本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)：

S-腺苷蛋氨酸(SAM)和谷胱甘肽(GSH)均為生物體內(nèi)重要的含硫小分子活性化合物。

SAM由底物L(fēng)-蛋氨酸和ATP經(jīng)S-腺苷蛋氨酸合成酶(EC 2.5.1.6)酶促合成，是生物體內(nèi)重要的代謝中間物質(zhì)，參與生物體內(nèi)40多種生化反應(yīng)，具有轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)硫和轉(zhuǎn)氨丙基等作用。SAM可以通過(guò)轉(zhuǎn)硫基增加肝內(nèi)GSH、硫酸根及?；撬崴剑R床上可用于防止肝炎、脂肪肝、肝纖維化、肝硬化和肝癌，也可防止酒精、藥物和細(xì)胞素對(duì)肝臟的損傷。SAM還具有消炎、止痛的功能，對(duì)于關(guān)節(jié)炎、纖維性肌肉、偏頭痛等疾病也具有很好的治療效果，而且副作用小。早在上世紀(jì)70年代，歐洲已將SAM作為治療關(guān)節(jié)炎的處方藥使用。1999年，美國(guó)FDA批準(zhǔn)SAM作為保健品上市，在美國(guó)己成為最暢銷的營(yíng)養(yǎng)品之一。

GSH是一種廣泛存在于自然界的活性三肽化合物，是生物體內(nèi)最重要的活性巰基化合物之一，在生物體內(nèi)具有多種重要的生理功能：維持生物體適宜的氧化還原環(huán)境；保護(hù)蛋白質(zhì)的硫氫基；清除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基等。正因?yàn)镚SH在細(xì)胞內(nèi)具有如此重要的生理功能，使得其在臨床醫(yī)學(xué)、運(yùn)動(dòng)保健、食品加工等很多領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用前景。臨床方面，GSH常作為肝炎、溶血性疾病以及角膜炎、白內(nèi)障和視網(wǎng)膜疾病的輔助治療藥物。GSH對(duì)于放射線、放射性藥物或由于抗腫瘤藥物引起的白細(xì)胞減少等癥狀也能起到保護(hù)作用。同時(shí) GSH能與進(jìn)入機(jī)體的有毒化合物、重金屬離子或致癌物質(zhì)等相結(jié)合，并促其排出體外，起到中和解毒作用。最新研究還表明，GSH能夠糾正體內(nèi)乙酰膽堿、膽堿酯酶的不平衡，起到抗過(guò)敏作用，還可防止皮膚老化及色素沉著，減少黑色素的形成，改善皮膚抗氧化能力并使皮膚產(chǎn)生光澤，另外，GSH在改善性功能方面也有很好作用。近年來(lái)，西方科學(xué)家發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽也具有抑制艾滋病病毒的功能。食品加工方面，將GSH加入到面制品中，可起到還原作用，不僅使制造面包的時(shí)間大大縮短，勞動(dòng)條件大幅度改善，而且起到強(qiáng)化食品營(yíng)養(yǎng)的作用；將其加入到酸奶和嬰幼兒食品中，相當(dāng)于維生素C，可起到穩(wěn)定劑的作用；將其拌到魚糕中，可防止色澤加深；加到肉制品和干酪等食品中，具有強(qiáng)化風(fēng)味的效果。

由于SAM和GSH在多方面的作用，特別是醫(yī)藥方面的突出作用，人們對(duì)二者的需求量也迅猛增加，但目前國(guó)內(nèi)需求主要依賴進(jìn)口，且價(jià)格居高不下。

SAM和GSH的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、酶法和微生物發(fā)酵法。其中化學(xué)合成法由于具有過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)的缺陷，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。酶法合成SAM和GSH具有產(chǎn)物純度高，易提取等優(yōu)點(diǎn)，但原料腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)價(jià)格昂貴成為酶法合成SAM和GSH的限制性因素。目前酵母發(fā)酵法被認(rèn)為是SAM和GSH生物合成最有潛力的方法，然而對(duì)于發(fā)酵法生產(chǎn)SAM和GSH的已有研究中大都集中在其中一種產(chǎn)物的生產(chǎn)上，而事實(shí)上，由于SAM和GSH均是酵母細(xì)胞含硫物質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)物質(zhì)，二者在合成過(guò)程中存在著復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，值得注意的一點(diǎn)是：在SAM的分解代謝過(guò)程中會(huì)通過(guò)轉(zhuǎn)硫作用合成L-半胱氨酸，為GSH的合成提供重要前體從而促進(jìn)了GSH的合成。近年來(lái)，利用一種微生物菌株發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)SAM和GSH也逐漸引起了研究者的廣泛關(guān)注。

