重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-20的基因克隆、表達(dá)及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種表達(dá)和生產(chǎn)FGF-20的方法。通過(guò)生物信息學(xué)手段優(yōu)化設(shè)計(jì)合成FGF-20核苷酸序列全長(zhǎng)，將其與pET系列載體相連接，并將該表達(dá)載體連接導(dǎo)入適當(dāng)?shù)拇竽c桿菌宿主細(xì)胞中，通過(guò)篩選獲得表達(dá)量高且穩(wěn)定遺傳的工程菌株，并建立了高密度發(fā)酵方法和包涵體表達(dá)FGF-20的純化方法及建立相應(yīng)質(zhì)量檢測(cè)方法，使大規(guī)模生產(chǎn)rhFGF-20成為可能。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討FGF-20在組織修復(fù)、退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的臨床應(yīng)用及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及遷移中的作用。
【專利說(shuō)明】重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-20的基因克隆、表達(dá)及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種優(yōu)化的生產(chǎn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因 子-20 (FGF-20)的方法，以及用于該方法的表達(dá)載體、宿主，表達(dá)、純化方法及可能的臨床 應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Fibroblast Growth Factor, FGF)是一類廣泛存在于多種 組織中的多肽細(xì)胞生長(zhǎng)因子，目前已發(fā)現(xiàn)23個(gè)成員，分子量為16kD?34kD，其中心區(qū)域含 有高度同源性（30%?70% )的大約120個(gè)氨基酸序列，對(duì)來(lái)源于中胚層和神經(jīng)外胚層的 多種類型細(xì)胞具有廣泛的生物學(xué)活性。FGFs在體內(nèi)含量甚微但分布廣泛，其中大多數(shù)FGFs 成員與胚胎發(fā)育、組織損傷修復(fù)、神經(jīng)保護(hù)和營(yíng)養(yǎng)、腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，具 有廣泛的應(yīng)用前景。
[0003] FGF-20是FGF家族的一個(gè)新成員，屬FGF9亞家族（FGF9、FGF16、FGF20)，是通過(guò) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體分泌途徑產(chǎn)生的，在組織維修和傷口愈合中發(fā)揮著重要和廣泛的作用， 近年來(lái)，研究其在神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)和治療及遺傳性耳聾疾病的發(fā)生成為研發(fā)的熱點(diǎn)。2000 年，日本科學(xué)家Shigeki Ohmachi首次從老鼠大腦中發(fā)現(xiàn)FGF-20mRNA在腦組織尤其是小 腦組織黑質(zhì)致密部表達(dá)量最高，預(yù)示其是對(duì)神經(jīng)元具有保護(hù)作用的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。人 FGF-20基因定位于人類染色體8p21. 3-p22區(qū)域，由3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子組成，編碼211 氨基酸殘基組成的多肽，分子質(zhì)量約為25kDa，為一種堿性蛋白。人FGF-20與老鼠的氨基 酸序列具有95%的高度同源性。在結(jié)構(gòu)上，F(xiàn)GF20與FGF9、FGF16相似，其同源性分別70% 和62%，均缺乏典型的N端信號(hào)序列，都能分泌到細(xì)胞外。體外和體內(nèi)的多項(xiàng)研究表明， FGF-20在分化發(fā)育、血管生成、腫瘤形成和其他細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用。
