專利名稱：一種survivin及其突變體轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物分子功能研究、生物制藥與酶工程領(lǐng)域，更具體地講，本發(fā)明一方面開發(fā)了一種研究survivin及其突變體基因作用功能的酵母模型，同時還針對基因工程制藥與酶工程等領(lǐng)域用于外源蛋白與酶高效生產(chǎn)的酵母表達(dá)生產(chǎn)體系。
背景技術(shù)：
基因表達(dá)體系是分子生物學(xué)及生命科學(xué)研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容，也是基因工程藥物和疫苗研制等應(yīng)用領(lǐng)域所必需的重要生物反應(yīng)器。大腸桿菌(E.coli) —直被用作表達(dá)外源基因的宿主菌，并成功地表達(dá)了多種外源蛋白，但是，它不能表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)，且分泌型表達(dá)產(chǎn)量較低，而包涵體表達(dá)產(chǎn)物的完全復(fù)性尚存在諸多問題，在表達(dá)產(chǎn)物中還常伴有內(nèi)毒素成分。哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞表達(dá)體系雖然能夠表達(dá)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)，但其操作復(fù)雜，培養(yǎng)成本較高，而其表達(dá)水平通常較低，特別是在培養(yǎng)過程中多采用加血清培養(yǎng)，不但增加了成本，而且還可能帶來動物源性病源微生物污染的風(fēng)險(如瘋牛病朊粒等)， 目前我國在基因工程藥物產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中，由于昂貴的造價和技術(shù)方面的原因，無血清、大規(guī)模懸浮培養(yǎng)動物細(xì)胞，尚難于普遍使用。而獲得穩(wěn)定、高效表達(dá)生產(chǎn)外源蛋白的轉(zhuǎn)基因動、 植物，不僅操作難度較大，而且成功率又很低。由于歷史的原因及釀造工業(yè)的發(fā)展，人們對酵母的遺傳背景和生物學(xué)特性研究得較透徹，其表達(dá)的產(chǎn)物安全性易被接受。隨著生物技術(shù)的日新月異的發(fā)展，酵母作為真核生物蛋白的表達(dá)體系受到廣泛的研究和應(yīng)用，并日趨成熟。酵母是單細(xì)胞低等真核生物，它既具有原核生物的易于培養(yǎng)、繁殖快、便于基因工程操作和高密度發(fā)酵等特性，同時又具有真核生物的蛋白質(zhì)后加工能力，有適于真核生物基因產(chǎn)物正確折疊的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和糖鏈加工體系，還能分泌外源蛋白到培養(yǎng)液中，利于純化。因此，最近二十年來，酵母被認(rèn)為是一個很有前途的真核表達(dá)體系，受到廣泛的研究和應(yīng)用。釀酒酵母(S. cerevisiae)是首先被用來作為外源基因的表達(dá)宿主菌，然而， 人們在應(yīng)用中逐步發(fā)現(xiàn)S.cerevisiae表達(dá)重組蛋白具有其局限性。甲醇營養(yǎng)型酵母 (Methylotrophic Yeast)表達(dá)體系，作為第二代酵母表達(dá)體系，它克服了傳統(tǒng)釀酒酵母表達(dá)體系的諸多缺點和不足，成為國內(nèi)外廣泛而大量生產(chǎn)外源真核或者結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原核蛋白的一個較為理想的、最具有發(fā)展前途的表達(dá)體系，是實現(xiàn)基因工程疫苗、抗體、酶、激素和毒素等蛋白藥物產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的一個重要技術(shù)平臺。然而，畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在實際應(yīng)用中也存在一些缺點，其中之一是畢赤酵母發(fā)酵表達(dá)外源蛋白所用的時間長，這個過程中由于可能有甲醇的毒性和生長條件和環(huán)境的因素，使其生長活力下降，這一過程伴隨有凋亡現(xiàn)象，而不利于外源蛋白的高效表達(dá)。為了解決這一問題，需要從酵母產(chǎn)生凋亡的機制為切入點，分析酵母凋亡機制和凋亡基因，期望通過選擇酵母抗凋亡蛋白BirIp的同源物Survivin對畢赤酵母進(jìn)行分子重組與遺傳改良，實現(xiàn)降低酵母正常生長的死亡率和凋亡率來提高畢赤酵母的生長密度和速率，為開發(fā)生長活力強、生長周期短，耐凋亡的畢赤酵母奠定基礎(chǔ)，使該表達(dá)系統(tǒng)更好地應(yīng)用于外源蛋白與酶高效生產(chǎn)。人Survivin基因定位于17q25，全長約151Λ，該基因有14796個氨基酸，由四個外顯子和三個內(nèi)含子組成。Survivin有兩個主要的轉(zhuǎn)錄起始位點，位于在起始碼ATG前-72 和-57/-61處。RNA全長約1. 9Kb，其中開放讀碼框架區(qū)(ORF)含似9個堿基，可翻譯出一個142個氨基酸的蛋白。Survivn基因缺少TATAbox區(qū)，其啟動子區(qū)由一段約250個核苷酸的經(jīng)典CpG島，3個細(xì)胞周期依賴元件(cell cycle d印endent elememts, CDEs), 1個細(xì)胞周期同源區(qū)(cell cyclehomology region, CHR)和數(shù)個SPl區(qū)組成。研究發(fā)現(xiàn)正常和腫瘤組織中，Survivin啟動子區(qū)中的CpG島多處于非甲基化狀態(tài)，因此甲基化在Survivin 表達(dá)調(diào)控中并不起主要作用。當(dāng)突變掉-171及-151位的SPI序列時，Survivin的轉(zhuǎn)錄活性約下降63. 82%。⑶E，CHR區(qū)則與Survivin在G2/M期的周期性表達(dá)有關(guān)。