋內(nèi)。裝入足夠量的塊之后，將蓋部分在桌子等硬處叩擊200次，取下漏斗，用藥鏟攤平。在該蓋中滿滿攤平的狀態(tài)下測(cè)定質(zhì)量。由該質(zhì)量與蓋單獨(dú)的質(zhì)量之差計(jì)算出塊單獨(dú)的質(zhì)量，除以蓋的體積，由此可以求出振實(shí)密度。

本發(fā)明中的一個(gè)生物親和性高分子塊的大小優(yōu)選為20μm以上且200μm以下。更優(yōu)選為20μm以上且120μm以下，進(jìn)一步優(yōu)選為50μm以上且120μm以下。

優(yōu)選生物親和性高分子塊的振實(shí)密度為10mg/cm³以上且400mg/cm³以下，并且一個(gè)高分子塊的大小為20μm以上且120μm以下。

本發(fā)明中的生物親和性高分子塊的“截面積的平方根÷周長(zhǎng)”為0.01以上且0.13以下，優(yōu)選為0.02以上且0.12以下，更優(yōu)選為0.03以上且0.115以下，進(jìn)一步優(yōu)選為0.05以上且0.09以下。

認(rèn)為生物親和性高分子塊的“截面積的平方根÷周長(zhǎng)”與振實(shí)密度同樣地表示生物親和性高分子塊的表面結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、以及將高分子塊集聚為集合體時(shí)所形成的空隙的量?！敖孛娣e的平方根÷周長(zhǎng)”越小，生物親和性高分子塊間的空隙越多，細(xì)胞的成活區(qū)域越多。另外，通過(guò)不使其過(guò)小，能夠在細(xì)胞彼此之間適度地存在生物親和性高分子塊，在形成細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體時(shí)能夠?qū)I(yíng)養(yǎng)成分送達(dá)該結(jié)構(gòu)體內(nèi)部，因此認(rèn)為限制為上述范圍是適當(dāng)?shù)摹?/p>

生物親和性高分子塊的二維截面像的“面積的平方根÷周長(zhǎng)”可以通過(guò)制作生物親和性高分子塊的截面標(biāo)本、并確認(rèn)截面結(jié)構(gòu)來(lái)求出。例如，首先，以薄切標(biāo)本(例如he染色標(biāo)本)的方式準(zhǔn)備生物親和性高分子塊的截面結(jié)構(gòu)。此時(shí)，可以僅觀察生物親和性高分子塊的截面結(jié)構(gòu)，也可以形成包含生物親和性高分子塊和細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體來(lái)觀察截面結(jié)構(gòu)。對(duì)于一個(gè)生物親和性高分子塊，求出其截面積和周長(zhǎng)，然后，計(jì)算出“截面積的平方根÷周長(zhǎng)”。在10處以上的多處測(cè)量上述值，求出它們的平均值，由此可以得到“截面積的平方根÷周長(zhǎng)”。

本發(fā)明中的一個(gè)生物親和性高分子塊的大小沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為20μm以上且200μm以下，更優(yōu)選為50μm以上且120μm以下。通過(guò)使一個(gè)生物親和性高分子塊的大小在上述范圍內(nèi)，能夠?qū)崿F(xiàn)更優(yōu)異的細(xì)胞存活率。需要說(shuō)明的是，一個(gè)生物親和性高分子塊的大小不是指多個(gè)生物親和性高分子塊的大小的平均值在上述范圍內(nèi)，而是指將多個(gè)生物親和性高分子塊過(guò)篩而得到的各個(gè)生物親和性高分子塊的尺寸。

本發(fā)明中的生物親和性高分子塊的交聯(lián)度沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為6以上，進(jìn)一步優(yōu)選為6以上且30以下，進(jìn)一步優(yōu)選為6以上且25以下，特別優(yōu)選為8以上且22以下。

高分子塊的交聯(lián)度(每一分子的交聯(lián)數(shù))的測(cè)定方法沒(méi)有特別限定，例如，可以通過(guò)后述實(shí)施例記載的tnbs(2,4,6-三硝基苯磺酸)法來(lái)測(cè)定。具體而言，可以分別制備將高分子塊、nahco3水溶液和tnbs水溶液混合、在37℃下反應(yīng)3小時(shí)后使反應(yīng)停止而得到的樣品、以及將高分子塊、nahco3水溶液和tnbs水溶液混合后立即停止反應(yīng)而得到的空白，測(cè)定用純水稀釋后的樣品和空白的吸光度(345nm)，由下述(式1)和(式2)計(jì)算出交聯(lián)度(每一分子的交聯(lián)數(shù))。

(式1)(as-ab)/14600×v/w

(式1)表示每1g高分子塊的賴氨酸量(摩爾當(dāng)量)。

(式中，as表示樣品吸光度、ab表示空白吸光度、v表示反應(yīng)液量(g)、w表示高分子塊質(zhì)量(mg))。

(式2)1-(樣品(式1)/未交聯(lián)的高分子(式1))×34

(式2)表示每一分子的交聯(lián)數(shù)。

本發(fā)明中的生物親和性高分子塊的吸水率沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為300％以上，更優(yōu)選為400％以上，進(jìn)一步優(yōu)選為500％以上，特別優(yōu)選為700％以上，最優(yōu)選為800％以上。需要說(shuō)明的是，吸水率的上限沒(méi)有特別限定，但通常為4000％以下或2000％以下。

生物親和性高分子塊的吸水率的測(cè)定方法沒(méi)有特別限定，例如，可以通過(guò)后述實(shí)施例記載的方法來(lái)測(cè)定。具體而言，可以在25℃下在3cm×3cm的尼龍網(wǎng)制的袋中填充約15mg的生物親和性高分子塊，在離子交換水中溶脹2小時(shí)后，風(fēng)干10分鐘，在各階段測(cè)定質(zhì)量，根據(jù)(式3)求出吸水率。

(式3)

吸水率＝(w2-w1-w0)/w0

(式中，w0表示吸水前的材料的質(zhì)量、w1表示吸水后的空袋的質(zhì)量、w2表示包括吸水后的材料在內(nèi)的袋整體的質(zhì)量)。

(1-5)生物親和性高分子塊的制造方法

關(guān)于生物親和性高分子塊的制造方法，只要能夠得到滿足上述(1-4)記載的條件的生物親和性高分子塊，則沒(méi)有特別限定，例如，可以通過(guò)將生物親和性高分子的多孔體使用粉碎機(jī)(newpowermill等)進(jìn)行粉碎來(lái)得到滿足上述(1-4)記載的條件的生物親和性高分子塊。

在準(zhǔn)備優(yōu)選為1mm見(jiàn)方的材料作為本發(fā)明中的“多孔體”的情況下，可以使用如下材料：該材料的主體內(nèi)部具有多個(gè)“10μm以上且500μm以下的孔隙”，并且在其主體中孔隙所占的體積為50％以上。這些材料中，上述內(nèi)部的孔隙可以互相連通，也可以有一部分或全部孔隙開(kāi)口于材料表面。

在制造生物親和性高分子的多孔體時(shí)，通過(guò)包括溶液內(nèi)液溫最高的部分的液溫(內(nèi)部最高液溫)在未凍結(jié)狀態(tài)下為“溶劑熔點(diǎn)-3℃”以下的凍結(jié)步驟，使所形成的冰為球狀。通過(guò)經(jīng)過(guò)該步驟對(duì)該冰進(jìn)行干燥，得到具有球狀的各向同性的孔隙(球孔)的多孔體。在不包括溶液內(nèi)液溫最高的部分的液溫(內(nèi)部最高液溫)在未凍結(jié)狀態(tài)下為“溶劑熔點(diǎn)-3℃”以上的凍結(jié)步驟的情況下進(jìn)行凍結(jié)，由此所形成的冰為柱狀/平板狀。經(jīng)過(guò)該步驟對(duì)該冰進(jìn)行干燥時(shí)，得到具有在一個(gè)軸或兩個(gè)軸上長(zhǎng)的柱狀或平板狀的孔隙(柱孔/平板孔)的多孔體。

本發(fā)明中，多孔體所具有的孔隙的形狀相較于柱孔/平板孔更優(yōu)選為球孔，另外，孔隙中球孔所占的比例進(jìn)一步優(yōu)選為50％以上。

本發(fā)明中，可以優(yōu)選通過(guò)包括下述步驟的方法來(lái)制造生物親和性高分子的多孔體，

(a)將生物親和性高分子的溶液通過(guò)凍結(jié)處理進(jìn)行凍結(jié)的步驟，該凍結(jié)處理中，溶液內(nèi)液溫最高的部分的液溫(內(nèi)部最高液溫)在未凍結(jié)狀態(tài)下為“溶劑熔點(diǎn)-3℃”以下；和

(b)將上述步驟(a)中得到的凍結(jié)后的生物親和性高分子進(jìn)行冷凍干燥的步驟。

這是因?yàn)?，根?jù)上述步驟，能夠使孔隙中球孔所占的比例為50％以上。

更優(yōu)選上述步驟(a)中，可以通過(guò)下述凍結(jié)處理進(jìn)行凍結(jié)，該凍結(jié)處理中，溶液內(nèi)液溫最高的部分的液溫(內(nèi)部最高液溫)在未凍結(jié)狀態(tài)下為“溶劑熔點(diǎn)-7℃”以下。這是因?yàn)?，根?jù)該步驟，能夠使孔隙中球孔所占的比例為80％以上。

多孔體所具有的孔隙的平均孔隙尺寸由該多孔體的截面結(jié)構(gòu)觀察而得到。首先，以薄切標(biāo)本(例如he染色標(biāo)本)的方式準(zhǔn)備多孔體的截面結(jié)構(gòu)。然后，對(duì)于由高分子形成的壁中的清楚的突起部，與最接近的突起部連接，使孔隙清楚化。測(cè)量這樣得到的劃分后的各孔隙的孔隙面積，然后，計(jì)算出將該面積進(jìn)行圓換算時(shí)的圓直徑。將所得到的圓直徑作為孔隙尺寸，可以將20個(gè)以上的平均值作為平均孔隙尺寸。

本說(shuō)明書(shū)中的某一孔隙尺寸的空間占有率是指，具有某一孔隙尺寸的孔隙在多孔體中占有多大的體積這樣的比例。具體而言，可以通過(guò)根據(jù)二維截面圖像用某一孔隙尺寸的孔隙所占的面積除以總面積而以比例的形式求出。另外，作為所使用的截面圖像，可以利用實(shí)際尺寸為1.5mm大的截面圖像。