在SAM和GSH的生物合成過(guò)程中，ATP作為限制性底物和能 量物質(zhì)，其作用不可替代，胞內(nèi)ATP含量的多少?zèng)Q定著底物的轉(zhuǎn)化效率以及SAM和GSH能否高效合成。而在實(shí)際發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中，ATP的供應(yīng)往往不足，增加ATP的供應(yīng)能夠提高SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)產(chǎn)量。在產(chǎn)朊假絲酵母消耗葡萄糖的好氧代謝過(guò)程中，細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生的還原態(tài)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)只有跨過(guò)線粒體膜進(jìn)入線粒體中才能最終被氧化產(chǎn)生ATP。截止到目前，針對(duì)SAM和GSH合成菌株的遺傳改造主要集中于SAM合成酶基因和GSH合成酶基因的過(guò)量表達(dá)上。

有鑒于上述的缺陷，本設(shè)計(jì)人，積極加以研究創(chuàng)新，以期創(chuàng)設(shè)一種提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)量的方法，使其更具有產(chǎn)業(yè)上的利用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)量的方法，該方法提高線粒體膜通透性，促進(jìn)NADH進(jìn)入線粒體，增強(qiáng)通過(guò)呼吸鏈合成ATP的效率，最終實(shí)現(xiàn)酵母胞內(nèi)SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)產(chǎn)量的提高。

本發(fā)明的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)量的方法，包括以下步驟：采用產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis CCTCC M 209298，以下簡(jiǎn)稱C.utilis)為出發(fā)菌株，敲除其線粒體膜上膜孔蛋白基因(Por1)后獲得突變菌株(C.utilisΔPor1)，并利用所述突變菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

進(jìn)一步的，敲除所述Por1基因包括Por1基因上、下游片段、三磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)的啟動(dòng)子序列以及kan基因片段重組的步驟。

進(jìn)一步的，所述敲除技術(shù)包括以下步驟：

(1)以釀酒酵母的GAP的啟動(dòng)子序列(其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)為模板，比對(duì)找出C.utilis的GAP啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)引物 GAP-for和GAP-rev，以C.utilis基因組為模板擴(kuò)增出C.utilis的GAP啟動(dòng)子序列，

其中，GAP-for的核苷酸序列為：GGATCCAAGCTTACAGCGAGCACTCA；

GAP-rev的核苷酸序列為：CCATGGTGAGTGCTCGCTGTAAGCTT；

(2)將擴(kuò)增出的GAP啟動(dòng)子片段與含kan基因片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切、連接、轉(zhuǎn)化后，拼接到一起后，設(shè)計(jì)引物Kan-for和Kan-rev，進(jìn)行重疊PCR，獲得到GAP-kan片段，

其中Kan-for的核苷酸序列為：TCAGCTTTGAGACCTGGGGTCAAAGCATCAGATCCAAGCTTACAGCGAGCACTCAAAT；

Kan-rev的核苷酸序列為：GCCTTTTTTGCCCTCGAGCTGTTTTCTTAGGCCTGGGACCCGTGGGCCGCCGTCGGAC；

(3)找出C.utilis的Por1基因位置，調(diào)出其上、下游各1000bp的片段，設(shè)計(jì)引物por1up-for、por1up-rev和por1down-for、por1down-rev，以C.utilis基因組為模板，分別擴(kuò)增出Por1基因上、下游片段Por1-up和Por1-down(其核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示)，其中，por1up-for的核苷酸序列為：TGAAGGCTGAAGAAAATGTTGTCGC；