利用含⑶E/ CHR區(qū)的Survivin promoter-luciferase重組質(zhì)粒檢測發(fā)現(xiàn)，在G2/M期啟動子活性比自然生長細(xì)胞高5-10倍，而缺少CDE/CHR區(qū)則啟動子活性不表現(xiàn)周期性變化。Survivin的表達(dá)可以抑制由多種刺激如i^as，TNF, VPI6，Taxol等誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Grossman等利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對小鼠皮膚基底層細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，Survivin的表達(dá)并不影響角化層細(xì)胞的分化及增殖，但可以抑制UVB照射引起的細(xì)胞凋亡。利用Survivin反義核苷酸阻斷Survivin的表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，使caspase活性增強并導(dǎo)致細(xì)胞自發(fā)性凋亡。 研究還發(fā)現(xiàn)Survivin的突變體如Cys84_Ala及Thr!M-Ala(SurvivinT34A)均可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自發(fā)性凋亡，目前對突變體在腫瘤治療的作用進(jìn)行研究，而且己取得較好的實驗結(jié)果。SurvivinT34A的基因序列及其制備方法參見中國專利200510(^6847.8 (授權(quán)公告號CN 100424096C)。Survivin的抗凋亡特性在生物進(jìn)化中是高度保守的，例如果蠅中的凋亡抑制因子Deterin就與Survivin高度同源。但與其它IAP家族成員相比，Survivin抗凋亡能力相對較弱。Survivin的抗凋亡機制目前尚不清楚。IAP家族成員的抗凋亡作用主要通過直接與caspase結(jié)合而使其失活。實驗表明Survivin可與caspase 9及DIABL0/SMAC結(jié)合，因此Survivin有可能通過IAP家族傳統(tǒng)的途徑抑制細(xì)胞凋亡。但Survivin是否能與 easpase-3直接結(jié)合目前尚有爭論。Siin等用E. coli表達(dá)Survivin重組蛋白，發(fā)現(xiàn)純化后的Survivin重組蛋白以同源二聚體形式存在并可與caspase-7及caspase-3直接結(jié)合。 Suzuki等則認(rèn)為Survivin并不與caspase-3直接結(jié)合，當(dāng)受到Fas刺激或細(xì)胞增殖時， Survivin可進(jìn)入胞核并與cdk4結(jié)合，促使p21釋放，p21可與procaspase-3結(jié)合，進(jìn)而抑制Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。此外與其它IAP家族成員相比，Survivn的結(jié)構(gòu)中缺乏位于B^序列上游能與caspase結(jié)合的“hook”區(qū)。因此Survivin即使能與caspase結(jié)合也必定是通過與其它IAP家族成員不同的方式進(jìn)行。所以survivn的抗凋亡作用是通過IAP家族的途徑抑或是通過其他途徑進(jìn)行還需進(jìn)一步研究來證實。Survivin不僅具有抗凋亡能力，還參與了細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)。Li等研究發(fā)現(xiàn) Survivin具有周期性表達(dá)特點，而且其在紡錘體形成中具有重要作用。利用Survivin反義核苷酸進(jìn)行研究時也發(fā)現(xiàn)，阻斷Survivin的表達(dá)不僅會引起細(xì)胞發(fā)生自發(fā)性凋亡而且還會出現(xiàn)多極紡錘體，多核及胞質(zhì)分裂失敗現(xiàn)象?；蚯贸龑嶒瀯t證實了 Survivin在有絲分裂中所起的重要作用。在胚胎期3. 5天時同源敲除Survivin基因會導(dǎo)致微管組裝缺陷，紡錘體缺失，形成多核細(xì)胞，至4. 5天時胚胎死亡。對C. elegans及酵母中的與Survivin同源的IAPs分子研究發(fā)現(xiàn)，它們在染色體分離，晚期有絲分裂及胞質(zhì)分裂等方面與Survivin 作用相類似，但無抗凋亡功能。而研究還發(fā)現(xiàn)使用針對Survivin的胞內(nèi)抗體并不影響胞質(zhì)分裂，但會影響姐妹染色體分離，微管組裝失敗，紡錘體有絲分裂失調(diào)。這表明Survivin不僅參與胞質(zhì)分裂，而且有可能作用于有絲分裂的多個方面并在微管功能中起重要作用。多細(xì)胞生物主要是通過兩個途徑發(fā)生凋亡，一是“外源性”途徑，主要由TNFa/ TNFRl，F(xiàn)aS/FaSL等介導(dǎo)，通過細(xì)胞膜的死亡受體而觸發(fā)，如腫瘤壞死因子受體(TNF- Rl) 和FAS。另一個是“內(nèi)源性”途徑，即“線粒體”途徑，通過線粒體釋放細(xì)胞色素c和Smac/ DIABLO進(jìn)行調(diào)控，由細(xì)胞內(nèi)外凋亡刺激信號發(fā)動引起線粒體滲透性增加，釋放細(xì)胞色素C 和SMAC/DIABL0。這兩個凋亡路徑通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最后觸發(fā)了細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)caspase 的激活，形成級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。這一途徑主要被Bcl-2家族的蛋白所控制，包括分別影響線粒體動態(tài)平衡和細(xì)胞色素c釋放的抗凋亡分子和前凋亡分子。而且，凋亡抑制蛋白家族(IAP)中的其他蛋白質(zhì)，包括ML-IAP，XIAP，cIAPl，cIAP2，NIAP，apollon和 Survivin,能夠通過抑制終末效應(yīng)物caspase_3和caspase_7來阻斷線粒體細(xì)胞色素c釋放過程中處于下游的一個共有步驟，干擾caspase-9的活化和后續(xù)過程的進(jìn)行。