[0004] FGF-20在組織修復(fù)方面有良好的應(yīng)用前景。與大多數(shù)FGFs成員相同，F(xiàn)GF-20 能與一系列FGFR特異性結(jié)合，具有促上皮和間質(zhì)細(xì)胞有絲分裂的功能。與目前已上市的 FGF-UFGF-2功能相似，可開(kāi)發(fā)成為治療燒燙傷及慢性潰瘍創(chuàng)面的外用藥物。同時(shí)，經(jīng)研究 發(fā)FGF-20對(duì)組織粘膜損傷修復(fù)具有良好的功效。JefTers等研究FGF-20對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎 和炎癥性腸病動(dòng)物模型的作用，發(fā)現(xiàn)預(yù)防劑量的FGF-20能有效地減少黏膜損傷的范圍和 減輕黏膜損害的嚴(yán)重程度；Alvarez等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-20對(duì)放化療誘發(fā)的口腔粘膜炎同樣 具有治療作用；Maclachlan等研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-20能夠明顯增加致命劑量電離輻射后小鼠的 生存率?？梢灶A(yù)期，F(xiàn)GF-20在潰瘍性結(jié)腸炎、炎癥性腸病、口腔粘膜炎及放療輻射預(yù)防等臨 床方向具有巨大的應(yīng)用前景。目前，美國(guó)CuraGen公司研發(fā)的新型生長(zhǎng)因子FGF-20,已被 FDA批準(zhǔn)用于治療因放療引起的口腔粘膜炎（OM)的罕見(jiàn)病用藥，并已完成I期臨床研究。 (Jeffers M et al. Gastroenterology,2002,123(4) :1151-1162 ；Alvarez E et al.Clin Cancer Res,2003,9 (9) :3454-3461 ；Maclachlar T et al. Int J Radiat Biol,2005, 81(8) :567-579 ；Beenken A et al. Nat Rev Drug Discov. 2009Mar ；8 (3) :235-53.)
[0005] FGF-20在帕金森癥等退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療有良好的應(yīng)用前景。帕金森 癥（PD)是一種黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性缺失所引起的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，患病率在 10-405/10萬(wàn)之間，是目前一種嚴(yán)重和常見(jiàn)的中老年人神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其發(fā)病機(jī)制中遺 傳因素的作用越來(lái)越受到人們的重視。臨床針對(duì)ro患者基因組篩查發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF-20正好位 于與ro關(guān)系最密切的8號(hào)染色體短臂連鎖區(qū)域，且其編碼的蛋白在正常腦組織中具有明顯 的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)特性；FGF-20蛋白在正常腦組織尤其是在小腦中有表達(dá)，可能對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng) 的發(fā)育具有調(diào)節(jié)作用；在體外細(xì)胞培養(yǎng)中添加 FGF-20可顯著提高多巴胺能細(xì)胞的存活能 力，促進(jìn)細(xì)胞分化為多巴胺能神經(jīng)元。這些現(xiàn)象皆提示FGF-20在神經(jīng)退行性病變過(guò)程中 可能發(fā)揮重要作用。Ohmachi等將重組FGF-20蛋白作用于小鼠，發(fā)現(xiàn)其中腦多巴胺神經(jīng)元 存活率顯著提高而其他神經(jīng)元的存活率無(wú)明顯變化，表明FGF-20是一種對(duì)多巴胺神經(jīng)元 具有選擇性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；Takagi等研究表明，培養(yǎng)基中添加 FGF-20,可增加 Nurrl細(xì) 胞分化成酪氨酸羥化酶陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)元的能力，并將其移植到猴子帕金森病模型，行為 學(xué)和功能學(xué)等均有顯著治療效果；有報(bào)道稱FGF20和MAOB基因的SNP多態(tài)性存在相互作 用，二者同樣參與多巴胺生物旁路，在的遺傳機(jī)制中具有重要意義?？梢灶A(yù)期，F(xiàn)GF-20 在治療帕金森癥、阿爾次海墨癥等退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療具有巨大的臨床應(yīng)用前景。 (Scott WK et al. JAMA,2001,286(18) :2239-2244 ；Jeffers M et al. Cancer Res,2001, 61(7) :3131-3138 ；de Mena L et al. Neurosci Lett,2010,479(I) :22-25 ；Rideout HJ et al. Neurochem,2003,84(4) :803-813 ：Tabares-Seisdedos R et al. Mol Psychiatry, 2009,14(6) :563-589 ；Shigeki Ohmachi et al. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000,277 :355-360 ；Takagi Y et al. J Clin Invest, 2005,115 (I)： 102-109 ;Gao X et al. Ann Hum Genet,2008,72(pt2) :157-162.)
