槐角苷抗雌鼠生育的方法
【專利摘要】以槐角苷為活性成分的抗雌鼠生育滅鼠劑，屬于生物防治【技術(shù)領(lǐng)域】。鼠害問題一直以來都是一個嚴(yán)重的世界性災(zāi)害問題，它在對農(nóng)林牧業(yè)造成損害的同時，也嚴(yán)重破壞了生態(tài)環(huán)境，威脅著人類的健康。長久以來，人們采用多種方法對其種群數(shù)量加以控制，其中運用抗生育技術(shù)對害鼠種群數(shù)量進行控制是近些年發(fā)展起來的一項新技術(shù)。本發(fā)明涉及一種以槐角苷為活性成分的雌性不育滅鼠劑用于控制鼠類繁殖。相較于傳統(tǒng)的生態(tài)滅鼠法及化學(xué)毒餌法，抗生育技術(shù)具有作用時間長、控制效果明顯、環(huán)境毒副作用小等優(yōu)點，能更有效地抑制害鼠種群的超補償性效應(yīng)。本發(fā)明若能應(yīng)用于農(nóng)林牧業(yè)生產(chǎn)，將能有效控制害鼠種群數(shù)量，具有廣闊的經(jīng)濟效益。
【專利說明】槐角苷抗雌鼠生育的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于鼠害控制的抗生育滅鼠劑，具體涉及一種以槐角苷為活性成分的雌性不育劑用于控制鼠類繁殖。
【背景技術(shù)】
[0002]鼠害問題一直以來都是一個嚴(yán)重的世界性災(zāi)害問題，它在對農(nóng)林牧業(yè)造成損害的同時，也嚴(yán)重破壞了生態(tài)環(huán)境，威脅著人類的健康。全世界鼠類有2000多種，我國記載的鼠類為130種，其中農(nóng)業(yè)害鼠達(dá)112種。
[0003]鼠害也是我國草原上的“三害”之首，是草地主要的生物災(zāi)害，作為草地生態(tài)系統(tǒng)退化的一個重要因素正在嚴(yán)重威脅著草地畜牧業(yè)的存在和發(fā)展。我國草原總面積近60億畝(為國土總面積的40%，為全國農(nóng)耕地總面積的四倍)，其中可利用的草原面積約33億畝，據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計，全國現(xiàn)有牧業(yè)鼠害面積5.6億畝，每年損失牧草2800億多斤，價值8億多元。在川、青藏高原草原，鼠害尤為嚴(yán)重。調(diào)查資料表明，西藏草原鼠害面積達(dá)1.2億畝，川西北草原鼠害面積達(dá)3000萬畝，這兩地區(qū)每年因鼠害造成天然牧草損失達(dá)3000萬羊單位全年飼料供應(yīng)量，價值數(shù)億元。鼠害嚴(yán)重地區(qū)，造成大片鼠荒地，使草場退化乃至沙化，僅四川石渠縣的鼠荒地已達(dá)近1000萬畝。因此，有效控制鼠害，是一件具有全面性、長遠(yuǎn)性的大事，有著重要的經(jīng)濟意義。
[0004]由于鼠類種類多、數(shù)量大、分布廣、適應(yīng)性強，與人類爭地、爭糧、同生境、共疾病，嚴(yán)重威脅著人類社會文明健康發(fā)展，成為世界性的一大公害。有效控制鼠害是保障農(nóng)、林、牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)之一。
`[0005]目前，鼠害是國內(nèi)外農(nóng).林.牧經(jīng)濟作物的嚴(yán)重危害者，是一種難于防治的禍患。單純使用傳統(tǒng)的機械逮捕和化學(xué)急性殺滅法，如第一代化學(xué)直接殺滅法:主要是運用劇毒化合物制成毒餌，通過鼠類的誤食導(dǎo)致死亡。通過化學(xué)誘餌直接殺滅，在滅鼠過程中由于老鼠臨死之前反應(yīng)較為激烈，容易引起其它鼠的警覺，導(dǎo)致傳統(tǒng)的化學(xué)殺滅方法并不能有效的控制鼠害，由于鼠的繁殖能力強、生殖周期非常短的特點，致使殘存的鼠很快就會生態(tài)恢復(fù)到原有的種群數(shù)量，即所謂超補償性增殖，恢復(fù)后的鼠的種群密度可能比直接殺滅前的密度還要高，有些地區(qū)的鼠害問題不但沒有緩解，反而有“越滅越多”之勢；其次，由于鼠類的天敵誤食由化學(xué)滅鼠劑毒死的死鼠，造成二次中毒，大量的鼠類天敵被毒死；控制鼠類生態(tài)平衡天敵大量減少，達(dá)不到有效控制鼠類危害的作用，從而鼠類數(shù)量得以快速增長。
