本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體的說涉及一種桑黃菌絲體的液體發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
桑黃(Sanghuangporus sanghuang)，俗稱桑黃、桑耳，最早收載于李時(shí)珍《本草綱目》中，是一種多年生藥用真菌。桑黃的關(guān)鍵藥效成分為桑黃多糖和桑黃黃酮，其中桑黃黃酮具有抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等功效，是國際公認(rèn)的最佳抗癌真菌之一。
現(xiàn)階段，桑黃菌體及其關(guān)鍵藥效成分的產(chǎn)量成為阻礙桑黃產(chǎn)品應(yīng)用的瓶頸。由于液體深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)桑黃具有質(zhì)量可控、生產(chǎn)周期短等特點(diǎn)，目前已成為獲取桑黃及其活性物質(zhì)的有效方法。近年來，桑黃的液體發(fā)酵技術(shù)取得了很大進(jìn)展，但如何進(jìn)一步提高桑黃菌絲體或關(guān)鍵藥效成分的產(chǎn)量以提高其附加值，是桑黃開發(fā)利用函待解決的問題。
目前研究表明，香豆素、萘乙酸、肉桂酸、乙酸鈉都能誘導(dǎo)桑黃黃酮的合成。這些工作為研究桑黃黃酮生物合成的調(diào)控機(jī)制提供了很好的材料和表型。但是上述誘導(dǎo)物對(duì)桑黃黃酮的增產(chǎn)效果均較低，如何大量增產(chǎn)桑黃黃酮仍需要探究更有效的誘導(dǎo)物。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種桑黃菌絲體的液體發(fā)酵方法，其是在桑黃菌絲體的液體發(fā)酵培養(yǎng)中添加0.7-1.1g/L的四水乙酸鎂。
其中添四水乙酸鎂，可以在發(fā)酵培養(yǎng)中的第0天、第1天、第2天或第3天中的任一天添加。
具體的說，本發(fā)明的桑黃菌絲體的液體發(fā)酵方法包括如下步驟：
(1)將桑黃菌種接種于種子培養(yǎng)基中，接種后于24-30℃、100-180r/min下培養(yǎng)5-9天，得到種子培養(yǎng)液；
(2)將種子培養(yǎng)液，按照5-15％(相對(duì)于發(fā)酵培養(yǎng)基)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后于24-30℃、100-180r/min下培養(yǎng)6-10天，并在培養(yǎng)過程中添加0.7-1.1g/L的四水乙酸鎂，培養(yǎng)獲得桑黃菌絲體。
其中所述步驟(1)中的桑黃菌種為在斜面培養(yǎng)基中活化后的斜面菌絲體桑黃菌株，其中斜面培養(yǎng)基為：39g馬鈴薯葡萄糖瓊脂溶于1L去離子水中滅菌后即得；
所述步驟(1)中的種子培養(yǎng)基的組分為：馬鈴薯葡萄糖肉湯24g/L，桑樹粉10g/L，pH自然；
所述步驟(2)中的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為：葡萄糖20g/L，酵母自溶粉10g/L，七水硫酸鎂1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，桑樹粉10g/L，pH自然；
所述步驟(2)中在培養(yǎng)過程中添加0.7-1.1g/L的四水乙酸鎂，可以在發(fā)酵培養(yǎng)中的第0天、第1天、第2天或第3天中的任一天添加。
發(fā)酵結(jié)束的菌絲體，于5000r/min離心10min，棄上清液，用蒸餾水洗滌離心沉淀3-4次，收集沉淀于60℃干燥至恒重。測(cè)定菌絲體中的黃酮含量，發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)高于常規(guī)方法發(fā)酵得到的菌絲體中的黃酮含量。
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有桑黃黃酮發(fā)酵產(chǎn)量不高的問題，提供了一種能顯著提高桑黃菌絲體中黃酮含量的液體發(fā)酵方法，且生產(chǎn)工藝簡單、添加物成本低廉、發(fā)酵時(shí)間相對(duì)較短，生成的桑黃菌絲體中黃酮的含量高，可應(yīng)用于桑黃黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)中。
具體實(shí)施方式
原料來源：
桑黃菌株為桑黃Sanghuangporus sanghuang(該菌株已在菌物學(xué)報(bào)，2016,35(5):1-12發(fā)表)，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所加工技術(shù)與發(fā)酵工程研究室保藏。
馬鈴薯葡萄糖瓊脂和馬鈴薯葡萄糖肉湯均購自于美國BD公司；
實(shí)施例1
(1)種子培養(yǎng)基制備：馬鈴薯葡萄糖肉湯24g/L，桑樹粉10g/L，pH自然。
(2)將斜面培養(yǎng)好的桑黃菌絲接種6-8塊(每塊面積約為0.03cm2-0.05cm2)于種子培養(yǎng)基中，于溫度26℃，轉(zhuǎn)速為150rpm下培養(yǎng)7天后，即得種子培養(yǎng)液。
(3)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，按照10％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母自溶粉10g/L，七水硫酸鎂1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，桑樹粉10g/L，pH自然)中，接種后于26℃，150rpm下培養(yǎng)6天，在發(fā)酵第0天添加四水乙酸鎂，四水乙酸鎂的添加濃度0.9g/L，收集發(fā)酵后的菌絲體。
