在馬克斯克魯維酵母營養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)融合了組氨酸標(biāo)簽的外源基因的重組載體的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于外源基因表達(dá)的重組載體，尤其涉及一種含有多聚組氨酸標(biāo) 簽的用于在克魯維酵母營養(yǎng)缺陷型菌株中進(jìn)行外源基因分泌表達(dá)的重組載體。
【背景技術(shù)】
[0002] 酵母是單細(xì)胞的真核生物，它兼具微生物的特性和真核生物的蛋白合成加工系 統(tǒng)。因此，它被廣泛的用于表達(dá)多種外源真核蛋白。目前主流的酵母表達(dá)系統(tǒng)包括畢赤酵 母和釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。但是，畢赤酵母的蛋白表達(dá)需要用甲醇誘導(dǎo)，不適合用于食用蛋白 的生產(chǎn)。釀酒酵母易產(chǎn)乙醇，生長密度低，表達(dá)水平偏低。針對(duì)這一系列問題，發(fā)展新型的 安全性高和產(chǎn)量高的酵母表達(dá)系統(tǒng)具有很高的工業(yè)價(jià)值。
[0003] 馬克思克魯維酵母（Kluyveromycesmarxianus)已經(jīng)通過了美國和歐洲的GRAS 和QPS安全認(rèn)證，其自身不僅被認(rèn)為是安全的微生物菌株，同時(shí)也被認(rèn)為是可用于制備食 品級(jí)重組蛋白（酶）的安全微生物菌株，是一種被歐盟認(rèn)可的食品級(jí)的酵母。它具有營養(yǎng) 要求極其簡單、生長旺盛、生物量大、生長溫度適應(yīng)范圍廣等特點(diǎn)。同時(shí)，它還具有高效分泌 蛋白的特點(diǎn)。因此，馬克思克魯維酵母具有高效表達(dá)食用和飼用蛋白的巨大潛力。
[0004] 表達(dá)系統(tǒng)由宿主菌和表達(dá)載體構(gòu)成。對(duì)于食品安全級(jí)別的酵母表達(dá)系統(tǒng)，宿主菌 通常選用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種在營養(yǎng)缺陷型菌株中表達(dá)融合了組氨酸標(biāo)簽的外源基因的重 組載體。
[0006] 本發(fā)明第一個(gè)方面是提供一種含組氨酸標(biāo)簽（HisTag)的重組載體，按照順序包 括氨芐抗性基因、PKD1載體序列、菊粉酶啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、菊粉酶終止子、營養(yǎng)基因啟動(dòng) 子、營養(yǎng)基因開放閱讀框（0RF)。
[0007] 其中，所述組氨酸標(biāo)簽的重組載體還包括多聚組氨酸標(biāo)簽，所述多聚組氨酸標(biāo)簽 位于多克隆位點(diǎn)的C端或N端。
[0008] 其中，所述多聚組氨酸標(biāo)簽優(yōu)選四聚或以上組氨酸標(biāo)簽，更優(yōu)選為五聚或以上組 氨酸標(biāo)簽，更優(yōu)選為六聚或以上組氨酸標(biāo)。
[0009] 其中，所述營養(yǎng)基因優(yōu)選為馬克斯克魯維菌株的營養(yǎng)基因，如URA3基因、HIS3基 因、ADE2基因中的任意一種或幾種，更優(yōu)選為URA3基因。
[0010] 其中，所述多克隆位點(diǎn)可以是包括一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)限制性酶切位點(diǎn)的序列，所述 限制性酶切位點(diǎn)如SmaI、XmaI、SpeI、NotI中的任意一種或幾種，更優(yōu)選為SpeI、NotI、以及 Smal和/或Xmal中的任意一種或幾種，如Smal/Xmal、Spel、Notl。
[0011] 其中，所述多克隆位點(diǎn)長度優(yōu)選為15-25bp，更優(yōu)選為18-23bp，更優(yōu)選為 19-21bp〇
[0012] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述重組載體的DNA序列如SEQ ID No. 1所示。
[0013] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述重組載體的DNA序列如SEQ ID No. 2所示。
[0014] 本發(fā)明第二個(gè)方面是提供一種構(gòu)建上述重組載體的方法包括：
[0015] 擴(kuò)增pUC19質(zhì)粒、PKD1載體，獲得pUC19與PKD1連接的片段I ;
[0016] 擴(kuò)增馬克思克魯維酵母基因組，獲得包含營養(yǎng)基因啟動(dòng)子或0RF的片段II ;
[0017] 擴(kuò)增馬克思克魯維酵母基因組，獲得包含菊粉酶基因啟動(dòng)子、菊粉酶信號(hào)肽、和部 分多克隆位點(diǎn)的片段III;