[0006] FGF-20在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及遷移中的作用。FGF-20在異常表達(dá)時(shí)能與細(xì)胞表面 的酪氨酸激酶型受體 FGFR2a (Illb)、FGFR2a (IIIc)、FGFR2P (IIIb)和 FGFR3a (IIIc) 發(fā)生特異性結(jié)合，通過(guò)MPK途徑引起細(xì)胞DNA合成以及細(xì)胞增殖。值得關(guān)注的是，F(xiàn)GF-20 與其他家族成員相比，還具有血管生成源性，參與腫瘤新生血管的形成，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展 中起重要作用。Jeffers等研究表明，將攜帶有FGF-20的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入NIH 3T3細(xì)胞，發(fā) 現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了改變，隨后將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞注射裸鼠，結(jié)果均出現(xiàn)快速生長(zhǎng)的 腫瘤；Chamorro等做了相反方向的實(shí)驗(yàn)，即采用RNA干擾技術(shù)封閉FGF-20基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn) RK3E細(xì)胞克隆顯著減少，非錨定性生長(zhǎng)特征消失，出現(xiàn)接觸抑制。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)FGF-20 轉(zhuǎn)錄水平受到與許多人類惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的Wm/B-鏈蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)，說(shuō) 明FGF-20表達(dá)與腫瘤形成有密切關(guān)系。目前已證實(shí)，在絕大多數(shù)人腫瘤細(xì)胞株中均異常 表達(dá)FGF-20,其中在肺癌、結(jié)直腸癌和胃癌細(xì)胞中異常高表達(dá)，并可能是參與腫瘤病理過(guò) 程的主要因素，與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為腫瘤診斷和治療的靶分子具有廣闊的 前景。（Engstrom W et al. An ticancer Res，2006,26 (5A) :3307-3310 ;Polnaszek N et al. C ancer Res,2003,63(18) :5754-5760 ；Jeffers M et al. Cancer Res,2001,61(7)： 3131-3138 ；Chamorro MN et aI. EMBO J,2005,24(I) :73-84 ；Katoh M et al. Onco I Rep, 2005,14(1) :287-290 ；Mario N Chamorro et al. The EMBO Journal,2005,24 :73-84.)
[0007] 由于FGF-20的發(fā)現(xiàn)對(duì)于退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病、組織修復(fù)及腫瘤方面有著重要意 義，其研究以及臨床應(yīng)用的前景口益受到人們的關(guān)注。FGF-20作為新型的生長(zhǎng)因子，目前國(guó) 內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。本申請(qǐng)專利，通過(guò)基因優(yōu)化、表達(dá)載體和宿主菌的篩選，進(jìn)而獲得大腸 桿菌的高效表達(dá)菌株；利用流加補(bǔ)料的方式建立了規(guī)模化的高密度培養(yǎng)技術(shù)；優(yōu)化包涵體 清洗、變性及復(fù)性方法，通過(guò)陽(yáng)離子交換柱層析、肝素柱層析（IIeparin Sepharose CL-6B) 或金屬離子螯合柱層析（Chelating Sepharose Fast Flow)及其組合,最終獲得蛋白純度 超過(guò)95%并具有高生物學(xué)活性的？6?-20重組蛋白，為進(jìn)一步開(kāi)展？6?-20相關(guān)作用機(jī)制研 究和新藥開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便并且高效的生產(chǎn)FGF-20的方法。