多孔體的孔隙尺寸20μm～200μm所占的空間占有率優(yōu)選為83％以上且100％以下，更優(yōu)選為85％以上且100％以下，進(jìn)一步優(yōu)選為90％以上且100％以下，特別優(yōu)選為95％以上且100％以下。

多孔體的孔隙尺寸30μm～150μm所占的空間占有率優(yōu)選為60％以上且100％以下，更優(yōu)選為70％以上且100％以下，進(jìn)一步優(yōu)選為80％以上且100％以下，特別優(yōu)選為90％以上且100％以下。

多孔體的孔隙尺寸20μm～200μm所占的空間占有率以及多孔體的孔隙尺寸30μm～150μm所占的空間占有率表示，多孔體中的孔隙尺寸分布限制在規(guī)定的范圍內(nèi)。即，在使通過(guò)將該多孔體粉碎而得到的高分子塊為尺寸20μm～200μm大的高分子塊時(shí)，該孔隙尺寸為接近于一個(gè)高分子塊尺寸的尺寸，結(jié)果，在該孔隙尺寸的比例多的多孔體中，粉碎后的高分子塊的結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜，結(jié)果導(dǎo)致振實(shí)密度、“截面積的平方根÷周長(zhǎng)”減小。

關(guān)于孔隙的形狀，求出各孔隙的長(zhǎng)軸和短軸，由此計(jì)算出“長(zhǎng)軸÷短軸”。將“長(zhǎng)軸÷短軸”為1以上且2以下的情況作為球孔，將3以上的情況作為柱孔/平板孔。

本發(fā)明中的多孔體的孔隙率可以使用松密度(ρ)和真密度(ρc)通過(guò)孔隙率(p)＝1-ρ/ρc(％)來(lái)求出。松密度(ρ)可以由干燥質(zhì)量和體積算出，真密度(ρc)可以通過(guò)哈伯德(hubbard)型比重瓶法求出。本發(fā)明中的高分子多孔體的孔隙率優(yōu)選為81％以上且99.99％以下，更優(yōu)選為95.01％以上且99.9％以下。

(1-6)生物親和性高分子塊的用途

如本說(shuō)明書(shū)中后文所述，通過(guò)將本發(fā)明的生物親和性高分子塊與至少一種細(xì)胞混合，能夠制造本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體。即，本發(fā)明的生物親和性高分子塊作為用于制造本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的試劑有用。

(2)細(xì)胞

本發(fā)明中使用的細(xì)胞只要能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的目的、即實(shí)施細(xì)胞移植，則可以使用任意的細(xì)胞，其種類沒(méi)有特別限定。另外，所使用的細(xì)胞可以為一種，也可以將多種細(xì)胞組合使用。另外，作為所使用的細(xì)胞，優(yōu)選為動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選為脊椎動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞，特別優(yōu)選為人來(lái)源的細(xì)胞。脊椎動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞(特別是人來(lái)源的細(xì)胞)的種類可以為多潛能細(xì)胞、成體干細(xì)胞、祖細(xì)胞或成熟細(xì)胞中的任意一種。作為多潛能細(xì)胞，例如可以使用es細(xì)胞、gs細(xì)胞或ips細(xì)胞。作為成體干細(xì)胞，例如可以使用間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)、造血干細(xì)胞、羊膜細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、骨髄來(lái)源細(xì)胞、心肌干細(xì)胞、脂肪來(lái)源干細(xì)胞或神經(jīng)干細(xì)胞。作為祖細(xì)胞及成熟細(xì)胞，例如可以使用皮膚、真皮、表皮、肌肉、心肌、神經(jīng)、骨、軟骨、內(nèi)皮、腦、上皮、心臟、腎臟、肝臟、胰腺、脾臟、口腔內(nèi)、角膜、骨髄、臍帶血、羊膜或頭發(fā)來(lái)源的細(xì)胞。作為人來(lái)源的細(xì)胞，例如可以使用es細(xì)胞、ips細(xì)胞、msc、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞、成肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、β細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角膜內(nèi)皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞、羊膜細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、骨髄來(lái)源細(xì)胞或造血干細(xì)胞。另外，細(xì)胞的來(lái)源可以為自體細(xì)胞或異體細(xì)胞中的任意一種。

例如，對(duì)于重癥心力衰竭、重度心肌梗塞等心臟疾病，可以適當(dāng)使用由自體和異體摘取的心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨骼肌來(lái)源細(xì)胞(特別是衛(wèi)星細(xì)胞)、骨髄細(xì)胞(特別是分化為心肌樣細(xì)胞的骨髄細(xì)胞)等。此外，對(duì)于其他器官，也可以適當(dāng)選擇移植細(xì)胞。例如，可以列舉神經(jīng)祖細(xì)胞或可分化為神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞向腦缺血、腦梗塞部位的移植、血管內(nèi)皮細(xì)胞或可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞向心肌梗塞部位、骨骼肌缺血部位的移植等。

另外，可以列舉在針對(duì)糖尿病性器官損害的細(xì)胞移植中使用的細(xì)胞。例如，可以列舉針對(duì)腎臟、胰腺、末梢神經(jīng)、眼、四肢的血運(yùn)障礙等疾病進(jìn)行了各種研究的細(xì)胞移植治療法用的細(xì)胞。即，進(jìn)行了在胰島素分泌能力降低的胰腺中移植胰島素分泌細(xì)胞的嘗試、針對(duì)四肢的血運(yùn)障礙的骨髄來(lái)源細(xì)胞的移植等的研究，可以使用這樣的細(xì)胞。

另外，如本說(shuō)明書(shū)中后文所述，本發(fā)明中，也可以使用血管系細(xì)胞。本說(shuō)明書(shū)中，血管系細(xì)胞是指與血管形成相關(guān)的細(xì)胞，是構(gòu)成血管和血液的細(xì)胞及能夠分化為該細(xì)胞的祖細(xì)胞、成體干細(xì)胞。在此，血管系細(xì)胞中不包括es細(xì)胞、gs細(xì)胞或ips細(xì)胞等多潛能細(xì)胞以及間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)這樣的不會(huì)自然分化為構(gòu)成血管和血液的細(xì)胞的細(xì)胞。作為血管系細(xì)胞，優(yōu)選為構(gòu)成血管的細(xì)胞。脊椎動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞(特別是人來(lái)源的細(xì)胞)中，構(gòu)成血管的細(xì)胞可以優(yōu)選列舉血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞。血管內(nèi)皮細(xì)胞包括靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的任意一種。作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的祖細(xì)胞，可以使用血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。優(yōu)選為血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。構(gòu)成血液的細(xì)胞可以使用血細(xì)胞，可以使用淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等白細(xì)胞、單核細(xì)胞、作為它們的干細(xì)胞的造血干細(xì)胞。

本說(shuō)明書(shū)中，非血管系細(xì)胞是指上述血管系以外的細(xì)胞。例如，可以使用es細(xì)胞、ips細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)、心肌干細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、肝細(xì)胞或神經(jīng)細(xì)胞?？梢詢?yōu)選使用間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、心肌干細(xì)胞、心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞或ips細(xì)胞。更優(yōu)選為間充質(zhì)干細(xì)胞(msc)、心肌干細(xì)胞、心肌細(xì)胞或成肌細(xì)胞。

(3)細(xì)胞結(jié)構(gòu)體

本發(fā)明中，通過(guò)使用上述的生物親和性高分子塊和上述的細(xì)胞，在多個(gè)細(xì)胞間的間隙內(nèi)將多個(gè)該高分子塊三維配置為嵌合狀，能夠具有適合用于細(xì)胞移植的厚度，并且，通過(guò)將生物親和性高分子塊與細(xì)胞三維配置為嵌合狀，形成在結(jié)構(gòu)體中均勻存在細(xì)胞的細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體，能夠?qū)I(yíng)養(yǎng)從外部送達(dá)細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體的內(nèi)部。由此，使用本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體進(jìn)行細(xì)胞移植時(shí)，可抑制移植后的細(xì)胞的壞死，從而能夠進(jìn)行移植。需要說(shuō)明的是，在此所述的“壞死的抑制”是指與不移植本發(fā)明的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體而僅移植細(xì)胞的情況相比壞死的程度低。

本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體中，在多個(gè)細(xì)胞間的間隙內(nèi)配置有多個(gè)高分子塊，在此，“細(xì)胞間的間隙”不需要為由構(gòu)成的細(xì)胞封閉的空間，只要被細(xì)胞夾持即可。需要說(shuō)明的是，不需要在所有細(xì)胞間存在間隙，也可以存在細(xì)胞彼此接觸的部位。夾有高分子塊的細(xì)胞間的間隙的距離、即選擇某一細(xì)胞與存在于距該細(xì)胞距離最短處的細(xì)胞時(shí)的間隙距離沒(méi)有特別限制，但優(yōu)選為高分子塊的大小，適當(dāng)?shù)木嚯x也為高分子塊的適當(dāng)大小的范圍。

另外，本發(fā)明所涉及的高分子塊采用被細(xì)胞夾持的構(gòu)成，但不需要在所有高分子塊間存在細(xì)胞，也可以存在高分子塊彼此接觸的部位。夾有細(xì)胞的高分子塊間的距離、即選擇高分子塊與存在于距該高分子塊距離最短處的高分子塊時(shí)的距離沒(méi)有特別限制，但優(yōu)選為1個(gè)～數(shù)個(gè)所使用的細(xì)胞集聚時(shí)的細(xì)胞塊的大小，例如為10μm以上且1000μm以下，優(yōu)選為10μm以上且100μm以下，更優(yōu)選為10μm以上且50μm以下。

需要說(shuō)明的是，本說(shuō)明書(shū)中，使用了“在結(jié)構(gòu)體中均勻存在細(xì)胞的細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體”等“均勻存在”這樣的表現(xiàn)，但并不意味著完全的均勻，是指可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的作用效果，即能夠?qū)I(yíng)養(yǎng)從外部送達(dá)細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)體的內(nèi)部、防止移植后細(xì)胞的壞死。

本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的厚度或直徑可以設(shè)定為所期望的厚度，但作為下限，優(yōu)選為215μm以上，進(jìn)一步優(yōu)選為400μm以上，最優(yōu)選為730μm以上。厚度或直徑的上限沒(méi)有特別限定，作為使用上的通常的范圍，優(yōu)選為3cm以下，更優(yōu)選為2cm以下，進(jìn)一步優(yōu)選為1cm以下。另外，作為細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的厚度或直徑的范圍，優(yōu)選為400μm以上且3cm以下，更優(yōu)選為500μm以上且2cm以下，進(jìn)一步優(yōu)選為720μm以上且1cm以下。