收集到的菌絲體于5000r/min離心10min，棄上清液，用蒸餾水洗滌離心沉淀3-4次，收集沉淀于60℃干燥至恒重。
測(cè)定桑黃黃酮含量：將干燥的桑黃菌絲體研磨成粉末后，69-69mg菌絲體加入2mL體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇，于40℃超聲(40KHz，100W)中提取2小時(shí)后，提取液于10000r/min離心8min，上清液即為待測(cè)樣品溶液。加待測(cè)樣品溶液1mL于試管中(設(shè)三個(gè)重復(fù))，再加5％亞硝酸鈉溶液1mL，充分混勻放置6min后，再加10％九水硝酸鋁溶液1mL，搖勻放置6min；再加4％氫氧化鈉溶液10mL，之后用體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇定容，混勻后在510nm處測(cè)定樣品的吸光度，樣品的黃酮含量根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算可得。采用該方法測(cè)得桑黃黃酮的含量為7.48mg/100mg，與對(duì)照(不加四水乙酸鎂)的3.80mg/100mg相比，提高了96.84％。
實(shí)施例2
(1)種子培養(yǎng)基制備：馬鈴薯葡萄糖肉湯24g/L，桑樹粉10g/L，pH自然。。
(2)將斜面培養(yǎng)好的桑黃菌絲接種6-8塊(每塊面積約為0.03cm2-0.05cm2)于種子培養(yǎng)基中，于溫度26℃，轉(zhuǎn)速為150rpm下培養(yǎng)7天后，即得種子培養(yǎng)液。
(3)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，按照10％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母自溶粉10g/L，七水硫酸鎂1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，桑樹粉10g/L，pH自然)中，接種后于26℃，150rpm下培養(yǎng)6天，發(fā)酵第1天添加四水乙酸鎂，四水乙酸鎂的添加濃度0.9g/L，收集發(fā)酵菌絲體。
收集步驟(3)中發(fā)酵結(jié)束的菌絲體，于5000r/min離心10min，棄上清液，用蒸餾水洗滌離心沉淀3-4次，收集沉淀于60℃干燥至恒重。
測(cè)定桑黃黃酮含量：桑黃黃酮測(cè)定方法同實(shí)施例1。采用該方法測(cè)得桑黃黃酮的含量為8.86mg/100mg，與對(duì)照(不加四水乙酸鎂)的3.80mg/100mg相比，提高了133.16％。實(shí)施例3
(1)種子培養(yǎng)基制備：馬鈴薯葡萄糖肉湯24g/L，桑樹粉10g/L，pH自然。
(2)將斜面培養(yǎng)好的桑黃菌絲接種6-8塊(每塊面積約為0.03cm2-0.05cm2)于種子培養(yǎng)基中，于溫度26℃，轉(zhuǎn)速為150rpm下培養(yǎng)7天后，即得種子培養(yǎng)液。
(3)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，按照10％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母自溶粉10g/L，七水硫酸鎂1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，桑樹粉10g/L，pH自然)中，接種后于26℃，150rpm下培養(yǎng)6天，發(fā)酵第2天添加四水乙酸鎂，四水乙酸鎂的添加濃度為0.9g/L，收集發(fā)酵后的菌絲體。
將發(fā)酵結(jié)束的菌絲體，于5000r/min離心10min，棄上清液，用蒸餾水洗滌離心沉淀3-4次，收集沉淀于60℃干燥至恒重。
測(cè)定桑黃黃酮含量：桑黃黃酮測(cè)定方法同實(shí)施例1。采用該方法測(cè)得桑黃黃酮的含量為7.74mg/100mg，與對(duì)照(不加四水乙酸鎂)的3.80mg/100mg相比，提高了103.68％。實(shí)施例4
(1)種子培養(yǎng)基制備：馬鈴薯葡萄糖肉湯24g/L，桑樹粉10g/L，pH自然。
(2)將斜面培養(yǎng)好的桑黃菌絲接種6-8塊(每塊面積約為0.03cm2-0.05cm2)于種子培養(yǎng)基中，于溫度26℃，轉(zhuǎn)速為150rpm下培養(yǎng)7天后，即得種子培養(yǎng)液。
(3)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液，按照10％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖20g/L，酵母自溶粉10g/L，七水硫酸鎂1g/L，磷酸二氫鉀1g/L，桑樹粉10g/L，pH自然)中，接種后于26℃，150rpm下培養(yǎng)6天，發(fā)酵第3天添加四水乙酸鎂，四水乙酸鎂的添加濃度0.9g/L，收集發(fā)酵后的菌絲體。
發(fā)酵后的菌絲體，于5000r/min離心10min，棄上清液，用蒸餾水洗滌離心沉淀3-4次，收集沉淀于60℃干燥至恒重。
測(cè)定桑黃黃酮含量：桑黃黃酮測(cè)定方法同實(shí)施例1。采用該方法測(cè)得桑黃黃酮的含量為6.12mg/100mg，與對(duì)照(不加四水乙酸鎂)的3.80mg/100mg相比，提高了61.05％。