本發(fā)明屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種重組α-L-鼠李糖苷酶的粗提液直接在微通道反應(yīng)器中催化定向水解黃酮苷的方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

黃酮類化合物是植物多酚的一個亞群，是植物重要的一類次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于水果、蔬菜、豆類及茶葉等許多食源性植物中。然而，天然黃酮類化合物大部分以黃酮苷的形式存在。由于黃酮苷類脂溶性較差，限制了其生物活性的發(fā)揮，且部分黃酮苷類喪失其苷元的特性。因此，可通過定向水解柚皮苷、蘆丁、槲皮苷、橘皮苷等黃酮苷而釋放出鼠李糖以發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能。如：可用于降低蕓香科水果果汁的苦味，能夠水解葡萄中的鍵合態(tài)芳香物質(zhì)而釋放芳香物質(zhì)，可用于改進(jìn)傳統(tǒng)的鼠李糖生產(chǎn)工藝等(Process Biochemistry.2010,45(8):1226-1235)。

根據(jù)以往的研究報道，定向水解黃酮苷的常用方法為酸解法(Food Ferment Ind,2014，20:236-238)和酶解法(CN1685053A)。酸解法一般工藝較為復(fù)雜、試劑難以去除且容易污染環(huán)境，而酶解法由于條件溫和、選擇性高而備受推崇。在酶解黃酮苷的過程中，最常用的催化劑是α-L-鼠李糖苷酶，不同來源的α-L-鼠李糖苷酶水解位點各不相同，分別可以催化水解α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6及α1連接的不同糖苷鍵，因此它能夠廣泛運用于黃酮苷的水解(Process Biochemistry,2010,45(8):1226-1235；中國釀造,2010(10):11-15)。目前，α-L-鼠李糖苷酶的應(yīng)用主要分為游離酶、固定化酶和全細(xì)胞催化劑等形式。如Visser等使用陰離子交換色譜法分離純化來源于黑曲霉的α-L-鼠李糖苷酶(FEMS Microbiology Letters,1997.157(2):279-283),Yadav等使用超濾、陽離子交換柱層析法分離純化來源于青霉菌的α-L-鼠李糖苷酶(Process Biochemistry,2013.48(9):1348-1354)，總體上這些分離純化過程成本高、難度大，導(dǎo)致酶制劑產(chǎn)品的市場價格極其昂貴，商業(yè)化程度不高；固定化的α-L-鼠李糖苷酶常常由于受到固定位點的限制，使其催化效率下降(J Appl Polym Sci,1999,72(10):1367)；而全細(xì)胞催化劑通常會發(fā)生絮凝使其傳質(zhì)受阻而降低其催化效率。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)反應(yīng)器相比，在微通道反應(yīng)器中水解黃酮苷，可以使催化定向水解的時間由原來的6h降低到40min，同時能有效提高產(chǎn)物得率(J.Serb.Chem.Soc.2015,80(7):853–866)，但α-L-鼠李糖苷酶在微反應(yīng)器中由于蛋白聚集而表現(xiàn)為容易堵塞，限制了其實際應(yīng)用。因此，如果能尋找合適的方法，不僅使得重組α-L-鼠李糖苷酶容易獲得，還可以避免游離酶在微反應(yīng)器中的富集和堵塞，對于酶催化定向水解黃酮苷將具有廣闊的市場前景。