[0009] 本發(fā)明的目的還在于提供含有編碼FGF-20基因的載體或質(zhì)粒。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供用于該方法的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先將FGF-20的天然序列按照大腸桿菌偏好性進(jìn)行優(yōu) 化，在不改變其氨基酸序列的前提下，設(shè)計(jì)合成rhFGF-20的全長(zhǎng)序列。同時(shí)本發(fā)明提供 了篩選優(yōu)化的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的組合，如pET3a、pET3c、pET28a表達(dá)載體及對(duì)應(yīng)的 BL21 (DE3) plysS、Transetta (DE3)宿主細(xì)胞，并構(gòu)建了高效穩(wěn)定表達(dá)的工程菌株。
[0012] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供了一種生產(chǎn)重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-20的方法，通過(guò)優(yōu) 化培養(yǎng)基、控制參數(shù)及補(bǔ)料流加策略，建立了規(guī)模化的高密度培養(yǎng)方法，最后通過(guò)柱層析分 離純化得到高純度和活性的rhFGF-20。具體包括如下步驟：
[0013] (1)通過(guò)改良種子培養(yǎng)基對(duì)工程菌進(jìn)行活化和擴(kuò)增，接種至發(fā)酵罐中通過(guò)優(yōu)化控 制參數(shù)及采用流加補(bǔ)料的方式進(jìn)行規(guī)?；母呙芏扰囵B(yǎng)，優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)時(shí)間高效表 達(dá)外源蛋白FGF-20 ;
[0014] (2)優(yōu)化裂解溶液并通過(guò)高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行菌體破碎，低溫高速離心棄上清收沉淀； 優(yōu)化包涵體清洗、變性及復(fù)性方法與步驟，并通過(guò)中空纖維超濾裝置進(jìn)行初步分離純化；
[0015] (3)通過(guò)柱層析進(jìn)行精細(xì)分離純化，具體包括：陽(yáng)離子交換柱層析（SP S^harose Fast Flow或CM Sepharose Fast Flow)、肝素柱層析（Heparin Sepharose CL-6B)或金屬 離子螯合柱層析（Chelating Sepharose Fast Flow)及其組合。
[0016] 所述的高密度培養(yǎng)方法是：
[0017] (1)罐內(nèi)培養(yǎng)基優(yōu)化：降低底物濃度，優(yōu)化培養(yǎng)基配伍組成，如降低底物中碳源 含量，添加無(wú)機(jī)鹽、微量元素、促生長(zhǎng)因素等營(yíng)養(yǎng)成分提供全面營(yíng)養(yǎng)，并保護(hù)質(zhì)粒的穩(wěn)定遺 傳；
[0018] (2)控制參數(shù)優(yōu)化：通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后關(guān)鍵控制參數(shù)，如溫度、pH值、溶解 氧、轉(zhuǎn)數(shù)及誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘導(dǎo)時(shí)間等，獲得高產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)指標(biāo)合理的生產(chǎn)工藝；
[0019] (3)流加補(bǔ)料方法：優(yōu)化流加補(bǔ)料的營(yíng)養(yǎng)成分，采用不同流加補(bǔ)料策略，如變速補(bǔ) 料、DO-stat法或pH-stat法，降低底物對(duì)工程菌生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成的抑制，延長(zhǎng)工程菌的對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)周期，有效提高產(chǎn)量及表達(dá)量，提高了設(shè)備有效利用率高、降低生產(chǎn)成本，并對(duì)發(fā)酵 過(guò)程實(shí)現(xiàn)了優(yōu)化控制。
[0020] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0021] (1)通過(guò)對(duì)FGF-20核苷酸序列進(jìn)行優(yōu)化及適宜的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的組合，獲 得高效穩(wěn)定表達(dá)的工程菌株；
[0022] (2)通過(guò)建立高密度培養(yǎng)方法，可使FGF-20的表達(dá)水平達(dá)到菌體總蛋白的25%以 上，菌體產(chǎn)量達(dá)70g/L發(fā)酵液以上；
[0023] (3)外源蛋白以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)量高且破碎與純化過(guò)程中不易被降解；進(jìn) 一步建立了包涵體清洗、變性復(fù)性和柱層析方法，簡(jiǎn)化了純化步驟，提高了蛋白及活性收 率。蛋白收率達(dá)150mg/L發(fā)酵液以上，蛋白純度高于95%以上。