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過程。這些基因在種屬之間非常保守，如Bcl-2家族、 caspase家族、癌基因如C_myC、抑癌基因P53等，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展對多種細(xì)胞凋亡的過程有了相當(dāng)?shù)恼J(rèn)識，但是迄今為止凋亡過程確切機制尚不完全清楚。活性氧(ROS)是常用的凋亡誘導(dǎo)劑。應(yīng)用低劑量H2A處理培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞， 可誘發(fā)凋亡級聯(lián)反應(yīng)。此外去除神經(jīng)生長因子或鉀離子，可使神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生的ROS作為凋亡通路的晚期信號，激活下流的Bax和caspases。將S. Ceresiviase用低劑量H2A處理，或耗盡其谷胱甘肽以引起氧化應(yīng)激，可誘導(dǎo)凋亡。敲除酵母細(xì)胞的YCAl基因，增強細(xì)胞對H2O2的抵抗能力。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，即使在無細(xì)胞外氧化應(yīng)激存在的情況下，當(dāng)酵母細(xì)胞發(fā)生凋亡時，細(xì)胞內(nèi)ROS生成同樣增加。 表達(dá)Bax和cdcS565G的酵母突變體，用dihydrorhodaminel23染色時顯示強陽性，說明細(xì)胞內(nèi)有ROS的積聚。由于氧自由基是酵母細(xì)胞凋亡所必需的，所以ROS在酵母凋亡時起重要的作用。當(dāng)阻斷囊泡融合形成時，酵母細(xì)胞對H2O2更加敏感，更易誘導(dǎo)凋亡。因此，⑶C48突變體可能通過促進(jìn)自由基的產(chǎn)生和阻斷囊泡融合這兩種截然不同的、可相互協(xié)同的途徑啟動凋亡。而Abudugupur發(fā)現(xiàn)自噬細(xì)胞的死亡可能也與酵母凋亡有關(guān)，但可能是通過⑶C48 突變體相反的方式引起的。因為他發(fā)現(xiàn)通過誘變ADP-核糖化樣蛋白1(能引起囊泡形成障礙，破壞膜轉(zhuǎn)運)可阻斷Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而不是促進(jìn)其凋亡。研究酵母凋亡具有主要的生理學(xué)意義。ROS在調(diào)節(jié)凋亡中的重要作用可能顯示了酵母細(xì)胞自殺死亡的生理意義。ROS是需氧生物在呼吸過程中產(chǎn)生的。由于ROS能與蛋白、 脂質(zhì)、核酸發(fā)生作用，因此ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞損害很常見。細(xì)胞在進(jìn)化中，也形成了一套清除 ROS毒性損傷的機制，但這只能減輕損害的發(fā)生，不能完全阻止致死性的細(xì)胞損害。大多數(shù)受損傷的細(xì)胞即使已不再有繁殖能力，也能持續(xù)存活一段時間。如果這些細(xì)胞發(fā)生主動、快速的死亡將有助于為鄰近細(xì)胞節(jié)省代謝能量，既使是在具有相同基因的、同一菌落的單細(xì)胞生物中。因此單細(xì)胞生物的自殺死亡可能有助于其基因組的進(jìn)化。酵母細(xì)胞復(fù)制的周期是有限的，S. Cerevisiae在最適條件時的復(fù)制周期是25-35次，或大約3天，隨著復(fù)制周期的增加，細(xì)胞內(nèi)ROS積聚，細(xì)胞死亡，并可見典型的凋亡表現(xiàn)。HerKer也發(fā)現(xiàn)老化的酵母
5細(xì)胞死亡時細(xì)胞出現(xiàn)凋亡標(biāo)記、氧自由基積聚、Caspase活化等。老化誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可被 YAPl (在氧應(yīng)激時出現(xiàn)的一個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄活化因子)的表達(dá)所延滯。被YCAl (相當(dāng)于哺乳動物細(xì)胞的caspase)的表達(dá)所破壞。然而凋亡機制的紊亂可減弱再生能力，在長時間的直接競爭性的實驗中，野生型細(xì)胞比YCAl破壞細(xì)胞活的時間更長，提示凋亡通過清除不適應(yīng)細(xì)胞，對整個種群具有“清潔”效應(yīng)。有趣的是，增加肌動球蛋白動力的突變能延長酵母的生命，而降低肌動球蛋白動力增強Caspase的活性，改變線粒體功能，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。人survivin中含有一個BIR結(jié)構(gòu)域，而在酵母Birlp中含有2個BIR結(jié)構(gòu)域。 而酵母Birlp基因相對較長，克隆和表達(dá)相對survivin略有難度，survivin相對較短，研究深入。二者均對真核細(xì)胞的凋亡有密切的關(guān)系。將人survivin及其突變體構(gòu)建入酵母， 整合在其基因組上，對于研究survivin又是一個很合適的簡便的模型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種耐凋亡轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)。本發(fā)明的第二個目的是提供一種促凋亡轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)。本發(fā)明的第三個目的是提供所述轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)的構(gòu)建方法。本發(fā)明的第四個目的是提供所述轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)在研究survivin及其突變體作用與功能中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四個目的是提供所述轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)在外源蛋白與酶高效生產(chǎn)中的應(yīng)用。