por1up-rev的核苷酸序列為：ATTTGAGTGCTCGCTGTAAGCTTGGATCTGATGCTTTGACCCCAGGTCTCAAAGCTGA；

por1down-for的核苷酸序列為：GTCCGACGGCGGCCCACGGGTCCCAGGCCTAAGAAAACAGCTCGAGGGCAAAAAAGGC；

por1down-rev的核苷酸序列為：CAGGTTCCATTCGGTGGTTACAAGG；

(4)將所述Por1-up、Por1-down和GAP-kan三片段按摩爾比1:0.8-1.2:0.8-1.2的比例混合后，利用引物por1up-for、por1down-rev 進(jìn)行overlap PCR，獲得Por1基因敲除組件Por1-up-GAP-kan-Por1-down；

(5)利用電轉(zhuǎn)化法將Por1基因敲除組件轉(zhuǎn)入C.utilis感受態(tài)細(xì)胞中，在斜面培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性單克??；

(6)將獲得的單克隆進(jìn)行復(fù)蘇，提取基因組，在Por1基因上游同源臂片段Por1-up上游、下游同源臂片段Por1-down下游以及kan基因中間設(shè)計(jì)引物up-for、up-rev和down-for、down-rev，進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證，驗(yàn)證均正確的突變菌株即為構(gòu)建成功的Por1基因敲除菌株，

其中，up-for的核苷酸序列為：AAGTGTTAAAAATGTAAACAAAGCA；

up-rev的核苷酸序列為：CACACCGGACGGGGGCCACTACATC；

down-for的核苷酸序列為：GATGTAGTGGCCCCCGTCCGGTGTG；

down-rev的核苷酸序列為：GTTGGATCAACACTTACAACGATCT。

進(jìn)一步的，所述突變菌株經(jīng)活化、培養(yǎng)獲得種子培養(yǎng)液后進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

進(jìn)一步的，所述突變菌株經(jīng)種子培養(yǎng)活化4-6小時(shí)。

進(jìn)一步的，活化后的所述突變菌株接入裝有種子培養(yǎng)基的容器中振蕩培養(yǎng)20-28小時(shí)，獲得種子培養(yǎng)液。

進(jìn)一步的，所述種子培養(yǎng)溫度為25-35℃，搖床轉(zhuǎn)速180-230rpm。

進(jìn)一步的，所述種子培養(yǎng)液接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的容器中或發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)20-40小時(shí)。所述發(fā)酵培養(yǎng)基溫度為25-35℃，搖床轉(zhuǎn)速為180-230rpm；所述發(fā)酵罐的培養(yǎng)溫度為25-35℃，攪拌轉(zhuǎn)速為300-400rpm，通氣量為2-4L/min，pH值為4.8-5.2。

進(jìn)一步的，所述種子培養(yǎng)液的接種量為9-11％(v/v)。

本發(fā)明的提高S-腺苷蛋氨酸和谷胱甘肽聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)量的方法在真核細(xì)胞內(nèi)通過(guò)耗能好氧代謝合成化合物中的應(yīng)用。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明采用基因敲除手段對(duì)C.utilis細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造，獲得了線粒體膜上膜孔蛋白基因Por1敲除的突變菌株C.utilisΔPor1，使NADH通往呼吸鏈的效率增強(qiáng)，提高了ATP的合成速率，促進(jìn)了SAM和GSH在產(chǎn)朊假絲酵母胞內(nèi)的合成和積累；為SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化增添了新的方法；同時(shí)也為真核細(xì)胞內(nèi)類似耗能合成化合物的高產(chǎn)提供了新的思路。

上述說(shuō)明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說(shuō)明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明如后。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明中原始菌株(WT)和突變菌株(2A)進(jìn)行PCR驗(yàn)證結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例中的培養(yǎng)基：

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、遺傳霉素0.1g/L、瓊脂粉15g/L、pH值6.0。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、pH值6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖35g/L、硫酸銨10g/L、磷酸二氫鉀12.3g/L、L-蛋氨酸4.6g/L、硫酸鎂0.05g/L、氯化鈣0.05g/L、pH5.0。

實(shí)施例一：利用原始菌株C.utilis CCTCC M 209298(WT)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將原始菌株C.utilis CCTCC M 209298按10％(v/v)的接種量接種到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃，200rpm下?lián)u床培養(yǎng)30小時(shí)。