[0024] (4)建立了 FGF-20活性測(cè)定方法。生物學(xué)活性是反映重組蛋白質(zhì)量及功效的重要 指標(biāo)，本發(fā)明建立了用NIH3T3細(xì)胞株進(jìn)行FGF-20促增殖作用的活性測(cè)定方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 呈典型的S型曲線，并在一定范圍內(nèi)具有劑量依賴性，顯示出良好的重復(fù)性和可靠性。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖lpET3c_FGF20重組載體圖
[0026] 圖 2pET28a_FGF20 重組載體圖
[0027] 圖3FGF-20發(fā)酵表達(dá)SDS-PAGE電泳分析
[0028] 圖4CM柱層析SDS-PAGE電泳分析
[0029] 圖5親和柱層析SDS-PAGE電泳分析
[0030] 圖6MTT法測(cè)定FGF-20蛋白對(duì)NIH3T3細(xì)胞的促增殖生物學(xué)活性

【具體實(shí)施方式】
[0031] 實(shí)施例1FGF-20蛋白高效表達(dá)工程菌的構(gòu)建
[0032] 根據(jù)GenBank中公布的人FGF-20天然序列（登錄號(hào)：BC098128. 1)和氨基酸序列， 按照大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，在不改變氨基酸序列的條件下，設(shè)計(jì)rhFGF-20的編 碼序列引物。通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法獲得rhFGF-20的全長(zhǎng)核苷酸序列。在rhFGF-20優(yōu)選序 列的5'端與3'端分別加起始密碼子和終止密碼子，并引入特異性酶切位點(diǎn)Nde I和BamH I，再用NdeI和BamHI雙酶切分別處理rhFGF-20基因和表達(dá)載體pET3a-c (或pET28a)，37°C 酶切3h?4h后回收相應(yīng)的片段，用T4DNA連接酶16°C連接過(guò)夜，構(gòu)建重組表達(dá)載體（見(jiàn)圖 1、圖2)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌Transetta(DE3)(或BL21(DE3)plysS)，在含有載體 抗性的的LB平板上挑選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切鑒定及菌落PCR檢定，證實(shí)表達(dá)序列已 正確插入載體中。委托基因測(cè)序公司進(jìn)行正向、逆向序列分析測(cè)定，證實(shí)克隆序列與設(shè)計(jì)序 列完全一致。進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，誘導(dǎo)后測(cè)定目的蛋白表達(dá)量占總蛋白25%左右，并進(jìn)行免疫印 跡（Western Blot)檢測(cè)呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，證實(shí)所表達(dá)的重組外源蛋白為FGF-20。進(jìn)行工程菌 穩(wěn)定性試驗(yàn)，連續(xù)傳代50次，檢測(cè)其質(zhì)粒穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和表達(dá)穩(wěn)定性，并證實(shí)獲得了 高效表達(dá)、遺傳穩(wěn)定的FGF-20工程菌株，為下一步試驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。本工程菌將目 的基因插入含Lac操縱子的誘導(dǎo)的pET系列表達(dá)載體中，再轉(zhuǎn)化與表達(dá)載體相容的大腸桿 菌宿主菌，可利用IPTG或乳糖進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
[0033] 實(shí)施例2FGF-20蛋白高密度培養(yǎng)方法的建立
[0034] 在本發(fā)明中，工程菌表達(dá)rhFGF-20的發(fā)酵條件沒(méi)有特別限制。可以采用本領(lǐng)域常 規(guī)的發(fā)酵條件。通常，工程菌在以胰蛋白胨、酵母粉、銨鹽等為氮源，葡萄糖、甘油等為碳源， 磷酸鹽為緩沖體系組成，并輔以硫酸鎂、氯化鈉及微量元素和添加維生素作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基； 并通過(guò)控制參數(shù)（pH、溫度、溶解氧、攪拌速度等）的調(diào)節(jié)及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流加，監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中 的葡萄糖含量和尾氣分析，調(diào)節(jié)產(chǎn)物比生長(zhǎng)速率，減少乙酸的積累，延長(zhǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)周期，顯 著提高了菌體產(chǎn)量及表達(dá)水平。