本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體中，優(yōu)選由高分子塊形成的區(qū)域與由細(xì)胞形成的區(qū)域配置為嵌合狀。需要說(shuō)明的是，本說(shuō)明書(shū)中的“細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的厚度或直徑”表示如下含義。選擇細(xì)胞結(jié)構(gòu)體中的某一點(diǎn)a時(shí)，將從該點(diǎn)a通過(guò)的直線中按照與細(xì)胞結(jié)構(gòu)體外界的距離最短的方式將細(xì)胞結(jié)構(gòu)體截?cái)嗟木€段的長(zhǎng)度作為線段a。選擇細(xì)胞結(jié)構(gòu)體中該線段a最長(zhǎng)的點(diǎn)a，將此時(shí)的線段a的長(zhǎng)度作為“細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的厚度或直徑”。

另外，在使用本發(fā)明的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體作為后述的本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的制造方法中的融合前的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體、或第二高分子塊添加前的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的情況下，作為細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的厚度或直徑的范圍，優(yōu)選為10μm以上且1cm以下，更優(yōu)選為10μm以上且2000μm以下，進(jìn)一步優(yōu)選為15μm以上且1500μm以下，最優(yōu)選為20μm以上且1300μm以下。

本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體中，細(xì)胞與高分子塊的比率沒(méi)有特別限定，優(yōu)選相對(duì)于一個(gè)細(xì)胞含有的高分子塊的比率為0.0000001μg以上且1μg以下，進(jìn)一步優(yōu)選為0.000001μg以上且0.1μg以下，更優(yōu)選為0.00001μg以上且0.01μg以下，最優(yōu)選為0.00002μg以上且0.006μg以下。通過(guò)設(shè)定為上述范圍，能夠使細(xì)胞更均勻地存在。另外，通過(guò)使下限為上述范圍，能夠在用于上述用途時(shí)發(fā)揮細(xì)胞的效果，通過(guò)使上限為上述范圍，能夠?qū)⑷我獯嬖诘母叻肿訅K中的成分供給至細(xì)胞。在此，高分子塊中的成分沒(méi)有特別限制，可以列舉后述的培養(yǎng)基中含有的成分。

另外，本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體可以含有血管發(fā)生因子。在此，作為血管發(fā)生因子，可以優(yōu)選列舉堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bfgf)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hgf)等。含有血管發(fā)生因子的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的制造方法沒(méi)有特別限制，例如，可以通過(guò)使用浸滲有血管發(fā)生因子的高分子塊來(lái)制造。從促進(jìn)血管新生的觀點(diǎn)等出發(fā)，優(yōu)選本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體含有血管發(fā)生因子。

作為本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞集合體的一例，為由非血管系細(xì)胞和血管系細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞移植用細(xì)胞集合體，其滿足下述條件中的至少一個(gè)條件，

(a)具有細(xì)胞集合體的中心部的血管系細(xì)胞的面積大于周邊部的血管系細(xì)胞的面積的區(qū)域；和

(b)具有中心部的血管系細(xì)胞密度為1.0×10^-4個(gè)細(xì)胞/μm³以上的區(qū)域。

本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞集合體優(yōu)選滿足上述(a)和(b)這兩個(gè)條件，還優(yōu)選具有上述中心部的血管系細(xì)胞的比例相對(duì)于血管系細(xì)胞的總面積為60％～100％的區(qū)域。

本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體還可以適當(dāng)使用含有非血管系細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體。另外，構(gòu)成本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的細(xì)胞還可以適當(dāng)使用僅為非血管系細(xì)胞的細(xì)胞。利用僅含有非血管系細(xì)胞作為細(xì)胞的本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，在移植后，能夠在移植部位形成血管。另外，在構(gòu)成本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的細(xì)胞為兩種以上、且包含非血管系細(xì)胞和血管系細(xì)胞這兩者的情況下，與僅由非血管系細(xì)胞構(gòu)成的情況相比，能夠更好地進(jìn)行血管形成，因此優(yōu)選。

此外，在構(gòu)成本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的細(xì)胞為兩種以上、且具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心部的血管系細(xì)胞的面積大于周邊部的血管系細(xì)胞的面積的區(qū)域的情況下，能夠進(jìn)一步進(jìn)行血管形成，因此進(jìn)一步優(yōu)選。在此，具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心部的血管系細(xì)胞的面積大于周邊部的血管系細(xì)胞的面積的區(qū)域具體是指，制作任意的2μm的薄切標(biāo)本時(shí)，存在具有上述區(qū)域的標(biāo)本。在此，細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心部是指從中心至細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的表面為止的距離中的、從中心至80％距離為止的區(qū)域，細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的周邊部是指從距中心的距離為80％的部位至結(jié)構(gòu)體表面為止的區(qū)域。需要說(shuō)明的是，細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心部如下確定。

在從細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心通過(guò)的任意截面中，沿著該截面的外延使半徑為x的圓的中心移動(dòng)一周，求出將移動(dòng)的圓與截面的重復(fù)部分除去后的部分的面積為上述截面的截面積的64％的半徑x。使該半徑為x的圓的中心移動(dòng)一周，以將移動(dòng)的圓與截面的重復(fù)部分除去后的部分作為細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心部。此時(shí)，最優(yōu)選截面積最大的截面。需要說(shuō)明的是，細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心是指，在截面積最大的截面中，沿著該截面的外延使半徑為y的圓的中心移動(dòng)一周，求出將移動(dòng)的圓與截面的重復(fù)部分除去后的部分確定于一點(diǎn)的半徑y(tǒng)。使該半徑y(tǒng)的圓的中心移動(dòng)一周，以將移動(dòng)的圓與截面的重復(fù)部分除去后得到的一點(diǎn)作為細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心。在不確定于一點(diǎn)而成為線段的情況下、或者在存在多個(gè)該線段的情況下，以將各線段的長(zhǎng)度兩等分的點(diǎn)作為中心。

具體而言，優(yōu)選具有中心部的血管系細(xì)胞的比例相對(duì)于血管系細(xì)胞的總面積為60％～100％的區(qū)域，更優(yōu)選上述比例為65％～100％，進(jìn)一步優(yōu)選為80％～100％，進(jìn)一步優(yōu)選為90％～100％。需要說(shuō)明的是，在此，具有中心部的血管系細(xì)胞的比例相對(duì)于血管系細(xì)胞的總面積為60％～100％的區(qū)域具體是指，在制作任意的2μm的薄切標(biāo)本時(shí)，存在具有該比例的區(qū)域的標(biāo)本。通過(guò)為該范圍，能夠進(jìn)一步促進(jìn)血管形成。

需要說(shuō)明的是，關(guān)于中心部的血管系細(xì)胞的比例，例如，也可以通過(guò)如下方法來(lái)算出：在制作薄切標(biāo)本時(shí)，對(duì)作為測(cè)定對(duì)象的血管系細(xì)胞進(jìn)行染色，使用圖像處理軟件imagej，求出中心部的色濃度(強(qiáng)度)的平均值，計(jì)算出中心部的面積×強(qiáng)度，進(jìn)一步求出整體的色濃度(強(qiáng)度)的平均值，計(jì)算出整體的面積×強(qiáng)度，求出中心部的面積×強(qiáng)度相對(duì)于整體的面積×強(qiáng)度的比例，由此算出中心部的血管系細(xì)胞的比例。在此，對(duì)血管系細(xì)胞進(jìn)行染色的方法可以適當(dāng)使用公知的染色方法，例如，在使用人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(hecfc)作為細(xì)胞的情況下，可以使用cd31抗體。

另外，優(yōu)選具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心部的血管系細(xì)胞密度為1.0×10^-4個(gè)細(xì)胞/μm³以上的區(qū)域，更優(yōu)選在細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的整個(gè)中心部達(dá)到上述細(xì)胞密度。需要說(shuō)明的是，在此，具有1.0×10^-4個(gè)細(xì)胞/μm³以上的區(qū)域具體是指，在制作任意的2μm的薄切標(biāo)本時(shí)，存在具有該密度的區(qū)域的標(biāo)本。上述細(xì)胞密度更優(yōu)選為1.0×10^-4～1.0×10^-3個(gè)細(xì)胞/μm³，進(jìn)一步優(yōu)選為1.0×10^-4～2.0×10^-4個(gè)細(xì)胞/μm³，進(jìn)一步優(yōu)選為1.1×10^-4～1.8×10^-4個(gè)細(xì)胞/μm³，進(jìn)一步優(yōu)選為1.4×10^-4～1.8×10^-4個(gè)細(xì)胞/μm³。通過(guò)為該范圍，能夠進(jìn)一步促進(jìn)血管形成。

在此，中心部的血管系細(xì)胞密度可以通過(guò)實(shí)際計(jì)數(shù)薄切標(biāo)本的細(xì)胞數(shù)、并用細(xì)胞數(shù)除以體積來(lái)求出。在此所述的中心部如下確定。在上述的中心部沿垂直方向切取薄切標(biāo)本的厚度的量而得到的部分。細(xì)胞密度的求法如下：例如，將上述對(duì)作為測(cè)定對(duì)象的血管系細(xì)胞進(jìn)行了染色的薄切標(biāo)本與對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行了染色的薄切標(biāo)本重疊，計(jì)數(shù)重疊的細(xì)胞核的數(shù)量，由此可以算出中心部的血管系細(xì)胞數(shù)，體積通過(guò)使用imagej求出中心部的面積、并乘以該薄切標(biāo)本的厚度來(lái)求出。

需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體中，也包括使用細(xì)胞為兩種以上、且含有非血管系細(xì)胞和血管系細(xì)胞這兩者的本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體進(jìn)行了血管形成的情況。另外，在此，“細(xì)胞為兩種以上、且含有非血管系細(xì)胞和血管系細(xì)胞這兩者的本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體”的優(yōu)選范圍與上述同樣。構(gòu)建血管的方法例如可以列舉如下方法：在將血管部分掏空為隧道狀的凝膠材料上貼附混合有血管系細(xì)胞的細(xì)胞片，在隧道中流通培養(yǎng)液的同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。另外，也可以通過(guò)在細(xì)胞片之間以?shī)A心狀?yuàn)A入血管系細(xì)胞來(lái)構(gòu)建血管。

