本發(fā)明屬于生物技術領域，具體為一種去除因原核包涵體表達變復性產(chǎn)生的多聚體的方法。

背景技術：

原核表達是一種常用的異源表達方式，利用此表達系統(tǒng)能實現(xiàn)快速、大量、高效獲得重組蛋白的目的，而且擁有成本低、耗時短、可控性強等優(yōu)勢，所以很多蛋白制劑企業(yè)都選用此表達系統(tǒng)，但此表達系統(tǒng)也有缺點，就是在表達過程中極易形成包涵體，雖然包涵體預示著較大的表達量，但經(jīng)變復性后的活性回收率較低，這是因為產(chǎn)生的大部分目的蛋白在包涵體的變復性過程形成了大量多聚體，大大降低了回收目的蛋白的回收率，另外，這些多聚體還成為體系中的大分子雜質(zhì)，需要添加后續(xù)工藝進行去除，增加工業(yè)化生產(chǎn)成本。

技術實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種去除因原核包涵體表達變復性產(chǎn)生的多聚體的方法，本發(fā)明在蛋白復性液中加入硫酸銨，使多聚體在鹽析作用下發(fā)生聚沉，再通過離心的方法使其從體系中分離出來，從而得到含量較為單一的復性液。通過此優(yōu)化工藝，可有效提高最終目的蛋白回收率，并顯著降低下游工藝對設備及耗材等的消耗，另外，可節(jié)省部分精制工藝，從而在提高生產(chǎn)效率同時有效降低生產(chǎn)成本。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種去除因原核包涵體表達變復性產(chǎn)生的多聚體的方法，包括以下步驟：

(1)菌種活化和發(fā)酵培養(yǎng)：將菌株進行活化培養(yǎng)，然后進行放大誘導發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵液中的菌體細胞，利用超聲破碎法獲得表達出的包涵體；

(2)包涵體變復性：向包涵體中加入變性液進行變性，離心收集變性完全的變性蛋白溶液，然后將收集到的變性蛋白溶液加入復性液中進行蛋白復性；

(3)硫酸銨沉淀：復性結(jié)束后，向復性液中添加硫酸銨固體，然后將復性液離心，收集上清液，得到去除多聚體后的復性蛋白溶液；

(4)蛋白精制：根據(jù)工藝要求，進行純化工藝，最終獲得目的蛋白制品。

作為優(yōu)選，所述步驟(2)中先使用lysis buffer對包涵體進行清洗，然后向清洗后的包涵體中加入預冷到2℃～8℃的變性液進行變性。

作為優(yōu)選，所述步驟(2)中將離心收集到的變性蛋白溶液逐滴加入預冷到 7℃～12℃的復性液中進行蛋白復性，復性液在7℃～12℃條件下低溫復性14～18小時。

作為優(yōu)選，所述步驟(2)中離心收集到的變性蛋白溶液與復性液的體積比為1:100。

作為優(yōu)選，步驟(2)中所述復性液的組份包括：1.4mM GSH、1mM EDTA、0.5M精氨酸、0.5M尿素。

作為優(yōu)選，所述復性液的pH值為8.5。

作為優(yōu)選，所述步驟(3)中復性結(jié)束后，在250～300rpm的攪拌速度下，向復性液中緩慢添加烘干并研磨成粉的硫酸銨固體，待硫酸銨固體完全溶解后繼續(xù)攪拌10～30分鐘，在2℃～8℃條件下靜置12～18小時。

作為優(yōu)選，所述步驟(3)中將復性液在10000～12000rpm、2℃～8℃條件下離心30～45分鐘。

作為優(yōu)選，所述步驟(3)中添加硫酸銨固體至硫酸銨達到15％～45％飽和度。

作為優(yōu)選，所述步驟(3)中添加硫酸銨固體至硫酸銨達到30％飽和度。

本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明通過優(yōu)化工藝，徹底解決了原核包涵體表達中因變復性產(chǎn)生的多聚體引起回收率低下與增加雜質(zhì)去除成本這兩大難題，有效去除復性液體系中50％以上多聚體，既提高了復性液的比活，又減少了下游工藝中因大顆粒蛋白堵塞超濾膜、占用層析膠配體位點以及堵塞膠粒通道等對耗材的消耗，通過此工藝可節(jié)約耗材成本60％以上，從兩個方面顯著提升了科研單位及生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品制備效率與利潤收益。

(2)經(jīng)過硫酸銨沉淀，極大提高了粗制品在層析純化中與凝膠的結(jié)合率，上樣量由原來每毫升凝膠結(jié)合1毫克蛋白升至每毫升可結(jié)合20毫克。通過硫酸銨沉淀步驟，比原工藝耗材利用率提高20倍以上，這有效避免了重復上樣，為實際操作節(jié)省了大量人力、物力、財力及時間成本，顯著提升了生產(chǎn)效率。

(3)通過使用硫酸銨沉淀工藝，可有效提高最終目的蛋白回收率，降低生產(chǎn)成本，將蛋白純化回收率提高近九倍，顯著提升了綜合生產(chǎn)效率，可帶來總產(chǎn)值5倍以上的效益的增長。