因此，本發(fā)明一種直接利用重組α-L-鼠李糖苷酶粗提液在微通道反應(yīng)器中催化定向水解黃酮苷的方法。本發(fā)明將超聲破碎的方法提取重組大腸桿菌中α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液，直接與黃酮苷在微通道反應(yīng)器中充分接觸，添加適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┙⒐踩軇┓磻?yīng)體系，以防止α-L-鼠李糖苷酶在微通道內(nèi)的富集引起的堵塞。這不僅省掉了酶和產(chǎn)物的分離純化步驟，使得操作簡單方便，同時便于酶的回收利用。更重要的是，該方法能夠有效提高催化效率，獲得具有生理活性的單一產(chǎn)物，無副產(chǎn)物生成，顯著降低生產(chǎn)成本。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明主要克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的α-L-鼠李糖苷酶分離純化成本高及其在微反應(yīng)器中容易聚集和堵塞等技術(shù)難題，提供一種直接利用重組α-L-鼠李糖苷酶粗提液在微通道反應(yīng)器中定向水解黃酮苷，并按照比例添加適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┙⒐踩軇┓磻?yīng)體系的方法。還涉及α-L-鼠李糖苷酶基因rhaA和rhaB及包含該基因的載體和菌株，本發(fā)明將表達(dá)的α-L-鼠李糖苷酶粗提液直接用于在微反應(yīng)器中將蘆丁專一的水解生成具有生理活性的異槲皮苷，其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物純度高，易分離，無副產(chǎn)物，同時解決了α-L-鼠李糖苷酶在微通道內(nèi)富集導(dǎo)致的堵塞問題。

技術(shù)方案：重組α-L-鼠李糖苷酶粗提液用于微通道反應(yīng)器中催化定向水解黃酮苷的方法，步驟為將表達(dá)的RhaA和RhaB型α-L-鼠李糖苷酶超聲提取粗酶液直接用于微通道反應(yīng)器內(nèi)水解黃酮苷，并在微反應(yīng)器中加入表面活性劑建立共溶劑體系，以大大提高催化效率。

分別構(gòu)建rhaA型和rhaB型的表達(dá)α-L-鼠李糖苷酶的重組工程菌；所述的工程菌的質(zhì)粒載體為pET21a；所述工程菌的宿主菌為大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)(購自Invitrogen公司)；所述的重組工程菌的培養(yǎng)方法為：接種到50μg/mL氨芐青霉素鈉鹽的LB液體培養(yǎng)基中生長到指數(shù)期，然后經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導(dǎo)表達(dá)；所述的IPTG濃度為200～800μM；所述的生長溫度為22～37℃；所述的誘導(dǎo)溫度為17～25℃；所述的誘導(dǎo)時間為12～20h。

由所述重組工程菌制備α-L-鼠李糖苷酶的方法為超聲破碎法，所述的超聲緩沖液分別為：pH7.0PBS，pH8.01.0M Tris-HCl和pH8.01×LEW buffer：含有50mM NaH₂PO₄和300mM NaCl，所述的超聲波功率為0.2～1.0kW，所述的超聲時間為6～36min，然后12000rpm離心30min，收集上清為粗酶液。

所述黃酮苷溶解于緩沖液中，所述的緩沖液為pH4.5的NaOAc、pH5.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、pH5.5～6.5的MES緩沖液和pH6.5～7.5的PBS緩沖液；表面活性劑濃度為2wt.％～15wt.％；底物濃度為0.02～0.2g/L；反應(yīng)溫度為30～70℃；流速為1～20μL/min。

所述的表面活性劑分別為陰離子表面活性劑、非離子表面活性劑或離子液體；所述的離子液體分別為[Bmim]Tf₂N,[Nmim]HSO₄,[Emim]BF₄,[Emim]OTF,[Emim]PF₆,[Bmim]BF₄,[Bmim]PF₆,[Hmim]HSO₄,[Omim]BF₄,[BMPY]C₄F₉SO₃,[Toma]Tf₂N,[Toma]TF₃,[Toma]PF₆,[ChCl]Urea,[TCMAC]或[Hmim]Cl。

所述黃酮苷為蘆丁或柚皮苷。

有益效果：本發(fā)明首先構(gòu)建表達(dá)α-L-鼠李糖苷酶的rhaA和rhaB型基因文庫；所述的表達(dá)質(zhì)粒分別將rhaA和rhaB型基因插入初始載體pET21a中，構(gòu)建了表達(dá)載體pET21a-rhaA和pET21a-rhaB，并將它導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)中，獲得E.coli BL21(DE3)-pET21a-rhaA和E.coli BL21(DE3)-pET21a-rhaB。上述菌株經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，RhaA和RhaB蛋白成功地在E.coli中表達(dá)，然后采用超聲破碎方法制備的α-L-鼠李糖苷酶酶活為24.23U/mg。提取的粗酶液直接與底物蘆丁在微通道反應(yīng)器中充分接觸，按照比例適當(dāng)添加表面活性劑建立共溶劑體系，將蘆丁轉(zhuǎn)化為單一產(chǎn)物異槲皮苷，產(chǎn)物得率高達(dá)99.5±4.8％，將反應(yīng)時間由原來的10h減少到10min，大大提高了催化效率。采用重組α-L-鼠李糖苷酶既具有可靠的生物安全性，又能夠提高α-L-鼠李糖苷酶的催化效率，同時獲得具有生理活性的單一產(chǎn)物，無副產(chǎn)物產(chǎn)生。此外，表面活性劑的添加有效解決了酶在微反應(yīng)器內(nèi)富集所導(dǎo)致的堵塞問題。