為實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案一種耐凋亡轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)，其特征在于，所轉(zhuǎn)基因為survivin基因，所用載體為組成型質(zhì)粒pGAPZA或者誘導(dǎo)型質(zhì)粒pPICZA。一種促凋亡轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)，其特征在于，所轉(zhuǎn)基因為survivin第34位突變體基因，所用載體為誘導(dǎo)型質(zhì)粒PPICZA或者組成型質(zhì)粒pGAPZA。轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟
(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZA-survivin、pPICZA-survivin(T;34A)、pGAPZA_survivin 或者 pGAPZA-survivin(T34A)，分別對原始質(zhì)粒 pREST-survivin (T34A)和 pGEM-T-survivin 進(jìn)行雙酶切處理，所用內(nèi)切酶為EcoRI和BioI，然后利用TAKARA公司生產(chǎn)的"Γ4 DNA Ligase 試劑盒將基因片段和載體片段進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒，所述載體為誘導(dǎo)型質(zhì)粒PPICZA或者組成型質(zhì)粒PGAPZA ；
(2)將步驟(1)獲得的重組質(zhì)粒分別利用電穿孔方式轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母，經(jīng)過同源重組整合到畢赤酵母基因組中，獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)。所述轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)在研究survivin及其突變體作用與功能中的應(yīng)用。所述轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)在外源蛋白與酶高效生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因酵母具有與原來不同的生長特性與用途，這既顯示了 survivin及其突變體在酵母中的作用，可以此作為研究其作用與功能的一個模型，同時又獲得了可以通過對畢赤酵母的分子重組與遺傳改良，實現(xiàn)降低酵母正常生長的死亡率和凋亡率來提高畢赤酵母的生長密度和速率，從而開發(fā)出具有生長活力強、生長周期短、耐凋亡的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，使其更好地應(yīng)用于外源蛋白與酶高效生產(chǎn)。


圖1為pPICZA-surViVin(T34A)質(zhì)粒的構(gòu)建流程示意圖。圖 2 為 pPICZA-survivin(T34A)質(zhì)粒的菌落 PCR 鑒定圖，其中 1 :2000bp 的 marker ； 2 :PCR 產(chǎn)物。圖 3 為 pPICZA_survivin(T34A)質(zhì)粒的 XhoI 和 EcoRI 雙酶切鑒定圖。圖4為pPICZA-survivin質(zhì)粒的構(gòu)建流程示意圖。圖5為pPICZA-survivin質(zhì)粒的菌落PCR鑒定圖。圖6為pPICZA-survivin質(zhì)粒的XhoI和EcoRI雙酶切鑒定圖。圖7為pGAPZA-survivin (T34A)質(zhì)粒的構(gòu)建流程示意圖。圖 8 為 pGAPZA-survivin (ΤΙΜΑ)質(zhì)粒的酶切示意圖，其中，1 :pGAPZA 用 EcoRI 和 XhoI 雙酶切圖；2 :pREST-survivin(T34A)用 EcoRI 和 XhoI 雙酶切圖；3:2000 的 marker 圖 9 為pGAPZA-survivin (ΤΙΜΑ)質(zhì)粒的菌落 PCR 鑒定圖，其中，1 :2000 的 marker; 2、3、4、5 :PCR鑒定產(chǎn)物。圖10為pGAPZA-survivin(T34A)質(zhì)粒的XhoI和EcoRI雙酶切鑒定圖，其中，1:用 EcoRI 和 XhoI 的雙酶切圖；2: 2000 的 marker 圖11為pGAPZA-survivin質(zhì)粒的構(gòu)建流程示意圖。圖12為pGAPZA-survivin質(zhì)粒的酶切示意圖，其中，l:pGAPZA用EcoRI和XhoI的雙酶切圖；2 :pGEM-T-survivin 用 EcoRI 和 XhoI 的雙酶切圖；3 :2000bp 的 marker。圖13為pGAPZA-survivin質(zhì)粒的菌落PCR鑒定圖，其中，1、2、3、4 :PCR產(chǎn)生的片段；5 :2000bp 的 marker。圖14為pGAPZA-survivin質(zhì)粒的XhoI和EcoRI雙酶切鑒定圖，其中，1:連接產(chǎn)物用 EcoRI 和 XhoI 雙酶切圖；2 :2000bp 的 marker 圖15為誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因酵母PCR鑒定圖。圖16為誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因酵母生長曲線圖。圖17為MTT法測定誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因酵母凋亡抑制率，其中，正值為抑制率，而負(fù)值為促生長率。圖18為誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)基因酵母流式細(xì)胞儀雙參數(shù)點圖。