(4)本發(fā)明使用一種優(yōu)選配方的復性液，有效解決了原核包涵體表達中復性效率低下問題，提高了復性液中活性蛋白的回收率，顯著提升了科研單位及生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品制備效率與利潤收益。

附圖說明

圖1：不同飽和度硫酸銨沉淀乳腺癌靶向藥物TP25復性液檢測結(jié)果圖；

圖2：原始工藝所得TP25粗制品一倍上樣后平衡液電泳結(jié)果圖；

圖3：經(jīng)硫酸銨沉淀后所得TP25粗制品不同倍數(shù)上樣后平衡液電泳結(jié)果圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步具體說明。

實施例1

一種去除原核包涵體表達因變復性產(chǎn)生的多聚體的方法，包括以下步驟：

(1)菌種活化和發(fā)酵培養(yǎng)：將工程菌株(E.coli BL21)劃線接種于選擇性LB平板上，恒溫37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，挑取單菌落與含卡那霉素液體LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；將培養(yǎng)好的種子以1:100的比例轉(zhuǎn)接，進行放大發(fā)酵培養(yǎng)，2小時后對發(fā)酵液進行OD600檢測，當OD值達到0.6～0.7時加入IPTG誘導表達7小時，收集發(fā)酵液中的工程菌菌體細胞，利用超聲破碎法獲得表達出的包涵體；

(2)包涵體變復性：使用lysis buffer(裂解緩沖液)對包涵體進行清洗，向處理好的包涵體中加入預冷到6℃的變性液進行變性，離心收集變性完全的變性蛋白溶液，將變性蛋白溶液逐滴加入預冷到10℃的復性液中進行蛋白復性，復性液在10℃條件下低溫復性16小時，變性液與復性液的體積比為1:100，所述復性液的組份包括：1.4mM GSH、1mM EDTA、0.5M精氨酸、0.5M尿素，pH值為8.5；

(3)硫酸銨沉淀：復性結(jié)束后，在250rpm的攪拌速度下，向復性液中緩慢添加烘干并研磨成粉的硫酸銨固體至硫酸銨達到30％飽和度，待硫酸銨固體完全溶解后繼續(xù)攪拌30分鐘，在6℃條件下靜置16小時，然后將復性液在11000rpm、6℃條件下離心35分鐘，收集上清液，得到去除多聚體后的蛋白溶液；

(4)蛋白精制：根據(jù)工藝要求，進行層析等純化工藝，最終獲得純度較高的目的蛋白制品。

實施例2

下面以HER2陽性乳腺癌單抗靶向蛋白藥物TP25為例，進一步說明本發(fā)明的技術方案。

一種去除原核包涵體表達HER2陽性乳腺癌單抗靶向蛋白藥物TP25因變復性產(chǎn)生的多聚體的方法，包括以下步驟：

(1)菌種活化和發(fā)酵培養(yǎng)：將HER2陽性乳腺癌單抗靶向蛋白藥物TP25工程 菌株(E.coli BL21)劃線接種于選擇性LB平板上，恒溫37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，挑取單菌落與含卡那霉素液體LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；將培養(yǎng)好的種子以1:100的比例轉(zhuǎn)接，進行放大發(fā)酵培養(yǎng)，2小時后對發(fā)酵液進行OD600檢測，當OD值達到0.6～0.7時加入IPTG誘導表達5小時，收集發(fā)酵液中的工程菌菌體細胞，利用超聲破碎法獲得表達出的包涵體；

(2)包涵體變復性：使用lysis buffer(裂解緩沖液)對包涵體進行清洗，向處理好的包涵體中加入預冷到2℃的變性液進行變性，離心收集變性完全的變性蛋白溶液，將變性蛋白溶液逐滴加入預冷到7℃的復性液中進行蛋白復性，復性液在7℃條件下低溫復性14小時，變性液與復性液的體積比為1:100，所述復性液的組份包括：1.4mM GSH、1mM EDTA、0.5M精氨酸、0.5M尿素，pH值為8.5；

(3)硫酸銨沉淀：復性結(jié)束后，在300rpm的攪拌速度下，向復性液中緩慢添加烘干并研磨成粉的硫酸銨固體至硫酸銨達到30％飽和度，待硫酸銨固體完全溶解后繼續(xù)攪拌30分鐘，在2℃條件下靜置18小時，然后將復性液在10000、2℃條件下離心30分鐘，收集上清液，得到去除多聚體后的蛋白藥物TP25溶液；

(4)蛋白精制：將TP25粗制品進行陰離子交換樹脂層析等純化工藝，最終獲得純度較高的乳腺癌單抗藥物TP25。

實施例3

下面以HER2陽性乳腺癌單抗靶向蛋白藥物TP25為例，進一步說明本發(fā)明的技術方案。

一種去除原核包涵體表達HER2陽性乳腺癌單抗靶向蛋白藥物TP25因變復性產(chǎn)生的多聚體的方法，包括以下步驟：

(1)菌種活化和發(fā)酵培養(yǎng)：將HER2陽性乳腺癌單抗靶向蛋白藥物TP25工程菌株(E.coli BL21)劃線接種于選擇性LB平板上，恒溫37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，挑取單菌落與含卡那霉素液體LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；將培養(yǎng)好的種子以1:100的比例轉(zhuǎn)接，進行放大發(fā)酵培養(yǎng)，2小時后對發(fā)酵液進行OD600檢測，當OD值達到0.6～0.7時加入IPTG誘導表達9小時，收集發(fā)酵液中的工程菌菌體細胞，利用超聲破碎法獲得表達出的包涵體；