(4)細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的制造方法

本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體可以通過(guò)將本發(fā)明的生物親和性高分子塊與至少一種細(xì)胞混合來(lái)制造。更具體而言，本發(fā)明的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體可以通過(guò)將生物親和性高分子塊(由生物親和性高分子形成的塊)與細(xì)胞交替配置來(lái)制造。制造方法沒(méi)有特別限定，優(yōu)選為在形成高分子塊后接種細(xì)胞的方法。具體而言，可以通過(guò)對(duì)生物親和性高分子塊與含有細(xì)胞的培養(yǎng)液的混合物進(jìn)行孵育來(lái)制造本發(fā)明的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體。例如，在容器中，在保持于容器內(nèi)的液體中，將細(xì)胞和預(yù)先制作的生物親和性高分子塊配置為嵌合狀。優(yōu)選通過(guò)使用自然凝聚、自然落下、離心、攪拌作為配置的手段來(lái)促進(jìn)、控制由細(xì)胞和生物親和性基材形成的嵌合狀的排列形成。

作為所使用的容器，優(yōu)選由細(xì)胞低粘附性材料、細(xì)胞非粘附性材料構(gòu)成的容器，更優(yōu)選為由聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、玻璃、聚碳酸酯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯構(gòu)成的容器。容器底面的形狀優(yōu)選為平底型、u字型、v字型。

通過(guò)上述方法得到的嵌合狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)體例如可以通過(guò)下述方法制造成所期望大小的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，

(a)使分別制備的嵌合狀細(xì)胞塊彼此融合；或者

(b)在分化培養(yǎng)基或增殖培養(yǎng)基中增容；等。

融合的方法、增容的方法沒(méi)有特別限定。

例如，在對(duì)生物親和性高分子塊與含有細(xì)胞的培養(yǎng)液的混合物進(jìn)行孵育的步驟中，可以通過(guò)將培養(yǎng)基更換為分化培養(yǎng)基或增殖培養(yǎng)基來(lái)使細(xì)胞結(jié)構(gòu)體增容。優(yōu)選在對(duì)生物親和性高分子塊與含有細(xì)胞的培養(yǎng)液的混合物進(jìn)行孵育的步驟中，可以通過(guò)進(jìn)一步添加生物親和性高分子塊來(lái)制造所期望大小的在細(xì)胞結(jié)構(gòu)體中均勻存在細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體。

作為使上述分別制備的嵌合狀細(xì)胞塊彼此融合的方法，具體而言為如下的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的制造方法，該制造方法包括使多個(gè)細(xì)胞結(jié)構(gòu)體融合的步驟，該細(xì)胞結(jié)構(gòu)體含有多個(gè)生物親和性高分子塊和多個(gè)細(xì)胞，且在由上述多個(gè)細(xì)胞形成的多個(gè)間隙的一部分或全部?jī)?nèi)配置有一個(gè)或多個(gè)上述生物親和性高分子塊。

本發(fā)明的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的制造方法所涉及的“生物親和性高分子塊(種類、大小等)”、“細(xì)胞”、“細(xì)胞間的間隙”、“所得到的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體(大小等)”、“細(xì)胞與高分子塊的比率”等的優(yōu)選范圍與本說(shuō)明書(shū)中的上述同樣。

另外，優(yōu)選上述融合前的各細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的厚度或直徑為10μm以上且1cm以下，上述融合后的厚度或直徑為400μm以上且3cm以下。在此，作為上述融合前的各細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的厚度或直徑，更優(yōu)選為10μm以上且2000μm以下，進(jìn)一步優(yōu)選為15μm以上且1500μm以下，最優(yōu)選為20μm以上且1300μm以下，另外，作為上述融合后的厚度或直徑的范圍，更優(yōu)選為500μm以上且2cm以下，進(jìn)一步優(yōu)選為720μm以上且1cm以下。

上述的通過(guò)進(jìn)一步添加生物親和性高分子塊來(lái)制造所期望大小的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的方法具體而言為如下的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的制造方法，該制造方法包括如下步驟：在含有多個(gè)第一生物親和性高分子塊和多個(gè)細(xì)胞、且在由該多個(gè)細(xì)胞形成的多個(gè)間隙的一部分或全部?jī)?nèi)配置有一個(gè)或多個(gè)上述生物親和性高分子塊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體中進(jìn)一步添加第二生物親和性高分子塊，并進(jìn)行孵育。在此，“生物親和性高分子塊(種類、大小等)”、“細(xì)胞”、“細(xì)胞間的間隙”、“所得到的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體(大小等)”、“細(xì)胞與高分子塊的比率”等的優(yōu)選范圍與本說(shuō)明書(shū)中的上述同樣。

在此，優(yōu)選將想使其融合的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體之間設(shè)置為0μm以上且50μm以下的距離，更優(yōu)選為0μm以上且20μm以下、進(jìn)一步優(yōu)選為0μm以上且5μm以下的距離。使細(xì)胞結(jié)構(gòu)體彼此融合時(shí)，認(rèn)為通過(guò)細(xì)胞的增殖、伸展，細(xì)胞或細(xì)胞所產(chǎn)生的基質(zhì)發(fā)揮粘附劑的作用，從而使其接合，通過(guò)設(shè)定為上述范圍，細(xì)胞結(jié)構(gòu)體彼此的粘附變得容易。

作為通過(guò)本發(fā)明的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的制造方法得到的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的厚度或直徑的范圍，優(yōu)選為400μm以上且3cm以下，更優(yōu)選為500μm以上且2cm以下，進(jìn)一步優(yōu)選為720μm以上且1cm以下。

在細(xì)胞結(jié)構(gòu)體中進(jìn)一步添加第二生物親和性高分子塊并進(jìn)行孵育時(shí)，第二生物親和性高分子塊的添加速度優(yōu)選配合所使用的細(xì)胞的增殖速度來(lái)適當(dāng)選擇。具體而言，添加第二生物親和性高分子塊的速度快時(shí)，細(xì)胞向細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的外側(cè)移動(dòng)，細(xì)胞的均勻性降低，添加的速度慢時(shí)，形成細(xì)胞的比例增多的部位，細(xì)胞的均勻性降低，因此，要考慮所使用的細(xì)胞的增殖速度來(lái)選擇。

作為含有非血管系細(xì)胞和血管系細(xì)胞這兩者時(shí)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的制造方法，例如可以優(yōu)選列舉下述(a)～(c)的制造方法。

(a)為具有在使用非血管系細(xì)胞通過(guò)上述方法形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)體后、添加血管系細(xì)胞和生物親和性高分子塊的步驟的制造方法。在此，“添加血管系細(xì)胞和高生物親和性分子塊的步驟”包括上述的使制備的嵌合狀細(xì)胞塊彼此融合的方法、和在分化培養(yǎng)基或增殖培養(yǎng)基中增容的方法中的每一種方法。通過(guò)該方法，能夠制造(i)在細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心部非血管系細(xì)胞的面積比血管系細(xì)胞更多、在周邊部血管系細(xì)胞的面積比非血管系細(xì)胞更大的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體、(ii)細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心部的非血管系細(xì)胞的面積比周邊部的非血管系細(xì)胞的面積大的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體、(iii)細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心部的血管系細(xì)胞的面積比周邊部的血管系細(xì)胞的面積小的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體。

(b)為具有在使用血管系細(xì)胞通過(guò)上述方法形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)體后、添加非血管系細(xì)胞和生物親和性高分子塊的步驟的制造方法。在此，“添加非血管系細(xì)胞和生物親和性高分子塊的步驟”包括上述的使制備的嵌合狀細(xì)胞塊彼此融合的方法、和在分化培養(yǎng)基或增殖培養(yǎng)基中增容的方法中的每一種方法。通過(guò)該方法，能夠制造(i)在細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心部血管系細(xì)胞的面積比非血管系細(xì)胞更大、在周邊部非血管系細(xì)胞的面積比血管系細(xì)胞更大的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體、(ii)細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心部的血管系細(xì)胞的面積比周邊部的血管系細(xì)胞的面積大的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體、(iii)細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心部的非血管系細(xì)胞的面積比周邊部的非血管系細(xì)胞的面積小的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體。

(c)為實(shí)質(zhì)上同時(shí)使用非血管系細(xì)胞和血管系細(xì)胞、通過(guò)上述方法形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的制造方法。通過(guò)該方法，能夠制造在細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的任一部位非血管系細(xì)胞和血管系細(xì)胞中的任意一種都不會(huì)顯著偏在的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體。

從移植后在移植部位形成血管的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為在細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的中心部血管系細(xì)胞的面積比非血管系細(xì)胞大、在周邊部非血管系細(xì)胞的面積比血管系細(xì)胞大的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體；以及中心部的血管系細(xì)胞的面積比周邊部的血管系細(xì)胞的面積大的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，通過(guò)形成該細(xì)胞結(jié)構(gòu)體，能夠進(jìn)一步促進(jìn)血管形成。此外，該細(xì)胞結(jié)構(gòu)體中，存在于中心部的細(xì)胞數(shù)越多，越能夠進(jìn)一步促進(jìn)血管形成。

出于同樣的理由，優(yōu)選具有在利用血管系細(xì)胞形成細(xì)胞結(jié)構(gòu)體后、添加非血管系細(xì)胞和生物親和性高分子塊的步驟的制造方法。并且，進(jìn)一步優(yōu)選使血管系細(xì)胞數(shù)增多。

(5)細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的用途

本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體例如可以用于在重癥心力衰竭、重度心肌梗塞等心臟疾病、腦缺血/腦梗塞等疾病部位進(jìn)行細(xì)胞移植的目的。另外，也可以用于糖尿病性的腎臟、胰腺、末梢神經(jīng)、眼、四肢的血運(yùn)障礙等疾病。作為移植方法，可以使用切開(kāi)、注射、內(nèi)窺鏡。本發(fā)明的細(xì)胞結(jié)構(gòu)體不同于細(xì)胞片這樣的細(xì)胞移植物，能夠使結(jié)構(gòu)體的尺寸小，因此，可以實(shí)施利用注射進(jìn)行移植這樣的低創(chuàng)傷的移植方法。

另外，根據(jù)本發(fā)明，提供一種細(xì)胞移植方法。本發(fā)明的細(xì)胞移植方法的特征在于，使用上述的本發(fā)明的細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體。細(xì)胞移植用細(xì)胞結(jié)構(gòu)體的優(yōu)選范圍與上述同樣。

通過(guò)以下的實(shí)施例進(jìn)一步具體地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限定于實(shí)施例。

實(shí)施例

[實(shí)施例1]重組肽(重組明膠)

作為重組肽(重組明膠)，準(zhǔn)備如下記載的cbe(記載于wo2008-103041)。

cbe3

分子量：51.6kd

結(jié)構(gòu)：gap[(gxy)63]3g

氨基酸數(shù)：571個(gè)

rgd序列：12個(gè)