[0018] 擴(kuò)增馬克思克魯維酵母基因組，獲得包含菊粉酶終止子和部分多克隆位點(diǎn)的片段 IV，
[0019] 將片段I、II、III、IV進(jìn)行連接，獲得第一重組載體。
[0020] 采用定點(diǎn)突變試劑盒對(duì)第一重組載體進(jìn)行突變，得到權(quán)利要求1所述含組氨酸標(biāo) 簽的重組載體。
[0021] 其中，擴(kuò)增pUC19質(zhì)粒的引物優(yōu)選為：
[0022] 正向引物：
[0023] 5'-GAGGGGTACCGAGCTCGAATTAGCTCGAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCT-3'；
[0024] 反向引物：
[0025] 5'-TACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCT-3'。
[0026] 其中，擴(kuò)增PKD1質(zhì)粒的引物優(yōu)選為：
[0027] 正向引物：
[0028] 5'-CCAAGCTTGCATGCATCACTAATGAAAAGCATACGACGCC-3'；
[0029] 反向引物：
[0030] 5'-AATTCGAGCTCGGTACCCCTCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3'。
[0031] 其中，在一種優(yōu)選實(shí)施例中，獲得pUC19與PKD1連接的片段I方法如下：擴(kuò)增 PUC19質(zhì)粒得到A片段，擴(kuò)增Gateway系統(tǒng)載體的pcYGW獲得B片段，擴(kuò)增PKD1載體獲得 C片段，將A、B和C片段連接，將連接得到的質(zhì)粒進(jìn)行擴(kuò)增，得到包括pUC19與PKD1的片段 1〇
[0032] 其中，擴(kuò)增pcYGW所用引物優(yōu)選為：
[0033]正向引物：5'-GAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTG-3'；
[0034]反向引物：5' -GCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCG-3'。
[0035] 其中，擴(kuò)增質(zhì)粒的引物優(yōu)選為：
[0036]正向引物：5'-GATCCGCTTAAGAGGGGTACCGAGCTCGAATT-3'；
[0037] 反向引物：
[0038] 5'-ACCTTTTCGGATCGGCATGCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3'。
[0039] 其中，擴(kuò)增獲得片段II的引物優(yōu)選為：
[0040]正向引物：5, -CTAGGATCGGTCGAATTCTGATTGGAAAGACCATT-3，；
[0041]反向引物：5' -GTACCCCTCTTAAGCGGATCTGCCTACTCTCTTCA-3'。
[0042] 其中，擴(kuò)增獲得片段III的引物優(yōu)選為：
[0043]正向引物：5'-GCATGCCGATCCGAAAAGGTAAACAGACAC AAAAAC-3'；
[0044] 反向引物：
[0045] 5'-GTCCCGGGGTCACCGTCTCTCTTGTAATTGATCACTGAAG-3'。
[0046] 其中，擴(kuò)增獲得片段IV的引物優(yōu)選為：
[0047] 正向引物：
[0048] 5'-ACGGTGACCCCGGGACTAGTGCGGCCGCTTAAGGCCGCAAGCTTTGATCTG-3'；
[0049]反向引物：5' -CAGAATTCGACCGATCCTAGAATGTTGGTCAGATGTG-3'。
[0050] 其中，所述定向突變試劑盒優(yōu)選為QuikChangeII試劑盒。
[0051] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述突變所用引物優(yōu)選為：
[0052] 5 ' -ATAAGTGACACATTTAATTTTTTTTTTGTTAGATATGCACCATCATCACCACCATACTAGTCCCGG GGCGGCCGCTTAAGGCCGCAAG-3'；
[0053] 5 ' -CTTGCGGCCTTAAGCGGCCGCCCCGGGACTAGTATGGTGGTGATGATGGTGCATATCTAACAAAAA AAAAATTAAATGTGTCACTTAT-3'。
[0054] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施例中，所述突變所用引物優(yōu)選為：
[0055] 5 ' -ATAAGTGACACATTTAATTTTTTTTTTGTTAGATACTAGTCCCGGGGCGGCCGCTCACCATCATCA CCACCATTAAGGCCGCAAGCTTTGATCTGATCTGCTTACTTTAC-3 '；