[0006]第二代抗凝血滅鼠藥:是通過作用于血管壁使其通透性增加容易出血和干擾凝血酶原等凝血因子合成使血液不易凝固這兩種途徑發(fā)揮作用來達(dá)到殺滅害鼠的，相對第一代劇毒化學(xué)試劑而言，毒性小，較為安全。由于快速殺滅造成鼠類許多“種群真空”環(huán)境，刺激殘鼠迅速繁殖，也會出現(xiàn)超補償性增殖現(xiàn)象，因此不利于大規(guī)模使用。
[0007]為了能夠較長期地控制害鼠數(shù)量、減少鼠害程度，避免出現(xiàn)超補償性增殖。近年來，利用鼠不育技術(shù)來控制鼠害是避免超補償性增殖的有效方法。按照其來源劃分，可分為化學(xué)不育劑、植物源不育劑和免疫不育劑三類。不育劑具有的理想滅鼠效果、滅鼠的持久性以及對環(huán)境污染少等特點。
[0008]槐角苷，是一種植物源抗生育劑，主要來源于豆科植物槐樹的果實槐角。《中華本草》中記載:槐角中含的槐角甙、染料木素和山柰酚對小鼠具有抗生育作用和雌激素活性。近些年的研究中，對槐角苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)已有了一定的研究報道，且動物實驗也闡明了槐角苷呈現(xiàn)出雌激素樣活性，具有顯著的抗生育作用。作為一種潛在的新型植物源抗生育劑，槐角苷具有產(chǎn)量高、價格低廉、毒副作用小等優(yōu)點，在農(nóng)業(yè)、林業(yè)及畜牧業(yè)的鼠害防治方面，展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。
[0009]到目前為止，僅有文獻報道了槐角苷對實驗動物具有抗生育現(xiàn)象，但是對于其具體的抗生育作用機制及應(yīng)用卻還未見報道。本發(fā)明旨在基于對槐角苷的具體抗生育作用機制研究基礎(chǔ)上，構(gòu)建新型鼠雌性不育劑，為我國鼠害的防控提供新的技術(shù)手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明的目的在于提供一種雌性不育滅鼠劑槐角苷，通過阻斷鼠類繁殖途徑達(dá)到滅殺和控制鼠類的雌性不育滅鼠劑。
[0011]本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)。
[0012]本發(fā)明提供一種雌性不育滅鼠劑，其特征是采用不育劑槐角苷作為活性成分用于對鼠類的殺滅。
[0013]1、實驗方法。
[0014]將性成熟的雄性小鼠與性成熟的雌性小鼠于晚上8-10點按雌雄比例為2:1進行合籠，次日早上8-9點對雌鼠進行妊娠檢查，發(fā)現(xiàn)陰栓或精子則為受孕成功，記為妊娠第一天(Dl )，并按下述方法進行處理。
`[0015]1.1生育力實驗
取妊娠第一天(Dl)的小鼠48只，隨機分為4組，每組12只，自Dl起按照0，150，300，600 mg/kg/day的槐角苷劑量分別進行灌胃處理,連續(xù)給藥6天(D6),第8天(D8)解剖檢驗，統(tǒng)計各組胚胎數(shù)量。
[0016]1.2掃描電子顯微鏡(SEM)
將妊娠第一天(Dl)的雌性小鼠6只，平均分為2組，每組3只。第一組作為空白對照組，第二組按照600 mg/kg/day的槐角苷劑量進行灌胃，至第五天(D5)解剖，取出子宮。將子宮切成合適長度的片段后置于4%的多聚甲醛固定液中固定2小時，取出后用一定濃度梯度的乙醇溶液(50%、70%、80%、90%、95%)依次進行脫水處理，每次15分鐘，再用乙酸異戊酯洗脫15分鐘。處理后的樣品進行CO2臨界點干燥I小時，之后利用SEM(JSM-5900LV，JE0L)檢視其子宮內(nèi)膜表面(每個樣品取10個不同的視野進行分析)。
[0017]1.3免疫組化研究
為了對小鼠子宮內(nèi)膜中雌激素受體(ERα )及孕激素受體(PR)的表達(dá)水平及位置做進一步研究，進行了免疫組化研究。將妊娠第一天(Dl)的36只小鼠隨機分為6組，每組6只，按以下方法進行處理。3組作為對照組，另外3組為600 mg/kg/day的槐角苷灌胃處理的實驗組。灌胃至第四天(D4)時，處死一組對照組與一組實驗組小鼠，取出子宮切成適當(dāng)長度的片段后置于4%的多聚甲醛固定液中保存；同法，第五天(D5)與第六天(D6)各處死一組對照組與實驗組小鼠，子宮于4%的多聚甲醛固定液中保存。將處理組樣品包埋于石蠟之中，切片(厚度4 ym至10 μπι)常規(guī)脫蠟至水。95 °C條件下，用0.01 M檸檬酸鈉緩沖液(pH