亞氨酸含量：33％

幾乎100％的氨基酸為gxy的重復(fù)結(jié)構(gòu)。cbe3的氨基酸序列中不含有絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸。cbe3具有ergd序列。

等電點(diǎn)：9.34、gravy值：-0.682、1/iob值：0.323

氨基酸序列(序列表的序列號(hào)1)(與wo2008/103041號(hào)公報(bào)的序列號(hào)3相同。但是，末尾的x修正為“p”)

gap(gapglqgapglqgmpgergaaglpgpkgergdagpkgadgapgapglqgmpgergaaglpgpkgergdagpkgadgapgkdgvrglagpigppgergaaglpgpkgergdagpkgadgapgkdgvrglagpigppgpagapgapglqgmpgergaaglpgpkgergdagpkgadgapgkdgvrglagpp)3g

[實(shí)施例2]重組肽多孔體(高分子多孔體)的制作

準(zhǔn)備厚度1mm、直徑47mm的鋁制圓筒杯狀容器。將圓筒杯的曲面作為側(cè)面時(shí)，側(cè)面由1mm的鋁封閉，底面(平板的圓形狀)也由1mm的鋁封閉。另一方面，頂面形成開(kāi)放的形狀。另外，僅在側(cè)面的內(nèi)部均勻地鋪設(shè)厚度為1mm的特氟龍(注冊(cè)商標(biāo))，結(jié)果圓筒杯的內(nèi)徑為45mm。以下，將該容器稱為圓筒形容器。

制備cbe3水溶液，將該cbe3水溶液倒入圓筒形容器中。在冷凍庫(kù)內(nèi)使用冷卻擱板從底面對(duì)cbe3水溶液進(jìn)行冷卻。此時(shí)，按照如下記載準(zhǔn)備冷卻擱板的溫度、夾在擱板與圓筒形容器之間的隔熱板(玻璃板)的厚度、所裝入的cbe3水溶液的最終濃度及水溶液量。

(1)擱板溫度-40℃、玻璃板的厚度2.2mm、cbe3水溶液的最終濃度12％、水溶液量4ml。

(2)擱板溫度-60℃、玻璃板的厚度2.2mm、cbe3水溶液的最終濃度7.5％、水溶液量4ml。

(3)擱板溫度-40℃、玻璃板的厚度2.2mm、cbe3水溶液的最終濃度4.0％、水溶液量4ml。

將這樣得到的凍結(jié)cbe3塊進(jìn)行冷凍干燥，得到cbe3多孔體。

[比較例1]重組肽單純凍結(jié)多孔體的制作

在50℃下將2000mg的cbe3溶解于18ml的超純水中，制作20ml終濃度10％的cbe3溶液。將該cbe3溶液薄薄地拉伸，制作約4mm厚的薄板狀的凝膠。關(guān)于容器，在白色的板安裝硅框架(約5cm×約10cm)，用力地按壓硅框架以消除空氣的間隙，然后向該框架內(nèi)倒入上述cbe3溶液(50℃)。倒入溶液后，移動(dòng)至4℃，使其進(jìn)行約1小時(shí)的凝膠化，確認(rèn)凝固后，移動(dòng)至-80℃，使凝膠凍結(jié)3小時(shí)。凍結(jié)后，使用冷凍干燥機(jī)(eyela、fdu-1000)進(jìn)行冷凍干燥。需要說(shuō)明的是，此時(shí)得到的冷凍干燥體為多孔體，平均孔尺寸為57.35μm。以下，將其稱為單純凍結(jié)多孔體。

[實(shí)施例3]重組肽多孔體的孔隙尺寸和空間占有率的評(píng)價(jià)

對(duì)于實(shí)施例2中得到的cbe3多孔體和比較例1中得到的單純凍結(jié)多孔體，實(shí)施多孔的孔隙尺寸和空間占有率的評(píng)價(jià)。將所得到的多孔體在160℃下進(jìn)行20小時(shí)的熱交聯(lián)，使其不溶化后，以足夠的時(shí)間在生理鹽水中溶脹。然后，使用切片機(jī)制作凍結(jié)組織切片，制作he(蘇木精-伊紅)染色標(biāo)本。由標(biāo)本準(zhǔn)備實(shí)尺度為1.5mm大的截面像，測(cè)定各孔隙面積，然后，算出將該面積進(jìn)行圓換算時(shí)的圓直徑，作為孔隙尺寸。將20個(gè)以上該孔隙的平均值作為平均孔隙尺寸。其結(jié)果，(1)為66.39μm、(2)為63.17μm、(3)為56.36μm。

基于所算出的孔隙尺寸，利用上述中使用的二維截面圖像，用某一孔隙尺寸的孔隙所占的面積除以總面積，由此以比例的形式求出空間占有率。其結(jié)果，在實(shí)施例2中得到的cbe多孔體中，就20μm～200μm的孔隙的空間占有率而言，(1)為100％、(2)為99.9％、(3)為99.9％。就30μm～150μm的孔隙的空間占有率而言，(1)為94.2％、(2)為97.9％、(3)為99.3％。

另一方面，比較例1中得到的單純凍結(jié)多孔體中，孔隙的尺寸存在顯著偏差，存在大尺寸聚集的部位和小尺寸聚集的部位。在大尺寸的部位，20μm～200μm的孔隙的空間占有率為74.3％，30μm～150μm的孔隙的空間占有率為55.8％。在小尺寸集中的部位，20μm～200μm的孔隙的空間占有率為82.8％，30μm～150μm的孔隙的空間占有率為57.2％。由于大尺寸的部位和小尺寸的部位各混合存在一半，因此，20μm～200μm的孔隙的空間占有率為78.6％，30μm～150μm的孔隙的空間占有率為56.5％(圖6)。

[實(shí)施例4]重組肽多孔體的孔隙率測(cè)定

對(duì)實(shí)施例2中得到的cbe3多孔體，測(cè)定孔隙率。測(cè)定時(shí)，測(cè)定松密度(ρ)和真密度(ρc)，求出孔隙率(p＝1-ρ/ρc(％))。cbe3多孔體的松密度(ρ)由干燥質(zhì)量和體積算出。真密度(ρc)通過(guò)哈伯德(hubbard)型比重瓶法求出。作為樣品數(shù)(n)＝4的結(jié)果可知，(3)的多孔體中松密度為0.05g/cm³、真密度為1.23g/cm³、孔隙率為96％(cv值為8％)。另外可知，(1)、(2)中的孔隙率分別為87％(cv值為10％)、92％(cv值為7％)。

[實(shí)施例5]重組肽塊的制作(多孔體的粉碎和交聯(lián))

將實(shí)施例2中得到的(1)、(2)、(3)的cbe3多孔體用newpowermill(大阪化學(xué)、newpowermillpm-2005)粉碎。粉碎通過(guò)以最大轉(zhuǎn)速1分鐘×5次、總計(jì)5分鐘的粉碎來(lái)進(jìn)行。對(duì)于所得到的粉碎物，使用不銹鋼制的篩進(jìn)行尺寸分級(jí)，得到25～53μm、53～106μm、106μm～180μm的cbe3塊。然后，在減壓下在160℃實(shí)施熱交聯(lián)(交聯(lián)時(shí)間實(shí)施24小時(shí)、48小時(shí)、56小時(shí)、60小時(shí)、72小時(shí)、84小時(shí)、96小時(shí)、120小時(shí)、288小時(shí)這9種)，得到試樣。以下，將(1)的53～106μm稱為“12％中”、將(2)的25～53μm稱為“7.5％小”、將(2)的53～106μm稱為“7.5％中”、將(2)的106～180μm稱為“7.5％大”、將(3)的53～106μm稱為“4％中”。

[比較例2]重組肽的ga(戊二醛)交聯(lián)μ塊的制作

作為專利文獻(xiàn)5記載的使用戊二醛的比較例，使用重組肽cbe3作為基材，制作不定形的ga交聯(lián)μ塊。將1000mg的cbe3溶解于9448μl的超純水中，添加1nhcl152μl后，添加400μl25％戊二醛使得終濃度為1.0％，在50℃下反應(yīng)3小時(shí)，制作交聯(lián)凝膠。將該交聯(lián)凝膠浸漬到1l的0.2m甘氨酸溶液中，在40℃振蕩2小時(shí)。然后，將交聯(lián)凝膠在5l的超純水中進(jìn)行1小時(shí)的振蕩清洗，置換為新的超純水，再次清洗1小時(shí)，重復(fù)上述操作，總計(jì)清洗6次。將清洗后的交聯(lián)凝膠在-80℃凍結(jié)5小時(shí)后，使用冷凍干燥機(jī)(eyela、fdu-1000)進(jìn)行冷凍干燥。將所得到的冷凍干燥體使用newpowermill(大阪化學(xué)、newpowermillpm-2005)粉碎。粉碎通過(guò)以最大轉(zhuǎn)速1分鐘×5次、總計(jì)5分鐘的粉碎來(lái)進(jìn)行。對(duì)于所得到的粉碎物，使用不銹鋼制的篩進(jìn)行尺寸分級(jí)，得到25～53μm的cbe3-ga交聯(lián)μ塊。

[比較例3]比較用重組肽塊的制作

作為比較例，按照如下記載制作在通過(guò)從現(xiàn)有技術(shù)(專利文獻(xiàn)5)類推而來(lái)的不含戊二醛的步驟制作時(shí)形成的比較用重組肽塊。使用重組肽cbe3作為基材來(lái)制作塊。將比較例1中得到的單純凍結(jié)多孔體使用newpowermill(大阪化學(xué)、newpowermillpm-2005)進(jìn)行粉碎。粉碎通過(guò)以最大轉(zhuǎn)速1分鐘×5次、總計(jì)5分鐘的粉碎來(lái)進(jìn)行。對(duì)于所得到的粉碎物，使用不銹鋼制的篩進(jìn)行尺寸分級(jí)，得到25～53μm的cbe3塊。將其放入160℃的烘箱，進(jìn)行72小時(shí)熱交聯(lián)。