附圖說明

圖1為本發(fā)明重組E.coli BL21(DE3)-pET21a-rha流程示意圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

本發(fā)明提供一種帶有α-L-鼠李糖苷酶的重組菌株，從所述重組菌株中獲得α-L-鼠李糖苷酶的制備方法，所述α-L-鼠李糖苷酶在微反應(yīng)器中催化水解蘆丁生成異槲皮苷的反應(yīng)體系。

本發(fā)明所述的α-L-鼠李糖苷酶基因為rhaA和rhaB型；所述的表達(dá)質(zhì)粒將rhaA和rhaB基因插入初始載體pET21a中，構(gòu)建了表達(dá)載體pET21a-rhaA和pET21a-rhaB，并將它導(dǎo)入E.coli BL21(DE3)中，獲得含有表達(dá)載體pET21a-rhaA或pET21a-rhaB的大腸桿菌BL21(DE3)-pET21a-rhaA或BL21(DE3)-pET21a-rhaB。上述菌株經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后，RhaA和RhaB蛋白成功的在大腸桿菌中表達(dá)，然后采用超聲破碎的方法制備RhaA和RhaB，使粗酶液直接與底物蘆丁在微通道反應(yīng)器中充分接觸將其轉(zhuǎn)化為單一產(chǎn)物異槲皮苷，并按照比例添加適當(dāng)?shù)谋砻婊钚詣┙⒐踩軇w系以解決酶在微通道內(nèi)富集所導(dǎo)致的堵塞問題。

實施例1構(gòu)建表達(dá)α-L-鼠李糖苷酶重組E.coli BL21(DE3)-pET21a-rhaA

將已獲得的目的基因rhaA用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，回收后與經(jīng)同樣內(nèi)切酶處理過的質(zhì)粒片段pET21a進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并均勻涂布于帶有氨芐青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆接種到帶有氨芐青霉素抗性(50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀值為0.6～0.8，進(jìn)行菌液提取質(zhì)粒和PCR驗證。挑取經(jīng)上述驗證正確的單菌落，接種于含有氨芐青霉素抗性(50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中(3～5mL)，37℃振蕩培養(yǎng)生長至指數(shù)期；然后按照2％的接菌量轉(zhuǎn)接到含有氨芐青霉素抗性(50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中(100～500mL)，22～37℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到0.6～0.8時，然后添加200～800μM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)與17～25℃誘導(dǎo)表達(dá)12～20h。

實施例2構(gòu)建表達(dá)α-L-鼠李糖苷酶重組E.coli BL21(DE3)-pET21a-rhaB

將已獲得的目的基因rhaB用SalI和HindIII進(jìn)行雙酶切，回收后與經(jīng)同樣內(nèi)切酶處理過的質(zhì)粒片段pET21a進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并均勻涂布于帶有氨芐青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜，挑取單克隆接種到帶有氨芐青霉素抗性(50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD₆₀₀值為0.6～0.8，進(jìn)行菌液提取質(zhì)粒和PCR驗證。挑取經(jīng)上述驗證正確的單菌落，接種于含有氨芐青霉素抗性(50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中(3～5mL)，37℃振蕩培養(yǎng)生長至指數(shù)期；然后按照2％的接菌量轉(zhuǎn)接到含有氨芐青霉素抗性(50μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中(100～500mL)，22～37℃振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到0.6～0.8時，然后添加200～800μM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)與17～25℃誘導(dǎo)表達(dá)12～20h。