6.0)進行抗原修復(fù)20 min，冷卻至室溫。3% H2O2孵育10 min后，加山羊血清封閉，37°C濕盒中溫育20min。隨后，將切片與用PBS稀釋的兔抗ERa (1:400，SC-542，Santa Cruz)、PR (1:300，SC-538, Santa Cruz)分別結(jié)合，4 °C孵化過夜。切片經(jīng)PBS洗滌之后，用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(ZSGB ΒΙ0，中國)在37°C條件下孵育lh。之后用3，3’ - 二氨基聯(lián)苯胺溶液(ZSGB ΒΙ0,中國)進行檢測，隨后加入伊紅溶液進行成像檢測。除一抗用PBS代替之外，對照組的其余過程與處理組完全相同。最后，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，每個樣品取5個視野，其平均光密度值視為該樣品的光密度值。
[0018]2.1槐角苷對雌性小鼠胚胎著床的影響
對于不同濃度槐角苷處理的受孕小鼠，隨著藥物濃度的提高，其胚胎著床平均數(shù)量呈現(xiàn)出下降的趨勢，當(dāng)槐角苷濃度達(dá)到600 mg/kg/day時,胚胎著床平均數(shù)量與對照組相比，呈現(xiàn)出極顯著差異(P〈0.01)。
[0019]2.2槐角苷對小鼠子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的影響
SEM掃描電鏡結(jié)果表明，對照組子宮內(nèi)膜上含有大量胞飲突、微絨毛，并且呈現(xiàn)出規(guī)則性的分布；處理組中胞飲突、微絨毛含量則相對較少，且分布極不規(guī)則，散亂地分布于子宮內(nèi)膜上。
[0020]2.3槐角苷對小鼠子宮內(nèi)ERa及PR表達(dá)水平的影響
D4、D5及D6的免疫組化結(jié)果表明，ERa及PR廣泛地表達(dá)于子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞中。但與對照組相比，在600 mg/kg/day的藥物處理組中ERa的表達(dá)水平呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢，PR的表達(dá)水平則顯著提高。
[0021 ] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點。
`[0022]1、本發(fā)明中雌性不育劑槐角苷對雌鼠生育能力的控制極其顯著。實驗證明，對交配受孕成功后的雌性小鼠，以600mg/kg/day的劑量進行灌胃給藥，連續(xù)給藥5天，其不育率可達(dá)到70%以上。
[0023]2、本發(fā)明中雌性不育劑槐角苷對鼠類的子宮有一定的損傷作用。病理學(xué)檢測表明，經(jīng)600mg/kg/day槐角苷處理后的小鼠，子宮內(nèi)膜病理學(xué)增生、子宮厚度增加，子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。
[0024]3、本發(fā)明中雌性不育劑槐角苷對鼠類子宮內(nèi)胚胎著床的關(guān)鍵受體ERa及PR表達(dá)水平產(chǎn)生影響。免疫組化實驗表明，ERa及PR廣泛地表達(dá)于子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞、腺體細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞中。但與對照組相比，經(jīng)600mg/kg/day槐角苷處理后的小鼠，子宮內(nèi)ERa的表達(dá)水平顯著下降(P〈0.05)，PR的表達(dá)水平則顯著上升(P〈0.05)。