[實(shí)施例6]重組肽塊的振實(shí)密度測(cè)定

振實(shí)密度是表示在一定的體積內(nèi)能夠密實(shí)地填充多少數(shù)量的塊的值，值越小，可以說(shuō)越無(wú)法密實(shí)地填充，即塊的結(jié)構(gòu)越復(fù)雜。振實(shí)密度如下測(cè)定。首先，準(zhǔn)備在漏斗前端帶有蓋(直徑6mm、長(zhǎng)度21.8mm的圓筒狀，容量0.616cm³)的用具，僅測(cè)定蓋的質(zhì)量。然后，將蓋安裝到漏斗上，從漏斗倒入塊使得塊存留在蓋內(nèi)。裝入足夠量的塊之后，將蓋部分在桌子等硬處叩擊200次，取下漏斗，用藥鏟攤平。在該蓋中滿滿攤平的狀態(tài)下測(cè)定質(zhì)量。由該質(zhì)量與蓋單獨(dú)的質(zhì)量之差計(jì)算出塊單獨(dú)的質(zhì)量，除以蓋的體積，由此求出振實(shí)密度。

結(jié)果，比較例3的塊為524mg/cm³。

另一方面，對(duì)于實(shí)施例5的塊而言，“12％中”為372mg/cm³、“7.5％小”為213mg/cm³、“7.5％中”為189mg/cm³、“7.5％大”為163mg/cm³、“4％中”為98mg/cm³?？芍?，實(shí)施例5的塊由于結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，振實(shí)密度相對(duì)于比較例3的塊減小。

[實(shí)施例7]重組肽塊的二維截面圖像的“面積的平方根÷周長(zhǎng)”的計(jì)算

作為表示塊的復(fù)雜性的指標(biāo)，求出塊的“面積的平方根”與“周長(zhǎng)”的關(guān)系。即，塊的“面積的平方根÷周長(zhǎng)”的值越小，可以說(shuō)越復(fù)雜。該值使用圖像分析軟件算出。首先，準(zhǔn)備可看出塊的形狀的圖像。具體而言，本實(shí)施例中，使用將在水中充分溶脹的塊群用切片機(jī)制成凍結(jié)切片、并進(jìn)行了he(蘇木精-伊紅))染色的標(biāo)本。在塊之外存在細(xì)胞等的情況下，使用photoshop利用自動(dòng)選擇工具僅提取出制劑，使得圖像上僅有塊。將該圖像使用imagej求出塊的面積和周長(zhǎng)，算出“面積的平方根÷周長(zhǎng)”的值。但是，將10μm以下的塊除去。

結(jié)果，比較例3的塊為0.139。

另一方面，對(duì)于實(shí)施例5的塊而言，“12％中”為0.112、“7.5％小”為0.083、“7.5％中”為0.082、“7.5％大”為0.071、“4％中”為0.061?？芍獙?shí)施例5的塊由于結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，“面積的平方根÷周長(zhǎng)”的值相對(duì)于比較例3的塊減小，另外，還可知上述值與振實(shí)密度存在相關(guān)。

[實(shí)施例8]重組肽塊的交聯(lián)度測(cè)定

算出實(shí)施例5和比較例3中交聯(lián)的塊的交聯(lián)度(每一分子的交聯(lián)數(shù))。測(cè)定使用tnbs(2,4,6-三硝基苯磺酸)法。

<樣品制備>

在玻璃瓶中添加樣品約10mg、4％nahco3水溶液1ml、1％的tnbs水溶液2ml，在37℃振蕩3小時(shí)。然后，加入10ml的37％鹽酸和5ml的純水后，在37℃靜置16小時(shí)以上，作為樣品。

<空白制備>

在玻璃瓶中添加樣品約10mg、4％nahco3水溶液1ml、1％tnbs水溶液2ml，之后立即加入37％鹽酸3ml，在37℃振蕩3小時(shí)。然后，加入7ml的37％鹽酸和5ml的純水后，在37℃靜置16小時(shí)以上，作為空白。

測(cè)定用純水稀釋10倍的樣品和空白的吸光度(345nm)，由下述(式1)和(式2)算出交聯(lián)度(每一分子的交聯(lián)數(shù))。

(式1)(as-ab)/14600×v/w

(式1)表示每1g重組肽的賴氨酸量(摩爾當(dāng)量)。

(式中，as表示樣品吸光度、ab表示空白吸光度、v表示反應(yīng)液量(g)、w表示重組肽質(zhì)量(mg))

(式2)1-(樣品(式1)/未交聯(lián)重組肽(式1))×34

(式2)表示每一分子的交聯(lián)數(shù)。

結(jié)果，對(duì)于實(shí)施例5的塊而言，“12％中”在48小時(shí)交聯(lián)時(shí)交聯(lián)度為12，“7.5％小”、“7.5％中”和“7.5％大”在24小時(shí)交聯(lián)時(shí)交聯(lián)度為8，“4％中”在48小時(shí)交聯(lián)時(shí)交聯(lián)度為9。另外，“7.5％中”在288小時(shí)交聯(lián)時(shí)為22。另一方面，比較例3的塊在72小時(shí)交聯(lián)時(shí)為16。

[實(shí)施例9]重組肽塊的吸水率測(cè)定

算出實(shí)施例5和比較例3中制作的塊的吸水率。

25℃下，在3cm×3cm的尼龍網(wǎng)制的袋中填充約15mg的塊，在離子交換水中溶脹2小時(shí)后，風(fēng)干10分鐘。在各階段測(cè)定質(zhì)量，根據(jù)(式3)求出吸水率。

(式3)

吸水率＝(w2-w1-w0)/w0

(式中，w0表示吸水前的材料的質(zhì)量、w1表示吸水后的空袋的質(zhì)量、w2表示包括吸水后的材料在內(nèi)的袋整體的質(zhì)量)

結(jié)果，對(duì)于實(shí)施例5的塊而言，“12％中”為304％、“7.5％小”為819％、“7.5％中”為892％、“7.5％大”為892％、“4％中”為901％。另一方面，比較例3的塊為280％。

[實(shí)施例10]使用重組肽塊的嵌合細(xì)胞塊的制作(hmsc)

將人骨髄來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hmsc)使用增殖培養(yǎng)基(寶生物：mscgmbulletkit^tm)調(diào)節(jié)成10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml，以0.1mg/ml加入實(shí)施例5中制作的cbe3塊后，將200μl接種到sumiloncell-tightx96u板(住友電木、底為u字型)中，使用臺(tái)式微孔板離心機(jī)進(jìn)行離心(600g、5分鐘)，靜置24小時(shí)，制作直徑約1mm的球狀的、由cbe3塊和hmsc細(xì)胞構(gòu)成的嵌合細(xì)胞塊(相對(duì)于一個(gè)細(xì)胞為0.001μg的塊)。需要說(shuō)明的是，由于在u字型的板中進(jìn)行制作，因此，該嵌合細(xì)胞塊為球狀。另外，對(duì)于“12％中”、“7.5％小”、“7.5％中”、“7.5％大”、“4％中”均與上述同樣制作。

[比較例4]使用比較用重組肽塊的嵌合細(xì)胞塊的制作(hmsc)

將人骨髄來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hmsc)使用增殖培養(yǎng)基(寶生物：mscgmbulletkit^tm)調(diào)節(jié)為10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml，以0.1mg/ml加入比較例3中制作的cbe3塊后，將200μl接種到sumiloncell-tightx96u板(住友電木、底為u字型)中，使用臺(tái)式微孔板離心機(jī)進(jìn)行離心(600g、5分鐘)，靜置24小時(shí)，制作直徑約1mm的球狀的、由cbe3塊和hmsc細(xì)胞構(gòu)成的嵌合細(xì)胞塊(相對(duì)于一個(gè)細(xì)胞為0.001μg的塊)。需要說(shuō)明的是，由于在u字型的板進(jìn)行制作，因此該嵌合細(xì)胞塊為球狀。

[比較例5]使用重組肽ga交聯(lián)μ塊的嵌合細(xì)胞塊的制作(hmsc)

如下制作比較用的含有戊二醛的嵌合細(xì)胞塊。將人骨髄來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hmsc)使用增殖培養(yǎng)基(寶生物：mscgmbulletkit^tm)調(diào)節(jié)為10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml，以0.1mg/ml加入比較例2中制作的ga交聯(lián)μ塊后，將200μl接種到sumiloncell-tightx96u板(住友電木、底為u字型)中，使用臺(tái)式微孔板離心機(jī)進(jìn)行離心(600g、5分鐘)，靜置24小時(shí)，制作直徑約1mm的球狀的、由ga交聯(lián)μ塊和hmsc細(xì)胞構(gòu)成的嵌合細(xì)胞塊(相對(duì)于一個(gè)細(xì)胞為0.001μg的塊)。需要說(shuō)明的是，由于在u字型的板中進(jìn)行制作，因此該嵌合細(xì)胞塊為球狀。

[實(shí)施例11]使用重組肽塊的嵌合細(xì)胞塊的制作(hmsc+hecfc)

將人血管內(nèi)皮祖細(xì)胞(hecfc)使用增殖培養(yǎng)基(lonza：egm-2+ecfc血清補(bǔ)充劑)調(diào)節(jié)為10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml，以0.05mg/ml加入實(shí)施例5中制作的cbe3塊后，將200μl接種到sumiloncell-tightx96u板中，使用臺(tái)式微孔板離心機(jī)進(jìn)行離心(600g、5分鐘)，靜置24小時(shí)，制作扁平狀的由ecfc和cbe3塊構(gòu)成的嵌合細(xì)胞塊。然后，除去培養(yǎng)基，將人骨髄來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hmsc)使用增殖培養(yǎng)基(寶生物：mscgmbulletkit^tm)調(diào)節(jié)為10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml，以達(dá)到0.1mg/ml的方式加入實(shí)施例5中制作的cbe3塊后，將存在有hecfc嵌合細(xì)胞塊的200μl接種到sumiloncell-tightx96u板中，使用臺(tái)式微孔板離心機(jī)進(jìn)行離心(600g、5分鐘)，靜置24小時(shí)，制作直徑約1mm的球狀的、由hmsc、hecfc和cbe3塊構(gòu)成的嵌合細(xì)胞塊。另外，對(duì)于“12％中”、“7.5％小”、“7.5％中”、“7.5％大”、“4％中”均與上述同樣地制作。

[實(shí)施例12]使用重組肽塊的嵌合細(xì)胞塊(hmsc)的融合

將實(shí)施例10中制作的第二天的嵌合細(xì)胞塊(使用本發(fā)明的cbe3塊)5個(gè)并列在sumiloncell-tightx96u板中，進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)。結(jié)果可知，在嵌合細(xì)胞塊彼此之間，排列在外周部的細(xì)胞發(fā)生了結(jié)合，由此使嵌合細(xì)胞塊自然地融合。另外，對(duì)于“12％中”、“7.5％小”、“7.5％中”、“7.5％大”、“4％中”均與上述同樣地制作。