圖19為組成型轉(zhuǎn)基因酵母PCR鑒定圖。圖20為組成型轉(zhuǎn)基因酵母生長曲線圖。圖21為MTT法測定組成型轉(zhuǎn)基因酵母凋亡抑制率，其中，正值為抑制率，而負(fù)值為促生長率。圖22為組成型轉(zhuǎn)基因酵母流式細(xì)胞儀雙參數(shù)點圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做詳細(xì)說明，實施例的作用僅是解釋而非限定本發(fā)明。實施例一誘導(dǎo)型重組質(zhì)粒pPICZA-survivin、pPICZA-survivin (T34A)的構(gòu)建。為了證實survivin基因的一些性質(zhì)與功能，驗證survivin對酵母細(xì)胞的凋亡的影響，將該基因和該基因的突變體通過雙酶切以及連接反應(yīng)克隆至誘導(dǎo)型表達(dá)載體PPICZA 中，獲得重組質(zhì)粒pPICZA-survivin和pPICZA-survivin (T34A)。其中兩個載體分別攜帶目的基因survivin和其34位點的突變形式survivin (T34A)。重組質(zhì)粒pPICZA-survivin、pPICZA-survivin (T34A)的構(gòu)建采用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BioI，分別對本實驗室保存的原始質(zhì)粒pREST-survivin (T34A)和 pGEM-T-survivin進(jìn)行雙酶切處理，然后利用TAKARA公司生產(chǎn)的T4 DNA Ligase試劑盒將基因片段和載體片段進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒。原始質(zhì)粒pREST-survivin (T34A)和pGEM-T-survivin的制備參見中國專利 200510026847. 8 (授權(quán)公告號CN 100424096C)。pPICZA-survivin(T34A)質(zhì)粒的構(gòu)建流程示意圖見圖1。利用XhoI和XhoI雙酶切pREST-survivin (T34A)，回收目標(biāo)片段，用同樣酶切的載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia后，涂板于帶有kocin的LLB平板上篩選陽性菌落，然后挑取陽性單菌落于5mlLLB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行菌落PCR鑒定和B10I和 EcoRI雙酶切鑒定。菌落PCR鑒定選取陽性克隆于5ml LLB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，第二天菌液在100° C煮3-5min，然后進(jìn)行PCR鑒定，然后通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，鑒定結(jié)果如圖 2所示，由圖2可知，PCR結(jié)果與目的片段大小基本一致，表明構(gòu)建質(zhì)粒中已經(jīng)存在目的片段。雙酶切鑒定，將PCR鑒定后的陽性克隆的菌液，提取質(zhì)粒，然后進(jìn)行雙酶切，然后通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，雙酶切鑒定結(jié)果的目的片段的大小與預(yù)期一致，這已經(jīng)基本確定質(zhì)粒構(gòu)建成功。pPICZA-survivin質(zhì)粒的構(gòu)建流程示意圖見圖4。利用BioI和BioI雙酶切pGEM-T-survivin，回收目標(biāo)片段，用同樣酶切的載體 PPICZA連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia后，涂板于帶有kocin的LLB平板上篩選陽性菌落，然后挑取陽性單菌落于5mlLLB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行菌落PCR鑒定和B10I和 EcoRI雙酶切鑒定。在雙酶切過程中，由于pGEM-T載體有兩個BioI酶切位點，那么會產(chǎn)生 EcoRI-XhoI (1) ,EcoRI-XhoI (2)和XhoI-XhoI (3)三個片段，在此采用尋找目的片段，連接后通過測序比對完全確定目的片段是否完全連接上。菌落PCR鑒定，選取陽性克隆于5ml LLB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，第二天菌液在100° C 煮3-5min，進(jìn)行PCR鑒定，然后通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，鑒定結(jié)果如圖5所示。由圖5 可知，PCR結(jié)果與目的片段大小基本一致，表明構(gòu)建質(zhì)粒中已經(jīng)存在目的片段。雙酶切鑒定，將PCR鑒定后的陽性克隆的菌液，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切，然后通過 1%的瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果如圖6可知，雙酶切鑒定結(jié)果的目的片段的大小與預(yù)期一致， 這已經(jīng)基本確定質(zhì)粒構(gòu)建成功。測序結(jié)果比對，將上述挑取培養(yǎng)的2個陽性克隆送樣至公司測序。得測序結(jié)果，利用信息學(xué)比對軟件，進(jìn)行比對，序列完全一致。實施例二組成型重組質(zhì)粒pGAPZA-survivin 和 pGAPZA-survivin(T;34A)的構(gòu)建。為了驗證survivin對酵母細(xì)胞的凋亡的影響，將該基因和其突變體通過雙酶切以及連接反應(yīng)克隆至組成型表達(dá)載體PGAPZA中，獲得重組質(zhì)粒pGAPZA-survivin和 pGAPZA-survivin (T34A)。其中兩個載體分別攜帶目的基因survivin和其34位點的突變形式 survivin (T34A)。