實施例3重組α-L-鼠李糖苷酶的制備

將上述誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束的菌液(1L)在4℃下8000rpm離心5min，收集菌體；用pH7.2～7.4PBS緩沖液清洗菌體兩次；然后分別用不同超聲緩沖液重懸菌體進(jìn)行超聲。超聲緩沖液為：1.0M Tris-HCl(pH8.0，30mL)，超聲波功率為0.2kW，超聲時間為6min。超聲結(jié)束后12000rpm離心30min，收集上清即為α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液，測得酶活為15.88U/mg。

實施例4重組α-L-鼠李糖苷酶的制備

將上述誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束的菌液(1L)在4℃下8000rpm離心5min，收集菌體；用pH7.2～7.4PBS緩沖液清洗菌體兩次；然后分別用不同超聲緩沖液重懸菌體進(jìn)行超聲。超聲緩沖液為：1×LEW buffer(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl(pH8.0，30mL))，超聲波功率為1.0kW，超聲時間為36min。超聲結(jié)束后12000rpm離心30min，收集上清即為α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液，測得酶活為23.57U/mg。

實施例5重組α-L-鼠李糖苷酶的制備

將上述誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束的菌液(1L)在4℃下8000rpm離心5min，收集菌體；用pH7.2～7.4PBS緩沖液清洗菌體兩次；然后分別用不同超聲緩沖液重懸菌體進(jìn)行超聲。超聲緩沖液為：PBS(pH7.0，30mL)，超聲波功率為0.6kW，超聲時間為12min。超聲結(jié)束后12000rpm離心30min，收集上清即為α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液，測得酶活為24.23U/mg。與對照相比，酶活提高了1.3倍。

實施例6重組α-L-鼠李糖苷酶在微反應(yīng)器中催化定向水解蘆丁

以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，配制pH＝5的0.02g/L的蘆丁母液。量取上述實施例5制備的粗酶液和0.02g/L蘆丁液以等體積分別從兩個通道泵入微反應(yīng)器內(nèi)，同時在粗酶液中添加4％的吐溫80，在30℃條件下充分接觸，流速為1μL/min。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)HPLC檢測，產(chǎn)物異槲皮苷的得率為59.2±3.4％。

實施例7重組α-L-鼠李糖苷酶在微反應(yīng)器中催化定向水解蘆丁

以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，配制pH＝5的0.2g/L的蘆丁母液。量取上述實施例5制備的粗酶液和0.2g/L蘆丁液以等體積分別從兩個通道泵入微反應(yīng)器內(nèi)，同時在粗酶液中添加4％的十二烷基硫酸鈉，在70℃條件下充分接觸，流速為20μL/min。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)HPLC檢測，產(chǎn)物異槲皮苷的得率為7.7±0.9％。

實施例8重組α-L-鼠李糖苷酶在微反應(yīng)器中催化定向水解蘆丁

以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，配制pH＝5的0.02g/L的蘆丁母液。量取上述實施例5制備的粗酶液和0.02g/L蘆丁液以等體積分別從兩個通道泵入微反應(yīng)器內(nèi)，同時在粗酶液中添加2％的離子液體[Toma]Tf₂N，在35℃條件下充分接觸，流速為2μL/min。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)HPLC檢測，產(chǎn)物異槲皮苷的得率為99.5±4.8％。與常規(guī)反應(yīng)相比，反應(yīng)時間由原來的10h降低到10min，大大提高了時空產(chǎn)率。

實施例9重組α-L-鼠李糖苷酶在微反應(yīng)器中催化定向水解柚皮苷

以磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，配制pH＝5的0.02g/L的柚皮苷母液。量取上述實施例5制備的粗酶液和0.02g/L柚皮苷液以等體積分別從兩個通道泵入微反應(yīng)器內(nèi)，同時在粗酶液中添加15％的離子液體[Toma]Tf₂N，在35℃條件下充分接觸，流速為2μL/min。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)HPLC檢測，產(chǎn)物普魯寧的得率為91.9±5.2％。與常規(guī)反應(yīng)相比，反應(yīng)時間由原來的10h降低到10min，大大提高了時空產(chǎn)率。