[實(shí)施例13]使用重組肽塊的嵌合細(xì)胞塊(hmsc+hecfc)的融合

將實(shí)施例11中制作的第二天的嵌合細(xì)胞塊(使用本發(fā)明的cbe3塊)5個(gè)并列在sumiloncell-tightx96u板中，進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)。結(jié)果可知，在嵌合細(xì)胞塊彼此之間，排列在外周部的細(xì)胞發(fā)生了結(jié)合，由此使嵌合細(xì)胞塊自然地融合。另外，對(duì)于“12％中”、“7.5％小”、“7.5％中”、“7.5％大”、“4％中”均與上述同樣地制作。

[比較例6]使用比較用重組肽塊的嵌合細(xì)胞塊(hmsc)的融合

將比較例4中制作的第二天的嵌合細(xì)胞塊(來(lái)源于比較用的cbe3塊)5個(gè)并列在sumiloncell-tightx96u板中，進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)。結(jié)果可知，在嵌合細(xì)胞塊彼此之間，排列在外周部的細(xì)胞發(fā)生了結(jié)合，由此使嵌合細(xì)胞塊自然地融合。

[比較例7]使用重組肽ga交聯(lián)μ塊的嵌合細(xì)胞塊(hmsc)的融合

將比較例5中制作的第二天的嵌合細(xì)胞塊(來(lái)源于ga交聯(lián)μ塊)5個(gè)并列在sumiloncell-tightx96u板中，進(jìn)行24小時(shí)培養(yǎng)。結(jié)果可知，在嵌合細(xì)胞塊彼此之間，排列在外周部的細(xì)胞發(fā)生了結(jié)合，由此使嵌合細(xì)胞塊自然地融合。

[實(shí)施例14]體外atp分析

對(duì)各嵌合細(xì)胞塊中的細(xì)胞所產(chǎn)生、保持的atp(三磷酸腺苷)量進(jìn)行定量。atp已知為全體生物的能量源，通過(guò)對(duì)atp合成量、保持量進(jìn)行定量，能夠獲知細(xì)胞的代謝活性的狀態(tài)、活動(dòng)狀態(tài)。測(cè)定使用celltiter-glo(promega公司)。對(duì)于實(shí)施例10和比較例4、比較例5中制作的嵌合細(xì)胞塊，均在第7天使用celltiter-glo對(duì)各嵌合細(xì)胞塊中的atp量進(jìn)行定量。結(jié)果，與使用ga交聯(lián)μ塊的嵌合細(xì)胞塊相比，使用比較用的cbe3塊的嵌合細(xì)胞塊得到atp量少的結(jié)果。另一方面可知，使用本發(fā)明的cbe3塊的嵌合細(xì)胞塊的atp量比使用ga交聯(lián)μ塊的嵌合細(xì)胞塊的atp量多。本發(fā)明的cbe3塊在“12％中”、“7.5％小”、“7.5％中”、“7.5％大”、“4％中”的情況下均同樣地得到產(chǎn)生了比使用ga交聯(lián)μ塊的嵌合細(xì)胞塊多的atp的結(jié)果(圖1)。即可知，使用具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的本發(fā)明的cbe3塊的嵌合細(xì)胞塊的內(nèi)部細(xì)胞的存活狀態(tài)更良好。

[實(shí)施例15]使用重組肽塊的巨大嵌合細(xì)胞塊的制作

如實(shí)施例12所示，將1mm的嵌合細(xì)胞塊進(jìn)行融合，能夠制作巨大的嵌合細(xì)胞塊，但能夠一次性地制作巨大的嵌合細(xì)胞塊時(shí)可使操作簡(jiǎn)化。在此，在實(shí)施了細(xì)胞非粘附加工的sumiloncell-tight的9cm培養(yǎng)皿中加入使用增殖培養(yǎng)基(寶生物：mscgmbulletkit^tm)調(diào)節(jié)為1.5％的瓊脂糖(agaroses)溶液50ml。此時(shí)，將1cm見(jiàn)方的棒狀硅以在瓊脂糖溶液中浸漬約5mm的方式固定，在瓊脂糖凝固后，去除硅，制作成在瓊脂糖中形成有1cm見(jiàn)方的凹陷的容器。向其中加入適量增殖培養(yǎng)基，以不使凝膠干燥的方式保存。去除培養(yǎng)基，將實(shí)施例5中制作的塊中具有代表性的“7.5％中”16mg與250萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的人骨髄來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hmsc)的懸濁物添加到凹陷中，然后輕輕加入25ml的增殖培養(yǎng)基。培養(yǎng)1天后，可以制作出1cm見(jiàn)方、厚度2-3mm的巨大嵌合細(xì)胞塊。將其轉(zhuǎn)移至裝有25ml增殖培養(yǎng)基的sumiloncell-tight的9cm培養(yǎng)皿中，進(jìn)一步培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)移至裝有25ml增殖培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)燒瓶中進(jìn)行攪拌培養(yǎng)，制作培養(yǎng)7天后的嵌合細(xì)胞塊的截面的he染色標(biāo)本。結(jié)果，確認(rèn)到在培養(yǎng)7天后內(nèi)部的細(xì)胞仍存活。由此可知，通過(guò)將細(xì)胞與塊混合并倒入模具中進(jìn)行培養(yǎng)，能夠制作巨大的嵌合細(xì)胞塊。另外，該方法可用于ga交聯(lián)μ塊、比較用塊及本發(fā)明的塊中的任意一種，不依賴于塊的種類。

[實(shí)施例16]使用重組肽塊的嵌合細(xì)胞塊的移植

小鼠使用nod/scid(charlesriver)的雄性、4～6周齡的小鼠。在麻醉下將小鼠腹部的體毛除去，在上腹部的皮下形成切口，從切口插入剪刀，將皮膚從肌肉剝離后，用鑷子撈取實(shí)施例12、實(shí)施例13、比較例6和比較例7中制作的嵌合細(xì)胞塊，移植到距切口約1.5cm的靠近下腹部的皮下，將皮膚的切口部縫合。

[實(shí)施例17]使用重組肽塊的嵌合細(xì)胞塊的采集

在自移植起1周后和2周后進(jìn)行解剖。剝離腹部的皮膚，切取約1cm²的正方形大小的附著有嵌合細(xì)胞塊的皮膚。在嵌合細(xì)胞塊也附著在腹部的肌肉上的情況下，與肌肉一起采集下來(lái)。

[實(shí)施例18]標(biāo)本分析

對(duì)附著有嵌合細(xì)胞塊的皮膚片和移植前的嵌合細(xì)胞塊制作組織切片。將皮膚浸漬到4％多聚甲醛中，進(jìn)行福爾馬林固定。然后，用石蠟包埋，制作包含嵌合細(xì)胞塊的皮膚的組織切片。切片進(jìn)行he染色(蘇木精-伊紅染色)。

將移植了實(shí)施例12的“7.5％中”、比較例6和比較例7的2周后的he標(biāo)本示于圖2。圖2記載的存活率表示全部細(xì)胞數(shù)(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))中的活細(xì)胞數(shù)的比例。

可知，與使用比較例7的ga交聯(lián)μ塊的嵌合細(xì)胞塊(圖2的a：活細(xì)胞數(shù)100個(gè)；存活率80％)相比，使用比較例6的塊的嵌合細(xì)胞塊(圖2的b：活細(xì)胞數(shù)37個(gè)；存活率45％)中活細(xì)胞少。另一方面可知，使用實(shí)施例12的本發(fā)明的塊(“7.5％中”)的嵌合細(xì)胞塊(圖2的c：活細(xì)胞數(shù)116個(gè)；存活率84％)與使用比較例6的塊的嵌合細(xì)胞塊(圖2的b：活細(xì)胞數(shù)37個(gè)；存活率45％)相比，活細(xì)胞多，存活良好。該結(jié)果與實(shí)施例14中的體外分析的結(jié)果也一致，可知，通過(guò)采用本發(fā)明的塊，能夠使移植后的細(xì)胞的存活良好。

另外，將本發(fā)明的塊群中的移植細(xì)胞的存活狀態(tài)示于圖3。圖3記載的存活率表示全部細(xì)胞數(shù)(活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù))中的活細(xì)胞數(shù)的比例。

106～180μm尺寸的“7.5％大”的存活率為57％，“7.5％小”的存活率為62％，“7.5％中”的存活率為84％，“4％中”的存活率為82％。即可知，在本發(fā)明的塊群中，與106～180μm尺寸的“7.5％大”相比，“7.5％小”、“7.5％中”、“4％中”的細(xì)胞的存活更良好(圖3)。另外，由最上面的移植結(jié)果可知，“7.5％中”和“4％中”比“7.5％小”的移植細(xì)胞的存活更良好(圖3)。即可知，具有高分子塊的振實(shí)密度或高分子塊的二維截面像的截面積的平方根÷周長(zhǎng)的值在規(guī)定范圍內(nèi)的結(jié)構(gòu)是很重要的，其中，移植后的細(xì)胞存活按照“53～106μm”>“25～53μm”>“106～180μm”的順序變得良好。

另外，將移植了使用該53～106μm大小的本發(fā)明的塊的實(shí)施例12的嵌合細(xì)胞塊時(shí)的移植2周后的he標(biāo)本示于圖4。另外，對(duì)圖4中的血管數(shù)進(jìn)行測(cè)量的結(jié)果為63條/mm²。如圖4所示，還可知在嵌合細(xì)胞塊內(nèi)部誘生了血管。

此外，將移植了實(shí)施例13中使用具有代表性的“7.5％中”的含有血管系細(xì)胞的嵌合細(xì)胞塊時(shí)的移植2周后的he標(biāo)本示于圖5。對(duì)圖5中的血管數(shù)進(jìn)行測(cè)量的結(jié)果為180條/mm²。與移植了實(shí)施例12的情況相比，如圖5所示可知，在移植了實(shí)施例13的含有血管系細(xì)胞的嵌合細(xì)胞塊的情況下，在嵌合細(xì)胞塊內(nèi)部形成了更多的血管。

[實(shí)施例19]hmsc+hecfc嵌合細(xì)胞塊中的ecfc的比例和濃度的計(jì)算

對(duì)于實(shí)施例11中使用具有代表性的“7.5％中”的嵌合細(xì)胞塊，將切片使用利用dab顯色的試劑盒(dacolsab2試劑盒universalk0673dacolsab2試劑盒/hrp(dab)兔/小鼠一次抗體兩用)對(duì)hecfc染色用的cd31抗體(ept抗cd31/pecam-1)進(jìn)行免疫染色。使用圖像處理軟件imagej、利用cd31抗體的染色方法，求出中心部的hecfc(血管系細(xì)胞)的面積的比例。需要說(shuō)明的是，在此所述的“中心部”如上定義。