(2)包涵體變復性：使用lysis buffer(裂解緩沖液)對包涵體進行清洗，向處理好的包涵體中加入預冷到8℃的變性液進行變性，離心收集變性完全的變性蛋白溶液，將變性蛋白溶液逐滴加入預冷到12℃的復性液中進行蛋白復性，復性液在12℃條件下低溫復性14小時，變性液與復性液的體積比為1:100，所述復性液的組份包括：1.4mM GSH、1mM EDTA、0.5M精氨酸、0.5M尿素，pH 值為8.5；

(3)硫酸銨沉淀：復性結(jié)束后，在300rpm的攪拌速度下，向復性液中緩慢添加烘干并研磨成粉的硫酸銨固體至硫酸銨達到30％飽和度，待硫酸銨固體完全溶解后繼續(xù)攪拌10分鐘，在8℃條件下靜置12小時，然后將復性液在12000rpm、8℃條件下離心45分鐘，收集上清液，得到去除多聚體后的TP25溶液；

(4)蛋白精制：將TP25粗制品進行陰離子交換樹脂層析等純化工藝，最終獲得純度較高的HER2陽性乳腺癌單抗靶向蛋白藥物TP25。

實施例4：硫酸銨用量的確定

分別選用15％；20％；25％；30％；35％；45％飽和度硫酸銨沉淀TP25復性液，用于去除不完全復性的多聚體及雜蛋白。檢測結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以看出，30％硫酸銨飽和度時沉淀效果最好，單體幾乎沒有損失，且硫酸銨用量相對少，利于下游工藝硫酸根離子的去除。因此優(yōu)選硫酸銨用量為30％硫酸銨飽和度。

實施例5：本發(fā)明與原始工藝各步驟所得蛋白量對比

在蛋白復性液中，多聚體由于其體積大、質(zhì)量重，在硫酸銨的鹽析作用下，極易發(fā)生聚沉，再通過離心的方法使其從體系中分離出來，便得到含量較為單一的復性液。通過此優(yōu)化工藝，可有效提高最終目的蛋白回收率，并顯著降低下游工藝對設備及耗材等的消耗，另外，可節(jié)省部分精制工藝，從而有效減少生產(chǎn)成本。收集原有工藝與本發(fā)明實施例2中各步驟所得蛋白量進行對比，數(shù)據(jù)如下表1所示：

表1.原有工藝與本發(fā)明各步驟所得蛋白量

注：表中數(shù)據(jù)為每升發(fā)酵液所得平均蛋白量。

從表1中數(shù)據(jù)可知，硫酸銨沉淀后，單位體積發(fā)酵液蛋白純化回收率提高近九倍，最終制品收獲量提高五倍，使約占總蛋白50％以上的多聚體以及未完全復性的雜蛋白經(jīng)此步驟去除，有效降低了由大顆粒蛋白堵塞超濾膜、占用層析膠配體位點以及堵塞膠粒通道等問題，延長耗材的使用壽命，有效降低了生產(chǎn)成本。

實施例6：本發(fā)明與原始工藝所得粗制品在層析純化中與凝膠的結(jié)合率

原始工藝的所得TP25粗制品，按每毫升凝膠結(jié)合1毫克蛋白上樣后收集的平衡液電泳結(jié)果如圖2所示，此時已有目的蛋白流出。

經(jīng)硫酸銨沉淀后所得粗制品，每毫升凝膠分別上樣3mg；4mg；6mg；7mg；13mg；18mg；20mg；22mg；24mg；25mg；45mg制品，收集平衡液，觀察蛋白掛柱情況，結(jié)果如圖3所示，圖上方數(shù)字表示上樣量。

從圖3可以看出，上樣量為每毫升凝膠結(jié)合22mg制品時目的蛋白有流出，因此將上樣量定于每毫升凝膠結(jié)合20mg制品。經(jīng)過硫酸銨沉淀，極大提高了粗制品在層析純化中與凝膠的結(jié)合率，上樣量由原來每毫升凝膠結(jié)合1毫克蛋白升至每毫升可結(jié)合20毫克。通過硫酸銨沉淀步驟，比原工藝耗材利用率提高20倍以上，這有效避免重復上樣，為實際操作節(jié)省了大量人力、物力、財力及時間成本，同時提升了生產(chǎn)效率。

通過使用硫酸銨沉淀工藝，可提高產(chǎn)品產(chǎn)品收率，降低生產(chǎn)成本，顯著提升了綜合生產(chǎn)效率，可帶來總產(chǎn)值5倍以上效益的增長。