具體為：將FGF-20工程菌株以I : 200?300接種至LB 培養(yǎng)基中進(jìn)行活化制備一代種子，培養(yǎng)3h?4h，待A_達(dá)到0. 8?I. 0左右，按I : 10? 20的比例接種至含有磷酸鹽緩沖對(duì)的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增制備二代種子，培養(yǎng)8h?10h， 待八_達(dá)到4?8左右，按I : 10?20的比例接種至含有罐內(nèi)培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，以溫度 35°〇?371：4!1值6.8?7.0、攪拌轉(zhuǎn)數(shù)200印111?600印111、00>25%并輔以營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流 加方式進(jìn)行培養(yǎng)4h?6h。待A_達(dá)到20?25,流加加人誘導(dǎo)劑（IPTG)至終濃度ImM進(jìn) 行誘導(dǎo)。調(diào)節(jié)誘導(dǎo)后溫度為33°C?35°C、pH值7. 0?7. 2、攪拌轉(zhuǎn)數(shù)600rpm?300rpm、D0 > 30%并輔以流加碳源、氮源及磷酸鹽緩沖溶液的流加方式進(jìn)行表達(dá)4h?6h。低溫高速 離心，菌體-20°C凍存，樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)并測(cè)定表達(dá)量（見(jiàn)圖3)。
[0035] 表1各階段培養(yǎng)基組成
[0036]

【權(quán)利要求】
1. 一種源至pET3a-C或pET28a(+)的原核表達(dá)載體，其含有編碼FGF-20的重組DNA， 其中所述編碼FGF-20的核苷酸序列見(jiàn)核苷酸或氨基酸序列表所示。
2. 含有權(quán)利要求1所述表達(dá)載體的大腸桿菌BL21 (DE3) plysS或Transetta (DE3)。
3. -種生產(chǎn)FGF-20的方法，通過(guò)培養(yǎng)權(quán)利要求2所述的宿主細(xì)胞，并加誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表 達(dá)FGF-20，并進(jìn)一步通過(guò)分離純化獲得高純度的FGF-20蛋白。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟： (1) 通過(guò)改良種子培養(yǎng)基對(duì)權(quán)利要求2所述的工程菌進(jìn)行活化和擴(kuò)增，接種至發(fā)酵罐 中通過(guò)優(yōu)化控制參數(shù)及采用流加補(bǔ)料的方式進(jìn)行規(guī)?；母呙芏扰囵B(yǎng)，優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)機(jī)和誘 導(dǎo)時(shí)間高效表達(dá)外源蛋白FGF-20 ; (2) 優(yōu)化裂解溶液并通過(guò)高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行菌體破碎，低溫高速離心棄上清收沉淀；優(yōu) 化包涵體清洗、變性及復(fù)性方法與步驟，并通過(guò)中空纖維超濾裝置進(jìn)行初步分離純化； (3) 通過(guò)柱層析進(jìn)行精細(xì)分離純化，具體包括：陽(yáng)離子交換柱層析（SP Sepharose Fast Flow 或 CM Sepharose Fast Flow)、肝素親和柱層析（Heparin Sepharose CL-6B)或金屬 離子螯合柱層析（Chelating Sepharose Fast Flow)及其組合。
5. 根據(jù)專利權(quán)要求1?4所述制備的FGF-20,其特征是，可應(yīng)用于皮膚或黏膜損傷的 組織修復(fù)、治療帕金森或阿爾次海墨癥等退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病。還可制備成不同制劑，應(yīng)用 于生物美容及燒燙傷、難愈性潰瘍的治療。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104293821SQ201410403065
【公開(kāi)日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年8月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月13日
【發(fā)明者】田海山, 李校堃, 姜潮, 馬吉?jiǎng)? 趙央, 鄭婕 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)科大學(xué), 浙江格魯斯特生物科技有限公司