酵母生物量的測(cè)定：以細(xì)胞干重(DCW)表示酵母生物量。取10mL發(fā)酵液，4000rpm下離心5min，蒸餾水離心洗滌3次，收集菌體，70℃烘干至恒重。

胞內(nèi)GSH的提取及測(cè)定：發(fā)酵培養(yǎng)得到的新鮮酵母用蒸餾水洗滌3次后，30℃下在40％乙醇溶液中處理2小時(shí)，離心取上清液作為待測(cè)樣品。樣品中的GSH濃度采用5,5'-二硫雙(2-硝基苯甲酸)[DTNB]-谷胱甘肽還原酶循環(huán)法進(jìn)行測(cè)定。

胞內(nèi)SAM的提取及測(cè)定：發(fā)酵培養(yǎng)得到的新鮮酵母用蒸餾水洗滌3次后，在4℃下用0.35mol/L稀硫酸處理2小時(shí)，離心，上清液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾作為待測(cè)樣品。SAM濃度采用HPLC法測(cè)定，流動(dòng)相為0.5mol/L甲酸銨溶液(pH 4.0)，流速1mL/min，柱溫25℃

經(jīng)測(cè)試，利用原始菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

細(xì)胞干重：11.53-11.89g/L；SAM產(chǎn)量：130.5-137.7mg/L；GSH產(chǎn)量：157.5-163.1mg/L；SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)產(chǎn)量：288.2-300.8mg/L；胞內(nèi)SAM含量：1.12-1.25％；胞內(nèi)GSH含量：1.29-1.37％。

實(shí)施例二：利用突變菌株C.utilisΔPor1(2A)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

實(shí)施例中的引物序列如下列表1所示：

表1：引物序列表

1、產(chǎn)朊假絲酵母線粒體膜上Por1基因的敲除

(1)在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到C.utilis的全基因組序列，以釀酒酵母的GAP啟動(dòng)子序列為模板，比對(duì)找出C.utilis的GAP啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)引物GAP-for、GAP-rev，以C.utilis CCTCC M 209298基因組為模板擴(kuò)增出C.utilis的GAP啟動(dòng)子序列，片段大小1000bp左右；

(2)將擴(kuò)增出的GAP啟動(dòng)子片段與含kan基因片段的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切、連接、轉(zhuǎn)化后，拼接到一起后，利用引物kan-for、kan-rev進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，獲得到GAP-kan片段，片段大小1800bp左右；

(3)找出Por1基因的位置，調(diào)出Por1基因上、下游各1000bp的片段，設(shè)計(jì)引物por1up-for、por1up-rev和por1down-for、por1down-rev，以C.utilis CCTCC M 209298基因組為模板，分別擴(kuò)增出Por1基因上、下游片段Por1-up和Por1-down，片段大小均為1000bp左右；

(4)再將Por1-up、Por1-down和GAP-kan三片段按摩爾比1:1:1的比例混合后，利用引物por1up-for、por1down-rev進(jìn)行overlap PCR，獲得Por1基因敲除組件Por1-up-GAP-kan-Por1-down，片段大小3800bp左右；

(5)利用電轉(zhuǎn)化法將Por1基因敲除組件轉(zhuǎn)入C.utilis CCTCC M 209298感受態(tài)細(xì)胞中，在含有100mg/L的遺傳霉素(G418)的種子培養(yǎng)基平板上進(jìn)行培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性單克隆；

(6)將獲得的單克隆進(jìn)行復(fù)蘇，提取基因組。在Por1基因上游同源臂片段Por1-up上游，下游同源臂片段Por1-down下游，以及kan基因中間設(shè)計(jì)引物up-for、up-rev和down-for、down-rev，進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示，結(jié)果顯示，原始菌株(WT)上下游均為出現(xiàn)條帶，而突變菌株(2A)上下游均出現(xiàn)條帶，條帶大小基本與目標(biāo)條帶一致，故GAP-kan片段成功插入Por1基因上、下游(2A-up和2A-down)之間，將Por1基因替換。將2A-up和2A-down測(cè)序拼接后，測(cè)序驗(yàn)證也與原導(dǎo)入序列一致，進(jìn)一步說(shuō)明GAP-kan片段成功將Por1基因替換。因此，2A為所需要的Por1基因敲除菌株，其中2A-up和2A-down的核苷酸序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