重組質(zhì)粒 pGAPZA-survivin、pGAPZA-survivin (TiMA)的構(gòu)建采用限制性內(nèi)切酶EcoRI和)(hoI，分別對本實驗室保存的原始質(zhì)粒pREST-SurViVin(T34A)和 pGEM-T-survivin進(jìn)行雙酶切處理，然后利用TAKARA公司生產(chǎn)的T4 DNA Ligase試劑盒將基因片段和載體片段進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒。pGAPZA-SUrvivin(T34A)質(zhì)粒的構(gòu)建流程示意圖見圖7。利用BioI和BioI雙酶切pREST-survivin (T34A)，回收目標(biāo)片段，用同樣酶切的載體pGAPZA進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia后，涂板于帶有kocin的LLB平板上篩選陽性菌落，然后挑取陽性單菌落于5ml LLB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行菌落PCR鑒定和 XhoI和EcoRI雙酶切鑒定。酶切示意圖如圖8所示。菌落PCR鑒定，選取陽性克隆于5ml LLB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，第二天菌液在100°C 煮3-5min，進(jìn)行PCR鑒定，然后通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，鑒定結(jié)果如圖9所示。由圖9 可知，PCR結(jié)果與目的片段大小基本一致，表明構(gòu)建質(zhì)粒中已經(jīng)存在目的片段。雙酶切鑒定，將PCR鑒定后的陽性克隆的菌液，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定體系進(jìn)行雙酶切，然后通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果如圖10可知，雙酶切鑒定結(jié)果的目的片段的大小與預(yù)期一致，這已確定質(zhì)粒構(gòu)建成功。pGAPZA-survivin質(zhì)粒的構(gòu)建流程示意圖見圖11。利用BioI和BioI雙酶切 pGEM-T-survivin,回收目標(biāo)片段，用同樣酶切的載體pGAPZA連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia后， 涂板于帶有kocin的LLB平板上篩選陽性菌落，然后挑取陽性單菌落于5mlLLB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行菌落PCR鑒定(圖)和BioI和EcoRI雙酶切鑒定。在雙酶切過程中，由于pGEM-T載體有兩個)(ho I酶切位點，那么會產(chǎn)生EcoRI-XhoI (1)、EcoRI-Xho I (2)和 XhoI-XhoI (3)三個片段，在此采用尋找目的片段，連接后通過測序比對完全確定目的片段是否完全連接上。酶切示意圖如圖12所示。菌落PCR鑒定，選取陽性克隆于5ml LLB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，第二天菌液在100° C 煮3-5min，進(jìn)行PCR鑒定，然后通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，鑒定結(jié)果如圖13所示。由圖 13可知，PCR結(jié)果與目的片段大小基本一致，表明構(gòu)建質(zhì)粒中已經(jīng)存在目的片段。雙酶切鑒定，將PCR鑒定后的陽性克隆的菌液，提取質(zhì)粒，然后進(jìn)行雙酶切鑒定， 然后通過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果如圖14所示。由圖14可知，雙酶切鑒定結(jié)果的目的片段的大小與預(yù)期一致，這已經(jīng)初步部確定質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)過測序比對，將上述挑取培養(yǎng)的陽性克隆送樣至公司測序。得測序結(jié)果，利用信息學(xué)比對軟件，進(jìn)行比對，序列完全一致。實施例三誘導(dǎo)型survivin與survivin (T34A)轉(zhuǎn)基因酵母及其特性。采用試劑將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母，采用篩選培養(yǎng)基YPD中的^ocin抗性濃度的使用進(jìn)行篩選。按照操作步驟將涂布的平板置于30° C條件下培養(yǎng)4-5天，挑取長出的陽性克隆。kocin的濃度開始使用100微克/毫升，后來經(jīng)幾次的濃度的梯度篩選，按照25微克 /毫升進(jìn)行篩選將取得最佳效果?？剐詽舛忍哌m合篩選高通量的克隆，抗性濃度太低菌落會因為太多實驗無法繼續(xù)進(jìn)行。酵母基因組的提取及PCR鑒定。因為酵母具有較厚的細(xì)胞壁，一般處理細(xì)菌的破壁方法，無法將酵母基因組釋放出，而試劑盒成本較高，此步驟作為一個驗證過程，需要簡化步驟又要切實可行。經(jīng)參考文獻(xiàn)，總結(jié)出一套粗提取酵母基因組，用于PCR鑒定的模板。 首先離心取得適量菌體，加入PBS，煮沸10分鐘，離心，取得上清，然后加入PBS相同體積的
9異丙醇，放置2-3分鐘，12000rpm離心2分鐘，倒掉上清，空氣中放置5分鐘，至殘留異丙醇完全揮發(fā)，加入20微升TE buffer備用。按照上述PCR鑒定體系，進(jìn)行PCR。得到結(jié)果圖如圖15所示，將PCR產(chǎn)物回收，送至公司測序，然后通過生物信息學(xué)比對軟件進(jìn)行比對，序