結(jié)果，實(shí)施例11的代表性的“7.5％中”嵌合細(xì)胞塊的中心部的hecfc(血管系細(xì)胞)的面積的比例為99％。

進(jìn)而，對(duì)實(shí)施例11的代表性的“7.5％中”嵌合細(xì)胞塊，將上述利用cd31抗體的染色與he染色(蘇木精·伊紅染色)重疊，由此算出中心部存在的hecfc的細(xì)胞密度。中心部的血管系細(xì)胞密度可以通過(guò)實(shí)際計(jì)數(shù)薄切標(biāo)本的細(xì)胞數(shù)、并用細(xì)胞數(shù)除以體積來(lái)求出。首先，使用photoshop將上述兩張圖像重疊，計(jì)數(shù)與利用cd31抗體的染色重疊的he染色的細(xì)胞核的數(shù)量，算出細(xì)胞數(shù)。另一方面，體積通過(guò)使用imagej求出中心部的面積、并乘以該薄切標(biāo)本的厚度即2μm來(lái)求出。

結(jié)果，實(shí)施例11的代表性的“7.5％中”嵌合細(xì)胞塊的中心部的hecfc(血管系細(xì)胞)的細(xì)胞數(shù)為2.58×10^-4個(gè)細(xì)胞/μm³。

[實(shí)施例20]重組肽多孔體(高分子多孔體)的制作

準(zhǔn)備厚度1mm、直徑47mm的鋁制圓筒杯狀容器。將圓筒杯的曲面作為側(cè)面時(shí)，側(cè)面由1mm的鋁封閉，底面(平板的圓形狀)也由1mm的鋁封閉。另一方面，頂面形成開(kāi)放的形狀。另外，僅在側(cè)面的內(nèi)部均勻地鋪設(shè)厚度為1mm的特氟龍(注冊(cè)商標(biāo))，結(jié)果圓筒杯的內(nèi)徑為45mm。以下，將該容器稱為圓筒形容器。

使cbe3的最終濃度為7.5質(zhì)量％，制備重組肽水溶液，將該重組肽水溶液倒入圓筒形容器中。在冷凍庫(kù)內(nèi)使用冷卻擱板從底面對(duì)重組肽水溶液進(jìn)行冷卻。此時(shí)，通過(guò)改變冷卻擱板的溫度、夾在擱板與圓筒形容器之間的隔熱板(玻璃板)的厚度、所裝入的重組肽水溶液量來(lái)改變液溫的冷卻過(guò)程。擱板溫度為-40℃、-60℃和-80℃，玻璃板為0.7mm、1.1mm和2.2mm，重組肽水溶液量為4ml、12ml和16ml，實(shí)施它們的組合。

另外，各水溶液從底面進(jìn)行冷卻，因此圓中心部的水表面溫度最難以冷卻。因此，該部分達(dá)到溶液內(nèi)溫度最高的液溫，從而測(cè)定該部分的液溫(以下，將該部分的液溫稱為內(nèi)部最高液溫)。

結(jié)果，在擱板溫度為-40℃、玻璃板為2.2mm的情況下，為如下?tīng)顟B(tài)：直至內(nèi)部最高液溫達(dá)到-9.2℃之前，溫度未開(kāi)始上升，內(nèi)部最高液溫在未凍結(jié)狀態(tài)下取“溶劑熔點(diǎn)-3℃”以下的液溫(圖8)。經(jīng)過(guò)該狀態(tài)后，在-9.2℃溫度開(kāi)始上升，可知產(chǎn)生了凝固熱(圖8)。另外還可以確認(rèn)，在該時(shí)機(jī)實(shí)際已經(jīng)開(kāi)始形成冰。然后，溫度在0℃附近經(jīng)過(guò)一定時(shí)間。在此，成為存在水與冰的混合物的狀態(tài)。最后，溫度從0℃再次開(kāi)始下降，此時(shí)，液體部分消失而成為冰(圖8)。測(cè)定的溫度為冰內(nèi)部的固體溫度。即，并不是液溫。由此可見(jiàn)，如果觀察產(chǎn)生凝固熱的瞬間的內(nèi)部最高液溫，則可知在內(nèi)部最高液溫在未凍結(jié)狀態(tài)下經(jīng)過(guò)“溶劑熔點(diǎn)-3℃”后是否發(fā)生了凍結(jié)。

對(duì)產(chǎn)生該凝固熱的瞬間的未凍結(jié)狀態(tài)下的內(nèi)部最高液溫的6種組合進(jìn)行測(cè)定，如下所示。

a擱板溫度-40℃、玻璃板2.2mm、液量4ml時(shí)為-9.2℃

b擱板溫度-40℃、玻璃板1.1mm、液量4ml時(shí)為-8.3℃

c擱板溫度-40℃、玻璃板0.7mm、液量4ml時(shí)為-2.2℃

d擱板溫度-60℃、玻璃板2.2mm、液量4ml時(shí)為-7.2℃

需要說(shuō)明的是，在此所述的d為實(shí)施例2中所述的(2)。

e擱板溫度-80℃、玻璃板2.2mm、液量4ml時(shí)為-3.9℃

f擱板溫度-80℃、玻璃板1.1mm、液量4ml時(shí)為-3.1℃

g擱板溫度-80℃、玻璃板0.7mm、液量4ml時(shí)為5.8℃

h擱板溫度-40℃、玻璃板2.2mm、液量12ml時(shí)為-6.5℃

i擱板溫度-40℃、玻璃板2.2mm、液量16ml時(shí)為-2.4℃

由此可知，a、b、d、e、f、h是利用在未凍結(jié)狀態(tài)下內(nèi)部最高液溫取“溶劑熔點(diǎn)-3℃”以下的液溫的凍結(jié)步驟的制造法(內(nèi)部最高液溫≤“溶劑熔點(diǎn)-3℃”的凍結(jié)重組肽塊)。

另外，c、g、i是利用在未凍結(jié)狀態(tài)下內(nèi)部最高液溫未取“溶劑熔點(diǎn)-3℃”以下的液溫的凍結(jié)步驟的制造法(內(nèi)部最高液溫>“溶劑熔點(diǎn)-3℃”的凍結(jié)重組肽塊)。

將這樣得到的凍結(jié)重組肽塊進(jìn)行冷凍干燥，得到cbe3多孔體。將得自a、b、d、e、f、h的稱為“內(nèi)部最高液溫≤‘溶劑熔點(diǎn)-3℃’的cbe3多孔體”，將得自c、g、i的稱為“內(nèi)部最高液溫≤‘溶劑熔點(diǎn)-3℃’的cbe3多孔體”。

[實(shí)施例21]

對(duì)實(shí)施例20中得到的cbe3多孔體，實(shí)施多孔的孔隙尺寸和孔隙形狀的評(píng)價(jià)。對(duì)所得到的多孔體實(shí)施160℃、20小時(shí)的熱交聯(lián)，使其不溶化后，以充分的時(shí)間在生理鹽水中溶脹。然后，使用切片機(jī)制作凍結(jié)組織切片，制作he(蘇木精-伊紅))染色標(biāo)本。

將所得到的標(biāo)本的中心部分的圖像示于圖7(內(nèi)部最高液溫>“溶劑熔點(diǎn)-3℃”和內(nèi)部最高液溫≤“溶劑熔點(diǎn)-3℃”)。結(jié)果，內(nèi)部最高液溫>“溶劑熔點(diǎn)-3℃”(c、g、i)時(shí)，孔隙的80％以上為柱孔/平板孔，球孔為20％以下。另一方面，內(nèi)部最高液溫≤“溶劑熔點(diǎn)-3℃”(a、b、d、e、f、h)時(shí)，孔隙的50％以上為球孔。另外，該內(nèi)部最高液溫≤“溶劑熔點(diǎn)-7℃”(a、b、d)時(shí)，孔隙的80％以上為球孔，幾乎全部由球孔構(gòu)成。由此可知，為了使多孔體的孔隙形狀為球孔，在未凍結(jié)狀態(tài)下內(nèi)部最高液溫取“溶劑熔點(diǎn)-3℃”以下很重要，通過(guò)進(jìn)一步為“溶劑熔點(diǎn)-7℃”以下，能夠使孔隙的形狀幾乎全部為球孔。

a～i的孔隙形狀及平均孔尺寸如下所示。

a：球孔100％、62.74μm

b：球孔100％、65.36μm

c：柱孔/平板孔90％、79.19μm

d：球孔100％、63.17μm

e：球孔70％、69.44μm

f：球孔50％、53.98μm

g：柱孔/平板孔90％、79.48μm

h：球孔80％、76.58μm

i：柱孔/平板孔90％、79.65μm

[實(shí)施例22]重組肽塊的制作(多孔體的粉碎和交聯(lián))

將實(shí)施例21中得到的cbe3多孔體使用newpowermill(大阪化學(xué)、newpowermillpm-2005)進(jìn)行粉碎。粉碎通過(guò)最大轉(zhuǎn)速下1分鐘×5次、總計(jì)5分鐘的粉碎來(lái)進(jìn)行。對(duì)所得到的粉碎物，使用不銹鋼制的篩進(jìn)行尺寸分級(jí)，得到25～53μm和53～106μm的重組肽塊。然后，在減壓下在160℃實(shí)施72小時(shí)的熱交聯(lián)，得到試樣。這些試樣滿足振實(shí)密度為10mg/cm³以上且500mg/cm³以下、或者上述高分子塊的二維截面像的截面積的平方根÷周長(zhǎng)的值為0.01以上且0.13以下。對(duì)于使用這些試樣與實(shí)施例10和實(shí)施例12同樣制作的嵌合細(xì)胞塊而言，不區(qū)分a～i，在與實(shí)施例14同樣的體外分析、以及通過(guò)與實(shí)施例16～18相同的評(píng)價(jià)得到的動(dòng)物體內(nèi)的移植結(jié)果中，均顯示出高于比較用塊的性能(細(xì)胞的高存活率)。但是，如果來(lái)看這些試樣在a～i的條件下的性能差，則產(chǎn)生了輕微的差異，a、b、d的性能最高，其次為e、f、h，然后為c、g、i。即，這表明多孔體的孔隙形狀可以產(chǎn)生性能差。實(shí)施例18中，作為代表性的結(jié)果，對(duì)d(實(shí)施例2中所述的(2))進(jìn)行了詳細(xì)記述。