2、種子活化、培養(yǎng)

突變菌株在種子培養(yǎng)基中活化4小時(shí)后接入裝有50mL種子培養(yǎng) 基的500mL三角瓶中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，培養(yǎng)時(shí)間24小時(shí)，獲得種子培養(yǎng)液。

3、搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，其方法步驟與實(shí)施例一中相同，其區(qū)別在于將新鮮種子培養(yǎng)液按10％(v/v)的接種量接種到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中。

采用與實(shí)施例一相同的酵母生物量測(cè)定、胞內(nèi)GSH的提取及測(cè)定、胞內(nèi)SAM的提取及測(cè)定方法，經(jīng)測(cè)試，利用突變菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

細(xì)胞干重：11.07-11.70g/L；SAM產(chǎn)量：150.5-160.6mg/L；GSH產(chǎn)量：185.8-195.5mg/L；SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)產(chǎn)量：336.3-356.1mg/L；胞內(nèi)SAM含量：1.31-1.45％；胞內(nèi)GSH含量：1.67-1.73％。

實(shí)施例三：利用原始菌株C.utilis CCTCC M 209298分批發(fā)酵培養(yǎng)

將原始菌株C.utilis CCTCC M 209298按10％(v/v)的接種量接種至5L發(fā)酵罐(BIOTECH-5BGZ，上海保興生物設(shè)備工程有限公司)中，裝液量3L，接種量10％，溫度30℃，攪拌轉(zhuǎn)速350rpm，通氣量3L/min，pH 5.0，培養(yǎng)時(shí)間30小時(shí)。

采用與實(shí)施例一相同的酵母生物量測(cè)定、胞內(nèi)GSH的提取及測(cè)定、胞內(nèi)SAM的提取及測(cè)定方法，經(jīng)測(cè)試，利用原始菌株分批發(fā)酵培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

細(xì)胞干重：12.67～12.99g/L；SAM產(chǎn)量：184.7～194.1mg/L；GSH產(chǎn)量：205.8～216.9mg/L；SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)產(chǎn)量：390.5～411.0mg/L；胞內(nèi)SAM含量：1.55～1.63％；胞內(nèi)GSH含量：1.63～1.69％。

實(shí)施例四：利用突變菌株C.utilisΔPor1分批發(fā)酵培養(yǎng)

1、產(chǎn)朊假絲酵母線粒體膜上Por1基因的敲除、其方法步驟與實(shí)施例二中相同。

2、種子活化、培養(yǎng)，其方法步驟與實(shí)施例二中相同。

3、分批發(fā)酵培養(yǎng)，其方法步驟與實(shí)施例三中相同，其區(qū)別在于：將新鮮種子培養(yǎng)液接種至5L發(fā)酵罐(BIOTECH-5BGZ，上海保興生物設(shè)備工程有限公司)中。

采用與實(shí)施例一相同的酵母生物量測(cè)定、胞內(nèi)GSH的提取及測(cè)定、胞內(nèi)SAM的提取及測(cè)定方法，經(jīng)測(cè)試，利用突變菌株分批發(fā)酵培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

細(xì)胞干重：14.16～14.88g/L；SAM產(chǎn)量：237.0～249.2mg/L；GSH產(chǎn)量：286.7～301.4mg/L；SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)產(chǎn)量：523.7～549.6mg/L；胞內(nèi)SAM含量：1.78～1.87％；胞內(nèi)GSH含量：2.06～2.17％。

綜上所述，本發(fā)明采用基因敲除手段對(duì)C.utilis細(xì)胞進(jìn)行遺傳改造，通過(guò)與采用原始菌株的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比，采用突變菌株的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：線粒體膜上Por1基因的敲除促進(jìn)了SAM和GSH在C.utilis胞內(nèi)的合成和積累；為SAM和GSH聯(lián)產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化增添了新的方法；同時(shí)也為真核細(xì)胞內(nèi)類似耗能合成化合物的高產(chǎn)提供了新的思路。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。