列完全一致。將轉(zhuǎn)化好的重組酵母按照，條件進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置對照組，對照組為未進(jìn)行任何突變或者轉(zhuǎn)化的野生型畢赤酵母X33。按照常規(guī)方法進(jìn)行取樣，使用紫外-可見分光光度計測定600 nm處的吸收值。標(biāo)準(zhǔn)生長曲線以600 nm處的吸收值為縱坐標(biāo)(y)，時間為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖16所示。注意，該標(biāo)準(zhǔn)曲線測定測定過程中，可見分光光度計最高測量值為3. 000，當(dāng)OD值超過3. 000時，需要使用原始的培養(yǎng)基進(jìn)行10X，20X，30X的稀釋，最后OD值需乘以相應(yīng)倍數(shù)進(jìn)行計算。按照MTT法的步驟測定酵母細(xì)胞的死活比率，計算在選定時間M小時、48小時、72 小時的抑制率。測定酵母凋亡抑制率過程中，注意OD的稀釋問題，測定前需將酵母細(xì)胞濃度稀釋至OD值為1，測定490nm時的結(jié)果。圖17為MTT法測定酵母凋亡抑制率結(jié)果。在菌體培養(yǎng)過程中，菌液通過用培養(yǎng)基稀釋至OD值為1，然后用MTT法測樣，利用計算抑制率的公式抑制率=(突變組-對照組)/對照組，在M小時，48小時，72小時，突變組的抑制率分別為8. 815%、12. 948%、16. 859%。而未突變組的負(fù)抑制率，即促生長率為5. 466%,7. 289%、 11. 395%。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果，將構(gòu)建的畢赤酵母菌按照誘導(dǎo)條件培養(yǎng)，在90小時的時候取樣，按照Armexin V vs PI的雙染色法進(jìn)行染色，然后用流式細(xì)胞儀上樣，結(jié)果如圖18所
7J\ ο由圖18可以看出，001為對照組，004和005分別為含有基因survivin和 survivin (T34A)的酵母，圖004中的死亡細(xì)胞的象限和凋亡細(xì)胞的象限的點均比對照組要少，而005中死亡細(xì)胞的象限區(qū)域明顯比對照組要多出很多點。由此可以看出，含有基因 survivin (T34A)的酵母明顯發(fā)生的促凋亡現(xiàn)象，導(dǎo)致在相同條件和情況下，酵母細(xì)胞死亡數(shù)相對較多，而含有基因survivin的酵母也能看出其死細(xì)胞的數(shù)目略有減少的現(xiàn)象，即證明其促生長作用。將酵母的抗凋亡蛋白Birlp的同源類似物Survivin和其突變體Survivin (T34A) 構(gòu)建至原核生物和真核生物穿梭質(zhì)粒PPICZA中，并將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中， 使其同源重組，將基因片段整合到畢赤酵母X33的基因組上。畢赤酵母會以誘導(dǎo)形式的表達(dá)Survivin蛋白和Survivin(T34A)蛋白。按照培養(yǎng)畢赤酵母的最佳條件0. 5%的甲醇誘導(dǎo)，28° C進(jìn)行培養(yǎng)，并測定其生長曲線，含有促生長的survivin基因的重組畢赤酵母X33 的生長率和最終穩(wěn)定期菌液OD值均比含有具有促細(xì)胞凋亡的survivin(T34A)基因的重組畢赤酵母X33的OD值要高，而對照組的檢測值處于二者之間。在M小時、48小時、72小時取樣利用MTT法測定酵母凋亡的抑制率，突變組的抑制率分別為8. 815%、12. 948%、16. 859%。 而未突變組的負(fù)抑制率，即促生長率為5. 466%、7. 289%U1. 395%。實施例四組成型survivin與survivin(T34A)轉(zhuǎn)基因酵母及其特性。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母及鑒定。酵母的轉(zhuǎn)化采用的杰美公司的小量酵母轉(zhuǎn)化試劑盒， 進(jìn)行酵母轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，在最后篩選培養(yǎng)基YPD中的^ocin抗性濃度的使用進(jìn)行選擇。按照操作步驟將涂布的平板置于30°C條件下培養(yǎng)4-5天，挑取長出的陽性克隆。kocin的濃度開始使用100微克/毫升，后來經(jīng)幾次的濃度的梯度篩選，按照25微克/毫升進(jìn)行篩選將取得最佳效果。抗性濃度太高適合篩選高通量的克隆，抗性濃度太低菌落會因為太多實驗無法繼續(xù)進(jìn)行。酵母基因組的提取及PCR鑒定。提取酵母基因組，用于PCR鑒定的模板。首先離心取得適量菌體，加入PBS，煮沸10分鐘，離心，取得上清，然后加入PBS相同體積的異丙醇， 放置2-3分鐘，12000rpm離心2分鐘，倒掉上清，空氣中放置5分鐘，至殘留異丙醇完全揮發(fā)，加入20微升TE buffer，備用。按照上述提及的PCR鑒定體系，進(jìn)行PCR。得到結(jié)果如圖19所示。將PCR產(chǎn)物回收，送至公司測序，然后通過生物信息學(xué)比對軟件進(jìn)行比對，序列完全一致。將轉(zhuǎn)化好的重組酵母按照，條件進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置對照組，對照組為未進(jìn)行任何突變或者轉(zhuǎn)化的野生型畢赤酵母X33。按照常規(guī)方法進(jìn)行取樣，使用紫外-可見分光光度計測定600 nm處的吸收值。標(biāo)準(zhǔn)生長曲線以600 nm處的吸收值為縱坐標(biāo)(y)，時間為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖20。注意，該標(biāo)準(zhǔn)曲線測定測定過程中，可見分光光度計最高測量值為3. 000，當(dāng)OD值超過3. 000時，需要使用原始的培養(yǎng)基進(jìn)行10X，20X，30X的稀釋，最后OD值需乘以相應(yīng)倍數(shù)進(jìn)行計算。菌液生長過程中，按照時間M小時、48小時、72小時取樣進(jìn)行測定。在菌體培養(yǎng)過程中，菌液通過用培養(yǎng)基稀釋至OD值為1，然后用MTT法測樣，利用計算抑制率的公式，在 24小時，48小時，72小時，突變組的抑制率分別為5. 577%、10. 401%、14. 239%。而未突變組的負(fù)抑制率，即促生長率為4. 615%,6. 721%,9. 255%，圖21為MTT法測定酵母凋亡抑制率結(jié)果。