這一結(jié)果表明槐角苷能對雌鼠胚胎著床期間的關(guān)鍵受體產(chǎn)生影響，這一影響最終導(dǎo)致了雌鼠子宮內(nèi)胚胎著床的失敗。這就意味著槐角苷能夠通過影響胚胎的著床從而導(dǎo)致雌鼠不育，控制鼠類的繁殖從而達(dá)到對鼠類種群的控制。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1槐角苷對雌性小鼠胚胎著床的影響A:不同濃度槐角苷處理下小鼠胚胎平均著床數(shù)量(p〈0.01) ； B:對照組小鼠胚胎著床情況(D8) ；C:600mg/kg/day槐角苷處理組小鼠胚胎著床情況(D8) ；D:正常小鼠子宮形態(tài)；E:600mg/kg/day槐角苷處理小鼠子宮形態(tài)(D8)。
[0026]圖2槐角苷對小鼠子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)的影響A:正常妊娠小鼠第五天(D5)子宮內(nèi)膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)情況；B:經(jīng)600 mg/kg/day槐角苷處理后妊娠小鼠第五天(D5)子宮內(nèi)膜內(nèi)部結(jié)構(gòu)。
[0027]圖3槐角苷對小鼠子宮內(nèi)ERa及PR表達(dá)水平的影響(200X) *P〈0.05，**Ρ〈0.01。
【具體實施方式】
[0028]下文將通過實施實例對本發(fā)明做進一步說明，但實施實例不以任何方式限制本發(fā)明。
[0029]實例1:
選用純度為98%的槐角苷為不育劑藥物，以受孕第一天的ICR雌性小鼠為研究對象，以150mg/kg/day的劑量連續(xù)灌胃給藥5天,發(fā)現(xiàn)胚胎著床平均數(shù)量與對照組相比減少達(dá)20%。
[0030]實例2:
選用純度為98%的槐角苷為不育劑藥物，以受孕第一天的ICR雌性小鼠為研究對象，以300mg/kg/day的劑量連續(xù)灌胃給藥5天，發(fā)現(xiàn)胚胎著床平均數(shù)量與對照組相比減少超過30%。
[0031]實例3:
選用純度為98%的槐角苷為不育劑藥物，以受孕第一天的ICR雌性小鼠為研究對象，以600mg/kg/day的劑量連續(xù)灌胃給藥5天，發(fā)現(xiàn)胚胎著床平均數(shù)量與對照組相比減少達(dá)到70%，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P〈0.05)`。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，槐角苷處理后子宮內(nèi)膜病理學(xué)增生、厚度增加，子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，子宮內(nèi)影響胚胎著床的關(guān)鍵受體ERa的表達(dá)水平顯著降低(P〈0.05)，PR的表達(dá)水平顯著上升(P〈0.05)。實驗結(jié)果為不育率可達(dá)到70%。
【權(quán)利要求】
1.一種抗生育滅鼠劑，其特征在于，所述抗生育滅鼠劑是以槐角苷作為活性組分的抗生育劑。
2.權(quán)利要求1所述的抗生育滅鼠劑，其特征在于，所述鼠類為雌鼠類動物。
3.權(quán)利要求1或2中所述的抗生育滅鼠劑，其特征在于，所述槐角苷主要來源于豆科植物槐樹的果實槐角，尼泊爾黃花木莖，漆樹科植物寬葉尚乳香葉等。
4.一種滅鼠方法，其特征在于，通過使用權(quán)利要求1-3任一項所述的抗生育滅鼠劑，控制雌鼠的生育及其種群的數(shù)量。
5.權(quán)利要求4所述的方法，包括在鼠類繁殖開始或繁殖期內(nèi)，每鼠每天按照150mg/kg-1000 mg/kg體重進行口服/灌胃給藥的方法，連續(xù)給藥5— 7天，即可控制雌性鼠類生育及其數(shù)量。`
【文檔編號】A01P23/00GK103858876SQ201410084288
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月10日
【發(fā)明者】楊志榮, 張 杰, 周建宏, 瞿成權(quán), 趙建, 孫群, 馮甦, 侯若彤 申請人:四川大學(xué)