[0056] 5 ' -GTAAAGTAAGCAGATCAGATCAAAGCTTGCGGCCTTAATGGTGGTGATATGGTGAGCGGCCGCCCC GGGACTAGTATCTAACAAAAAAAAAATTAAATGTGTCACTTAT-3 '〇
[0057] 本發(fā)明第三個(gè)方面是提供一種轉(zhuǎn)化子，將外源基因插入到所述重組載體的多克隆 位點(diǎn)中，獲得含有外源基因的質(zhì)粒，將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入營養(yǎng)基因缺陷型菌株中，獲得所述轉(zhuǎn)化 子。
[0058] 其中，所述營養(yǎng)基因缺陷型菌株優(yōu)選為營養(yǎng)基因缺陷型馬克斯克魯維菌株。
[0059] 所述營養(yǎng)基因缺陷優(yōu)選為包括URA3基因、HI S3基因、ADE2基因缺陷中的任意一種 或幾種，更優(yōu)選為URA3基因缺陷。
[0060] 本發(fā)明構(gòu)建的含有HisTag的的外源基因表達(dá)載體、及其制備方法，可用于構(gòu)建轉(zhuǎn) 化子，來實(shí)現(xiàn)融合HisTag的外源基因的表達(dá)。
【附圖說明】
[0061] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中所構(gòu)建重組載體原理圖；
[0062] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2所構(gòu)建重組載體原理圖。
【具體實(shí)施方式】
[0063] 實(shí)施例1,重組載體PUKD114的構(gòu)律
[0064] 步驟1，擴(kuò)增pUC19質(zhì)粒
[0065] 正向引物：
[0066] 5'-GAGGGGTACCGAGCTCGAATTAGCTCGAATTCGTAATCATGTCATAGCTGTTTCCT-3'
[0067]反向引物：5' -TACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCT-3'
[0068] 利用所述引物擴(kuò)增pUC19質(zhì)粒。PCR擴(kuò)增反應(yīng)按照Vazyme公司的PhantaSuper FidelityDNAPolymerase的使用說明書進(jìn)行，退火溫度為58°C，延伸時(shí)間為3分鐘，30個(gè) 循環(huán)。PCR產(chǎn)物命名為A片段。
[0069] 步驟2,擴(kuò)增Gateway系統(tǒng)載體的pcYGW
[0070]正向引物：5,-GAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTG-3，
[0071]反向引物：5, -GCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCG-3'
[0072] 利用所述引物擴(kuò)增Gateway系統(tǒng)載體的pcYGW。PCR擴(kuò)增條件同步驟1，除了延伸 時(shí)間為1分鐘。PCR產(chǎn)物命名為B片段。
[0073]步驟3，擴(kuò)增PKD1載體
[0074]正向引物：5' -CCAAGCTTGCATGCATCACTAATGAAAAGCATACGACGCC-3'
[0075] 反向引物：
[0076] 5'-AATTCGAGCTCGGTACCCCTCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3'
[0077] 利用所述引物擴(kuò)增PKD1載體。PCR擴(kuò)增條件同步驟1，除了延伸時(shí)間為5分鐘。 PCR產(chǎn)物命名為C片段。
[0078] 步驟4,連接片段A、B、C
[0079] 按照NEB公司GibsonAssemblyMasterMix的使用說明書操作，將片段A、B、C連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得的質(zhì)粒命名為HJC19-PKD1。
[0080] 步驟5,擴(kuò)增PUC19-PKD1質(zhì)粒
[0081] 正向引物：5'-GATCCGCTTAAGAGGGGTACCGAGCTCGAATT-3'
[0082] 反向引物：
[0083] 5'-ACCTTTTCGGATCGGCATGCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3'
[0084] 利用所述引物擴(kuò)增HJC19-PKD1質(zhì)粒。PCR擴(kuò)增條件同步驟1，除了延伸時(shí)間為8 分鐘。PCR產(chǎn)物命名為D片段。D片段中包括了部分PUC19序列和PKD1序列。
[0085] 步驟6，擴(kuò)增URA3基因啟動(dòng)子和0RF片段
[0086]正向引物：5' -CTAGGATCGGTCGAATTCTGATTGGAAAGACCATT-3'