將構(gòu)建的畢赤酵母菌按照誘導(dǎo)條件培養(yǎng)，在90小時的時候取樣，按照Armexin V vs PI的雙染色法進(jìn)行染色，然后用流式細(xì)胞儀上樣，得到的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果如圖22所示。由圖22可以看出，001為對照組，002和003分別為含有基因survivin和 survivin (34)的酵母，圖002中的死亡細(xì)胞的象限和凋亡細(xì)胞的象限的點均比對照組要少，而003中死亡細(xì)胞的象限區(qū)域明顯比對照組要多出很多點。由此可以看出，含有基因 survivin (T34A)的酵母明顯發(fā)生的促凋亡現(xiàn)象，導(dǎo)致在相同條件和情況下，酵母細(xì)胞死亡數(shù)相對較多，而含有基因survivin的酵母也能看出其死細(xì)胞的數(shù)目略有減少的現(xiàn)象，即證明其促生長作用。將酵母的抗凋亡蛋白Birlp同源類似物Survivin和其突變體Survivin (T34A) 構(gòu)建至原核生物和真核生物穿梭質(zhì)粒PGAPZA中，并將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母中， 使其同源重組，將基因片段整合到畢赤酵母X33的基因組上。畢赤酵母會組成型的表達(dá) Survivin蛋白和Survivin(T34A)蛋白。按照培養(yǎng)畢赤酵母的最佳條件進(jìn)行培養(yǎng)，并測定其生長曲線，含有促生長的survivin基因的重組畢赤酵母X33的生長率和最終穩(wěn)定期菌液 OD值均比含有具有促細(xì)胞凋亡的survivin (T34A)基因的重組畢赤酵母X33的OD值要高， 而對照組的檢測值處于二者之間。在M小時、48小時、72小時取樣利用MTT法測定酵母凋亡的抑制率，突變組的抑制率分別為5. 577%、10. 401%、14. 239%。而未突變組的負(fù)抑制率， 即促生長率為 4. 615%,6. 721%,9. 255%。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果證明兩種重組畢赤酵母在生長率、死亡率和抑制率具有明顯的差異。實施例三中的誘導(dǎo)型表達(dá)的結(jié)果與實施例四中組成型表達(dá)的結(jié)果相比較，誘導(dǎo)型的結(jié)果顯示比組成型的結(jié)果要明顯，相同時間和條件下的培養(yǎng)菌液OD值誘導(dǎo)型的較高，抑制率和促生長率誘導(dǎo)型的較高。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種耐凋亡轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)，其特征在于，所轉(zhuǎn)基因為survivin基因，所用載體為組成型質(zhì)粒PGAPZA或者誘導(dǎo)型質(zhì)粒pPICZA。
2.一種促凋亡轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)，其特征在于，所轉(zhuǎn)基因為survivin第34位突變體基因，所用載體為誘導(dǎo)型質(zhì)粒PPICZA或者組成型質(zhì)粒pGAPZA。
3.權(quán)利要求1或2所述轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟(1)構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZA-survivin、pPICZA-survivin(T34A)、pGAPZA_survivin 或者 pGAPZA-survivin(T34A)，分別對原始質(zhì)粒 pREST-survivin (T34A)和 pGEM-T-survivin 進(jìn)行雙酶切處理，所用內(nèi)切酶為EcoRI和BioI，然后利用TAKARA公司生產(chǎn)的T4 DNA Ligase 試劑盒將基因片段和載體片段進(jìn)行連接，獲得重組質(zhì)粒，所述載體為誘導(dǎo)型質(zhì)粒PPICZA或者組成型質(zhì)粒PGAPZA ；(2)將步驟(1)獲得的重組質(zhì)粒分別利用電穿孔方式轉(zhuǎn)化進(jìn)入畢赤酵母，經(jīng)過同源重組整合到畢赤酵母基因組中，獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)。
4.權(quán)利要求1或2所述轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)在研究survivin及其突變體作用與功能中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)在外源蛋白與酶高效生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種耐凋亡或促凋亡轉(zhuǎn)基因酵母系統(tǒng)，所轉(zhuǎn)基因為survivin基因或survivin第34位突變體，所用載體為組成型質(zhì)粒pGAPZA或者誘導(dǎo)型質(zhì)粒pPICZA。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因酵母具有與原來不同的生長特性與用途，這既顯示了survivin及其突變體在酵母中的作用，可以此作為研究其作用與功能的一個模型，同時又獲得了可以通過對畢赤酵母的分子重組與遺傳改良，實現(xiàn)降低酵母正常生長的死亡率和凋亡率來提高畢赤酵母的生長密度和速率，從而開發(fā)出具有生長活力強、生長周期短、耐凋亡的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，使其更好地應(yīng)用于外源蛋白與酶高效生產(chǎn)。
文檔編號C12P21/00GK102367422SQ201110008959
公開日2012年3月7日 申請日期2011年1月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月17日
發(fā)明者劉琨, 姚碧, 李林鳳, 鄭文云, 馬興元 申請人:華東理工大學(xué)